一種基于熒光定量PCR鑒定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及鑒定方法與流程

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及鑒定方法。

背景技術(shù)：

自1992年首次從小鼠中分離得到小家鼠類螺桿菌后，到目前為止已分離到至少13種嚙齒類動(dòng)物螺桿菌，其中膽汁螺桿菌(helicobacterbilis)、肝螺桿菌(helicobacterhepaticus)、嚙齒類螺桿菌(helicobacterrodentium)為較為重要的感染哨齒類動(dòng)物的螺桿菌，主要存在于消化道，包括盲腸、結(jié)腸及肝膽等器官。嚙齒動(dòng)物螺桿菌會(huì)引起動(dòng)物疾病，更易以隱性感染形式存在于免疫缺陷型動(dòng)物中，感染嚙齒類螺桿菌會(huì)導(dǎo)致小鼠肝炎、盲腸結(jié)腸炎等多種腸肝疾病，另外一同感染嚙齒類螺桿菌和膽汁螺桿菌會(huì)引起小鼠腹瀉。因此，若在科研或生物安全性評(píng)價(jià)等試驗(yàn)中采用此類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，定會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)造成影響，結(jié)果缺乏可靠性。

嚙齒類螺桿菌為螺桿菌屬，而螺桿菌屬的菌種在菌落、菌體形態(tài)上差異小、十分相似，采用傳統(tǒng)的生理生化特性的基礎(chǔ)進(jìn)行分類鑒定有一定困難，同時(shí)，由于螺旋桿菌需在微氧環(huán)境中生長(zhǎng)，所需設(shè)備特殊，營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)苛，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)，制約了螺桿菌的常規(guī)檢測(cè)方法的多樣。pcr方法是這類生長(zhǎng)環(huán)境苛刻菌株首選的檢測(cè)方法，由于pcr在螺桿菌屬和種水平上的高特異性和敏感性已經(jīng)普遍用于嚙齒類螺桿菌的檢測(cè)中，pcr檢測(cè)技術(shù)主要根據(jù)16srrna序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行，在生物進(jìn)化中，16srrna的進(jìn)化落后于其他基因，因此被稱為細(xì)菌界的“分子化石”。具有高度保守性，若兩種細(xì)菌基因達(dá)到98.8％以上的同源性，即將其認(rèn)定為同一屬種，此外，該基因序列的長(zhǎng)度為1600nt，比較適中，可滿足實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)的需求。常規(guī)pcr方法在一定程度上提高了檢測(cè)螺桿菌的敏感性，但在定量及靈敏度等問題上仍存在不足，有待優(yōu)化完善。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及其鑒定方法，使所述方法具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌的試劑盒，包括sybr熒光染料taq酶預(yù)混液、熒光誤差校正液、陽(yáng)性質(zhì)控品和上述方案所述引物。

優(yōu)選的，權(quán)利要求1所述的引物的質(zhì)量濃度優(yōu)選為10μmol/l。

優(yōu)選的，所述陽(yáng)性質(zhì)控品的質(zhì)量濃度優(yōu)選為10⁸ng/μl。

優(yōu)選的，sybr熒光染料taq酶預(yù)混液5ml、熒光誤差校正液200μl、陽(yáng)性質(zhì)控品2ml和所述的正向引物400μl和所述的反向引物400μl。

本發(fā)明還提供了基于所述的試劑盒鑒別嚙齒類螺桿菌的鑒別方法，包括以下步驟：

1)提取待測(cè)樣品總基因組dna，得到待測(cè)樣本總dna；

2)以所述步驟1)得到的樣品總dna為模板，利用所述的引物進(jìn)行qpcr擴(kuò)增，得到熒光檢測(cè)結(jié)果；

3)以陽(yáng)性質(zhì)控品為陽(yáng)性對(duì)照，以超純水為陰性對(duì)照，待測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線與陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線結(jié)果一致，且陰性對(duì)照沒有產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，則判定為樣品為嚙齒類螺桿菌。

優(yōu)選的，qpcr擴(kuò)增的擴(kuò)增體系包括以下組分含量：

sybr熒光染料taq酶預(yù)混液10μl，熒光誤差校正液0.4μl，50ng/μl的dna模板2μl，10μmol/l正向引物0.8μl，10μmol/l反向引物0.8μl，ddh2o6μl。

優(yōu)選的，qpcr擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

本發(fā)明提供了一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的引物適用于16srrna熒光定量pcr擴(kuò)增，并且準(zhǔn)確地從肝螺桿菌、膽螺桿菌等多種螺桿菌中鑒別出嚙齒類螺桿菌，特異性達(dá)100％。

本發(fā)明還提供了一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌的試劑盒及其鑒別方法，所述試劑盒方便準(zhǔn)確地鑒定嚙齒類螺桿菌的存在，操作簡(jiǎn)便，無需進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，只需熒光定量pcr儀即可完成，實(shí)現(xiàn)快速、大通量診斷和檢測(cè)，降低了鑒別時(shí)間和檢測(cè)成本，研究表明本發(fā)明提供的這一熒光pcr檢測(cè)方法，特異性達(dá)100％，靈敏度達(dá)30拷貝。

附圖說明

圖1為2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)普通pcr引物特異性結(jié)果；

圖2為2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)普通pcr靈敏度結(jié)果；

圖3為熒光pcr溶解曲線分析圖；

圖4熒光pcr擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線；

圖5標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖6熒光pcr靈敏度檢測(cè)結(jié)果；

圖7特異性檢測(cè)結(jié)果；

圖8樣品檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

根據(jù)genbank公布的helicobacterrodentium16sribosomalrnagene的基因序列(序列號(hào)：u96297.1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中正向引物為：5’-gagatagtggagtgctagc-3’(seqidno.1)；反向引物：5’gctccatttcacaatattgc-3’(seqidno.2)，目的片段大小為268bp。所述引物委托上海生工合成。

本發(fā)明還提供了一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌的試劑盒，包括sybr熒光染料taq酶預(yù)混液、熒光誤差校正液、陽(yáng)性質(zhì)控品和上述方案所述引物。

本發(fā)明提供的試劑盒包括正向引物和反向引物。正向引物和反向引物的摩爾濃度優(yōu)選為10μmol/l。所述的正向引物的體積優(yōu)選為400μl和所述的反向引物的體積優(yōu)選為400μl。

本發(fā)明提供的試劑盒包括sybr熒光染料taq酶預(yù)混液。所述sybr熒光染料taq酶預(yù)混液優(yōu)選為sybrpremixextaqⅱ試劑。在所述試劑盒中，所述sybrpremixextaqⅱ試劑的體積優(yōu)選為5ml。所述sybrpremixextaqⅱ試劑的來源購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

本發(fā)明提供的試劑盒包括熒光誤差校正液。所述熒光誤差校正液優(yōu)選為roxreferencedyeⅱ試劑。所述roxreferencedyeⅱ的體積優(yōu)選為200μl。所述roxreferencedyeⅱ試劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

本發(fā)明提供的試劑盒包括陽(yáng)性質(zhì)控品。所述陽(yáng)性質(zhì)控品的拷貝含量?jī)?yōu)選為10¹～10⁸拷貝/μl。所述陽(yáng)性質(zhì)控品的體積優(yōu)選為2ml。

本發(fā)明中，所述陽(yáng)性質(zhì)控品的制備方法，包括以下步驟：

1)用上述方案中的引物擴(kuò)增嚙齒類螺桿菌，得到的pcr產(chǎn)物經(jīng)過膠回收后，與plb載體連接，得到重組質(zhì)粒；

2)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到dh5α大腸桿菌中，篩選得到陽(yáng)性菌落，菌落擴(kuò)增使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒；

3)經(jīng)過紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸收值，得到陽(yáng)性質(zhì)控品的濃度和拷貝數(shù)。

本發(fā)明中，所述步驟1)中擴(kuò)增的程序優(yōu)選為94℃1min30s；94℃30s，52℃30s，72℃15s，35個(gè)循環(huán)；72℃1min30s；16℃2h。

本發(fā)明中，所述步驟1)中擴(kuò)增的體系優(yōu)選包括：10μm的正向引物1μl，10μm的反向引物1μl，taqmax10μl，dna模板2μl和ddh2o6μl。

本發(fā)明中，所述連接的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的連接方法即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述連接采用連接試劑盒。所述連接試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)化的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的轉(zhuǎn)化方法即可。

本發(fā)明中，所述陽(yáng)性菌落的篩選方法優(yōu)選采用菌落pcr法。本發(fā)明對(duì)所述菌落pcr法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的菌落pcr法即可。本發(fā)明中，所述質(zhì)粒小提試劑盒的來源優(yōu)選購(gòu)自為北京天根生化科技有限公司。

本發(fā)明中，所述陽(yáng)性質(zhì)控品的質(zhì)量濃度優(yōu)選為50ng/μl，原始拷貝數(shù)為1.5×10¹⁰拷貝/μl。

本發(fā)明還提供了基于所述的試劑盒鑒別嚙齒類螺桿菌的鑒別方法，包括以下步驟：

①提取樣本總基因組dna，得到待測(cè)樣本總dna；

②以所述步驟①得到的樣品總dna為模板，利用上述方案所述的引物進(jìn)行qpcr擴(kuò)增，得到熒光檢測(cè)結(jié)果；

③以陽(yáng)性質(zhì)控品為陽(yáng)性對(duì)照，以超純水為陰性對(duì)照，待測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線與陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線結(jié)果一致，且陰性對(duì)照沒有產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，則判定為樣品為嚙齒類螺桿菌。

本發(fā)明中，所述提取基因組dna的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的提取基因組dna的方法即可。本發(fā)明中，所述提取基因組dna的方法采用試劑盒法提取。

提取基因組dna后，本發(fā)明優(yōu)選進(jìn)行dna濃度的檢測(cè)。所述檢測(cè)的方法優(yōu)選采用核酸定量?jī)x進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，調(diào)整模板的濃度至20～120ng/μl。

本發(fā)明中，qpcr擴(kuò)增的擴(kuò)增體系優(yōu)選包括以下組分含量：

sybrpremixextaqⅱ10μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，50ng/μl的dna模板2μl，10μmol/l正向引物0.8μl，10μmol/l反向引物0.8μl，ddh2o6μl。

本發(fā)明中，qpcr擴(kuò)增的擴(kuò)增程序優(yōu)選為95℃預(yù)變性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

本發(fā)明中，qpcr擴(kuò)增優(yōu)選采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀器(appliedbiosystemsstepone^tmreal-timepcrsystemthermalcyclingblock)進(jìn)行擴(kuò)增。所述qpcr擴(kuò)增設(shè)置空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。所述空白對(duì)照用相同體積的超純水替換樣品鑒別組的模板dna，所述陽(yáng)性對(duì)照用相同體積的陽(yáng)性質(zhì)控品替換樣品鑒別組的模板dna?？瞻讓?duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和樣品鑒別擴(kuò)增所用程序相同。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及其鑒定方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

pcr特異性引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)genbank公布的helicobacterrodentium16sribosomalrnagene的基因序列(序列號(hào)：u96297.1)，目的片段大小為268bp。設(shè)計(jì)一對(duì)引物f：5’-gagatagtggagtgctagc-3’；r：5’gctccatttcacaatattgc-3’，引物由上海生工合成。

實(shí)施例2

pcr擴(kuò)增方法的建立

(1)常規(guī)pcr反應(yīng)體系為20μl：

h.ro-16srrna-f(10μm)1μl；

h.ro-16srrna-r(10μm)1μl；

taqmix10μl；

基因組dna2μl；

ddh2o6μl。

其中，基因組dna分別為肝螺桿菌陰性對(duì)照、膽螺桿菌陰性對(duì)照、嚙齒類螺桿菌。

(2)常規(guī)pcr反應(yīng)程序：

94℃1min30s；94℃30s，52℃30s，72℃15s，35個(gè)循環(huán)；72℃1min30s；16℃2h。2％瓊脂糖凝膠電泳觀察pcr結(jié)果，如圖1所示，各泳道樣品具體為：1：dl2000marker，2：空白對(duì)照，3：肝螺桿菌陰性對(duì)照，4：膽螺桿菌陰性對(duì)照，5：嚙齒類螺桿菌陽(yáng)性樣品，只有泳道5出現(xiàn)大小約為268bp的條帶，并且條帶清晰，這說明所述擴(kuò)增引物對(duì)嚙齒類螺桿菌具有擴(kuò)增特異性。

實(shí)驗(yàn)例3

陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

將實(shí)施例2中嚙齒類螺桿菌擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物經(jīng)過膠回收試劑盒回收后，與plb載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化到dh5α大腸桿菌中，篩選得到陽(yáng)性菌落，菌落擴(kuò)增使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒，經(jīng)過紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度為50ng/μl，原始拷貝數(shù)為1.5×10¹⁰拷貝/μl。

實(shí)施例4

普通pcr敏感性實(shí)驗(yàn)

將所得質(zhì)粒按照10倍稀釋得到1.5×10⁰～1.5×10⁸拷貝數(shù)/μl，使用1.5～1.5×10⁸拷貝/μl為樣本，檢測(cè)普通pcr靈敏度，反應(yīng)體系與反應(yīng)程序?qū)嵤├?相同。經(jīng)過2％瓊脂糖凝膠電泳如圖2所示，1：3×10⁹拷貝/μl，2：3×10⁸拷貝/μl，3：3×10⁷拷貝/μl，4：3×10⁶拷貝/μl，5：3×10⁵拷貝/μl，6：3×10⁴拷貝/μl，7：3×10³拷貝/μl，8：3×10²拷貝/μl，9：30拷貝/μl，10：空白對(duì)照，11：dl2000marker。由圖2可知，在3×10²拷貝/μl時(shí)，目的條帶可見。

實(shí)施例5

熒光定量pcr反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

熒光定量pcr反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋，取15-1.5×10⁶拷貝/μl的6個(gè)梯度濃度的質(zhì)粒作模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，制作溶解曲線(圖3)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。熒光定量pcr反應(yīng)體系包括sybrpremixextaqⅱ10μl，h.ro-16srrna-f0.8μl，h.ro-16srrna-r0.8μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，dna模板(0.05fg/μl～500pg/μl)2μl，ddh2o6μl。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線如圖4所示，具體為1：3×10⁶拷貝/μl，2：3×10⁵拷貝/μl，3：3×10⁴拷貝/μl，4：3×10³拷貝/μl，5：3×10²拷貝/μl，6：30拷貝/μl。

由圖4所示，指數(shù)增長(zhǎng)期曲線平行，反映了pcr的擴(kuò)增效率相近，不同稀釋度之間的ct值相差均勻，ct值與拷貝數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

實(shí)施例6

熒光定量pcr敏感性試驗(yàn)

敏感性試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋后，取濃度為0.15～1.5×10⁶拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，同時(shí)做普通pcr檢測(cè)。結(jié)果圖6所示，其中1：3×10⁶拷貝/μl，2：3×10⁵拷貝/μl，3：3×10⁴拷貝/μl，4：3×10³拷貝/μl，5：3×10²拷貝/μl，6：30拷貝/μl，7：3拷貝/μl，8：0.3拷貝/μl，9：空白對(duì)照。

圖6表明熒光定量pcr檢測(cè)方法可以檢測(cè)到30個(gè)拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品，而常規(guī)pcr僅能檢測(cè)到300個(gè)拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品，表明建立的h.rodentium實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法具有較高的敏感性，比常規(guī)pcr至少高10倍。

實(shí)施例7

熒光定量pcr的特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)檢測(cè)肝螺桿菌，膽螺桿菌，h.rodentium，方法同實(shí)施例5，結(jié)果如圖7所示。圖7表明，只有h.rodentium有熒光信號(hào)，發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)，而肝螺桿菌，膽螺桿菌未發(fā)生任何擴(kuò)增，說明所述方法具有很好的特異性。

實(shí)施例8

熒光定量pcr的樣品檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)大小鼠糞便dna提取物檢測(cè)，收集不同實(shí)驗(yàn)房大小鼠糞便，使用糞便dna提取試劑盒提取dna，根據(jù)如上所示的熒光pcr體系及程序，并添加陽(yáng)性及空白對(duì)照。結(jié)果圖8所示，其中1：陽(yáng)性對(duì)照，2-14：檢測(cè)樣品，15：空白對(duì)照。圖8顯示，2～15樣品均未擴(kuò)增出如陽(yáng)性對(duì)照所示的擴(kuò)增曲線，這表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未感染h.rodentium。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>揚(yáng)州大學(xué)

<120>一種基于熒光定量pcr鑒定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及鑒定方法

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gagatagtggagtgctagc19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gctccatttcacaatattgc20