本發(fā)明涉及一種鑒定方法，尤其是一種快速高效鑒定產(chǎn)黃曲霉毒素菌株的方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)主要是由黃曲霉、寄生曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)烈的毒性和致癌性，是迄今發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品毒性最強(qiáng)的一類生物毒素。當(dāng)糧食未能及時(shí)曬干及儲(chǔ)藏不當(dāng)時(shí)，往往容易被黃曲霉或寄生曲霉污染而產(chǎn)生此類毒素。同時(shí)，它們存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果中，特別是容易污染稻米、花生、玉米、大豆、小麥等糧油產(chǎn)品，是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類健康危害極為突出的一類霉菌毒素。1993年，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見(jiàn)，其毒性和致癌性也最強(qiáng)，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，國(guó)家質(zhì)檢總局規(guī)定黃曲霉毒素B1是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一。當(dāng)人攝入量大時(shí)，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。當(dāng)微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒，生長(zhǎng)障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最強(qiáng)致癌物之一，已經(jīng)受到全世界范圍的關(guān)注。
黃曲霉毒素污染問(wèn)題非常嚴(yán)重，而且能夠帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且能對(duì)人、畜和禽類的健康造成嚴(yán)重危害。國(guó)內(nèi)外科研工作者的焦點(diǎn)主要集中在黃曲霉毒素產(chǎn)生機(jī)理、預(yù)防控制技術(shù)及黃曲霉毒素的高效高靈敏檢測(cè)方面，并做了大量的研究工作，但并沒(méi)有真正從菌株產(chǎn)毒這一頭上進(jìn)行有效防控，但是，目前黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的分離方法操作繁瑣、工作量大、耗時(shí)、分離效率不高，而且復(fù)雜基質(zhì)如土壤中分離產(chǎn)毒菌株困難也較大。而且，常用的方法是先培養(yǎng)黃曲霉菌株，然后再提取毒素，最后對(duì)毒素含量進(jìn)行檢測(cè)，非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種操作簡(jiǎn)捷、專一性強(qiáng)、鑒定速度快的快速高效鑒定產(chǎn)黃曲霉毒素菌株的方法。
本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案為：一種快速高效鑒定產(chǎn)黃曲霉毒素菌株的方法，其方法如下：選出20個(gè)黃曲霉毒素含量較高的稻谷樣品，分別取5g樣品，加入45ml無(wú)菌水中，120r/min，28℃恒溫?fù)u床2h。然后取1ml加到9ml無(wú)菌水中，逐級(jí)進(jìn)行梯度稀釋；將采集的土樣室溫下自然晾干，然后在滅菌的研缽中研磨至細(xì)粉狀，準(zhǔn)確稱取5g土樣，加入45ml無(wú)菌水中，120r/min，28℃恒溫?fù)u床2h。然后取1ml加到9ml無(wú)菌水中，逐級(jí)進(jìn)行梯度稀釋；將上述菌液100μl均勻涂布在含0.1g/L氯霉素的無(wú)菌AFPA平板上，28℃靜置培養(yǎng)4-7天，AFPA平板上呈亮橘色的單菌落接種到含0.1g/L氯霉素的無(wú)菌PDA平板上，進(jìn)行純化培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)4-7天；將分離純化到的菌株分別接種到無(wú)菌PDA斜面上，培養(yǎng)5-7天，置于黃曲霉毒素紫外線熒光檢測(cè)器下觀察熒光結(jié)果，按照熒光顯示的強(qiáng)弱進(jìn)行分離和排序。
本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：曲霉素瓊脂基礎(chǔ)(AFPA)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉20.0，檸檬酸鐵銨0.5，氯硝銨0.002，氯霉素0.1，瓊脂15.0，pH：6.3±0.2，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘，再加入用細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌的50g/L氯霉素溶液，使其終濃度為0.1g/L，搖勻后倒入無(wú)菌的培養(yǎng)皿(直徑9cm)中冷卻備用，若暫時(shí)不用，可置4℃冰箱冷藏保存；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯(去皮)200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000ml，121℃高壓滅菌15分鐘，再加入用細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌的50g/L氯霉素溶液，使其終濃度為0.1g/L，搖勻后倒入無(wú)菌的培養(yǎng)皿(直徑9cm)中冷卻備用，若暫時(shí)不用，可置4℃冰箱冷藏保存。
本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述的分離排序，是將有藍(lán)色熒光和綠色熒光的樣品分離出來(lái)，根據(jù)其發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行排序。
采用上述方法進(jìn)行鑒定，工序簡(jiǎn)單、鑒定快速，專一性很強(qiáng)。
附圖說(shuō)明
圖1為為本實(shí)施例中熒光檢測(cè)鑒定的結(jié)果表。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明一種快速高效鑒定產(chǎn)黃曲霉毒素菌株的方法，其方法如下：選出20個(gè)黃曲霉毒素含量較高的稻谷樣品，分別取5g樣品，加入45ml無(wú)菌水中，120r/min，28℃恒溫?fù)u床2h。然后取1ml加到9ml無(wú)菌水中，逐級(jí)進(jìn)行梯度稀釋；將采集的土樣室溫下自然晾干，然后在滅菌的研缽中研磨至細(xì)粉狀，準(zhǔn)確稱取5g土樣，加入45ml無(wú)菌水中，120r/min，28℃恒溫?fù)u床2h。然后取1ml加到9ml無(wú)菌水中，逐級(jí)進(jìn)行梯度稀釋；將上述菌液100μl均勻涂布在含0.1g/L氯霉素的無(wú)菌AFPA平板上，28℃靜置培養(yǎng)4-7天，AFPA平板上呈亮橘色的單菌落接種到含0.1g/L氯霉素的無(wú)菌PDA平板上，進(jìn)行純化培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)4-7天；將分離純化到的菌株分別接種到無(wú)菌PDA斜面上，培養(yǎng)5-7天，置于黃曲霉毒素紫外線熒光檢測(cè)器下觀察熒光結(jié)果，按照熒光顯示的強(qiáng)弱進(jìn)行分離和排序，曲霉素瓊脂基礎(chǔ)(AFPA)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉20.0，檸檬酸鐵銨0.5，氯硝銨0.002，氯霉素0.1，瓊脂15.0，pH：6.3±0.2，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘，再加入用細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌的50g/L氯霉素溶液，使其終濃度為0.1g/L，搖勻后倒入無(wú)菌的培養(yǎng)皿(直徑9cm)中冷卻備用，若暫時(shí)不用，可置4℃冰箱冷藏保存；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯(去皮)200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000ml，121℃高壓滅菌15分鐘，再加入用細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌的50g/L氯霉素溶液，使其終濃度為0.1g/L，搖勻后倒入無(wú)菌的培養(yǎng)皿(直徑9cm)中冷卻備用，若暫時(shí)不用，可置4℃冰箱冷藏保存，所述的分離排序，是將有藍(lán)色熒光和綠色熒光的樣品分離出來(lái)，根據(jù)其發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行排序。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)以及原理
有研究表明，寄生曲霉有3-6％的菌株不產(chǎn)生黃曲霉毒素，而黃曲霉有0-80％的菌株不產(chǎn)生黃曲霉毒素。寄生曲霉能產(chǎn)生B組和G組黃曲霉毒素，而黃曲霉只有部分菌株能產(chǎn)生黃曲霉毒素，且只能產(chǎn)生B組黃曲霉毒素。在紫外線下黃曲霉毒素B1和B2發(fā)藍(lán)色熒光，黃曲霉毒素G1和G2發(fā)綠色熒光，采用這種機(jī)制進(jìn)行最終的熒光分離和排序清楚明顯，鑒定快速直接，針對(duì)性強(qiáng)。
以往的培養(yǎng)往往是將梯度稀釋的菌液涂布在培養(yǎng)真菌常用的培養(yǎng)基平板上(如PDA培養(yǎng)基)，待所有真菌都長(zhǎng)出后，經(jīng)過(guò)多次分離純化，獲得所有生長(zhǎng)的真菌菌株，然后在采用各種手段一一鑒定是否為黃曲霉菌和寄生曲霉菌，整個(gè)分離過(guò)程操作繁瑣，工作量很大，耗時(shí)費(fèi)力。本發(fā)明中，樣品中的黃曲霉菌和寄生曲霉菌在梯度稀釋篩選時(shí)，直接涂布在選擇性曲霉素瓊脂基礎(chǔ)(AFPA)培養(yǎng)基上，根據(jù)黃曲霉菌和寄生曲霉菌在APFA培養(yǎng)基上呈亮橘色的特性，能夠在一次分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上將黃曲霉菌和寄生曲霉菌與其它真菌進(jìn)行分離，一步到位，只需直接檢測(cè)其為產(chǎn)毒或非產(chǎn)毒菌株即可，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)高效，專一性強(qiáng)。
用于黃曲霉菌和寄生曲霉菌的分離培養(yǎng)的AFPA成分(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉20.0，檸檬酸鐵銨0.5，氯硝銨0.002，氯霉素0.1，瓊脂15.0，pH：6.3±0.2。加熱溶解于1000ml蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。其中：
(1)蛋白胨和酵母浸粉為微生物的生長(zhǎng)提供必不可少的氮源和碳源。
(2)為避免其他生長(zhǎng)較快的真菌對(duì)黃曲霉分離產(chǎn)生干擾，本發(fā)明的培養(yǎng)基中添加了適量的氯硝胺，氯硝胺能抑制除黃曲霉外大多數(shù)真菌的生長(zhǎng)。
(3)篩選過(guò)程中，由于樣品中存在大量細(xì)菌，其生長(zhǎng)明顯快于真菌，會(huì)影響黃曲霉及寄生曲霉的生長(zhǎng)，培養(yǎng)基加入抗生素可有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。
(4)由于抗生素均不耐高溫，無(wú)法利用高溫滅菌，需通過(guò)細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌后再加入經(jīng)高溫滅菌的其他組分中。本專利采用的是無(wú)水乙醇配置的50g/L的氯霉素母液過(guò)濾除菌后加入到滅菌培養(yǎng)基中，終濃度為0.1g/L。
本發(fā)明中稻谷樣品：從廣西、湖北、湖南、江西和重慶的稻谷樣品中共選出20個(gè)黃曲霉毒素含量較高的稻谷樣品，分別取5g樣品，加入45ml無(wú)菌水中，120r/min，28℃恒溫?fù)u床2h。然后取1ml加到9ml無(wú)菌水中，逐級(jí)進(jìn)行梯度稀釋。土壤樣品：將采集的土樣室溫下自然晾干，然后在滅菌的研缽中研磨至細(xì)粉狀，準(zhǔn)確稱取5g土樣，加入45ml無(wú)菌水中，120r/min，28℃恒溫?fù)u床2h。然后取1ml加到9ml無(wú)菌水中，逐級(jí)進(jìn)行梯度稀釋，通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行鑒定，得到結(jié)果如圖1所示。
利用本發(fā)明中的AFPA培養(yǎng)基可以一步實(shí)現(xiàn)黃曲霉菌和寄生曲霉菌與其他真菌的分離，沒(méi)有干擾，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，分離專一性強(qiáng)，分離效率高；與常規(guī)分離方法相比(通用平板上會(huì)長(zhǎng)出各種各樣的真菌和細(xì)菌)，一步分離大大減少了分離菌株的工作量，省時(shí)高效。
本發(fā)明通過(guò)一次檢測(cè)就能夠區(qū)別分離到的黃曲霉菌和寄生曲霉菌是否為產(chǎn)毒素菌株，而且借助熒光強(qiáng)弱能夠區(qū)分產(chǎn)毒菌株產(chǎn)毒的多少，可以通過(guò)此步簡(jiǎn)單操作實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)毒素菌株的快速篩選，可謂一舉兩得，與現(xiàn)有技術(shù)相比，不需要進(jìn)行復(fù)雜操作(如，培養(yǎng)獲得各種真菌，再提取毒素，然后進(jìn)行儀器測(cè)定；或者提取各菌株的DNA，然后進(jìn)行PCR，產(chǎn)物再進(jìn)行分子鑒定等)，比較直觀且簡(jiǎn)便易行。
最終進(jìn)行，產(chǎn)毒菌株的驗(yàn)證
(1)儀器鑒定：選擇熒光檢測(cè)中熒光強(qiáng)度較強(qiáng)(包括綠色熒光和藍(lán)色熒光)的菌株培養(yǎng)好后，提取毒素后，進(jìn)行液相色譜(或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀)測(cè)定。結(jié)果：上述分離到的菌株均能檢測(cè)到黃曲霉毒素。
(2)分子驗(yàn)證：選擇熒光檢測(cè)中熒光強(qiáng)度較強(qiáng)(包括綠色熒光和藍(lán)色熒光)的菌株培養(yǎng)好后，提取總DNA，利用真菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再利用PCR回收試劑盒回收純化得到目的片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物送于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列分析。將測(cè)序得到的序列結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)利用Blast軟件進(jìn)行比對(duì)分析。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離到的產(chǎn)毒菌株均為黃曲霉菌和寄生曲霉菌，同源性達(dá)到99％。
顯然，上述實(shí)施例僅僅是為了清楚的說(shuō)明所做的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。