從鏈霉菌菌株HY?14生產(chǎn)的新型木聚糖酶的制作方法

本發(fā)明涉及分離自鏈霉菌(Streptomyces sp.)菌株HY-14的新型木聚糖酶，該木聚糖酶包含糖苷水解酶家族10(GH10)結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2，CBM2)結(jié)構(gòu)域。

背景技術：

木聚糖(非淀粉多糖)是形成植物細胞壁或組織的組份之一。非淀粉多糖主要分為纖維素和半纖維素兩組。木聚糖是半纖維素的主要組份。木聚糖酶是將木聚糖水解成木糖和木二糖的酶。

木聚糖酶是微生物中產(chǎn)生的酶之一。根據(jù)以前的報道，內(nèi)切-β-木聚糖酶、外切-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶這三種酶一起作用，以將木聚糖(半纖維素的主要組份)完全水解和糖化，通常將這三種酶稱為木聚糖酶(Biely,P.，Trends.Biotechnol.，3，286-290，1985)。該酶被廣泛應用于各個領域和行業(yè)，用來生產(chǎn)高品質(zhì)的紙、再生廢紙(Beg,Q.&G.S.Hoondal.，Appl.Micribiol.Biotechnol.56，326-338，2001)；從果汁飲料和啤酒中除去雜質(zhì)；提取咖啡、植物油和淀粉；以及提高飼料效率等(Bedford,M.R&Classen,H.L.，Elsevier Amsterdam，361-370，1992；Wong,K.K.Y&Saddler,J.N.，Crit.Rev.Biotechnol.12，413-435，1992)。如今，木聚糖酶作為飼料添加劑酶的可用性正在提高，因為木聚糖酶能夠降解包含在飼料谷物中的纖維，所述飼料谷物不僅提供了動物能量代謝所必需的碳水化合物和少量的蛋白質(zhì)，而且還提供了動物難以利用的纖維。

飼料谷物中的纖維由非淀粉多糖和木質(zhì)素組成。植物細胞壁由以下組成：最外層的纖維素、含有β-葡聚糖的非淀粉多糖、覆蓋整個谷物內(nèi)部并以木聚糖作為主要組份的半纖維素以及木質(zhì)素。非淀粉多糖不被牛的消化酶所降解，且遮蓋了谷物中的淀粉或蛋白質(zhì)，導致在牛中的營養(yǎng)效率降低。特別是，以高濃度包含在小麥和黑麥的細胞壁內(nèi)的可溶性木聚糖在消化道中吸收水，成為粘性凝膠，并因此阻止消化酶接近營養(yǎng)素且干擾消化道中的消化流，從而使微生物附著至消化物而引起異常發(fā)酵，導致營養(yǎng)素損失(Kuhad,R.C.&Singh,A.，Crit.Rev.Biotechnol.13，151-172，1993)。

如果添加至谷物飼料，木聚糖酶能夠水解遮蓋谷物的半纖維素，從而使包含在谷物中的營養(yǎng)素的可用性提高，且能夠改善牛中的腸道消化條件。尤其是對于小麥飼料產(chǎn)品而言，木聚糖酶是高價值的酶，因為木聚糖酶能夠防止通常由具有高含量半纖維素的小麥產(chǎn)品所引起的牛中的大便稀溏或痢疾，從而提高飼料的價值，并使小麥產(chǎn)品成為穩(wěn)定的飼料成分而改善品質(zhì)差異。近來，不僅在發(fā)達國家，而且在生活環(huán)境和國民收入得到改善的其它國家，肉類消費得到提高。因此，對于單胃動物(如豬和雞)的飼料而言，木聚糖酶被認為是一種重要的酶(Bedford.M.R.，Animal Feed Science and Technology.53，145-155，1995)。

作為食品酶，將木聚糖酶用于改善由谷物或谷物副產(chǎn)品制成的面團的顏色和物理性質(zhì)，還將其用于制備低聚木糖，其中，將作為功能性材料吸引了我們注意的至少三種木糖組合。

作為飼料酶，將木聚糖酶用于提高包括谷物或谷物副產(chǎn)品的植物材料(如小麥麩、玉米和大豆粉)的消化效率，用于飼料的制備，并用于改善動物中的腸道流動性。

作為工藝酶，將木聚糖酶用于漂白，以去除半纖維素的木質(zhì)素多糖復合物，在造紙和紙漿行業(yè)的領域中，所述漂白為使用有毒有機溶劑的常規(guī)工藝。

在如今受到關注的綠色技術領域中，研究目標從利用植物材料(如玉米和甘蔗)的第一代生物能源轉(zhuǎn)移到了利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品(如玉米秸稈和稻稈)的第二代生物能源。因此，出于工業(yè)目的使用木聚糖酶的必要性得到提高。第二代生物能源生產(chǎn)工藝需要更復雜的程序。對同時包含纖維素和半纖維素的植物組織或細胞壁進行的化學處理破壞了環(huán)境。因此，使用纖維素酶和木聚糖酶進行水解更有效。

木聚糖是植物生物質(zhì)的主要組份，可通過木聚糖酶進行水解。已知對處于β-1,4-木糖結(jié)構(gòu)的木聚糖進行水解的糖苷水解酶家族(GH家族) 有六個成員：GH家族5、GH家族8、GH家族10、GH家族11、GH家族30和GH家族43(http://www.cazy.org，Luo等，2010)。其中最具代表性的家族是GH家族10和GH家族11。

本發(fā)明人識別了來自鏈霉菌菌株HY-14的新型內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶，該酶包含糖苷水解酶家族10結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2；CBM2)結(jié)構(gòu)域，隨后對該酶的基因序列、氨基酸序列以及與溫度和pH有關的特性進行了研究。結(jié)果，本發(fā)明人確認了在5.0-7.5之間的pH下，木聚糖酶的最大酶活性持續(xù)為至少80％，并且該酶能夠顯著降解糖底物(包括木聚糖)，從而可將該酶作為食品酶、飼料酶和工藝酶等有效地用于各個行業(yè)部門，使得完成本發(fā)明。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供鏈霉菌菌株HY-14和分離自上述菌株的新型木聚糖酶，該木聚糖酶包含糖苷水解酶家族10(GH10)結(jié)構(gòu)域和碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2，CBM2)結(jié)構(gòu)域。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列的木聚糖酶。

本發(fā)明還提供了使用鏈霉菌菌株HY-14生產(chǎn)木聚糖酶的方法。

另外，本發(fā)明提供了包含上述木聚糖酶作為活性成分的飼料添加劑。

有益效果

本發(fā)明涉及分離自鏈霉菌菌株HY-14的新型木聚糖酶，該酶與對應于糖苷水解酶家族10(GH10)結(jié)構(gòu)域的酶同源并包含作為底物結(jié)合域的碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2，CBM2)結(jié)構(gòu)域。尤其是，在5.0至7.5之間的pH下，最大酶活性持續(xù)為至少80％，并且包含木聚糖在內(nèi)的糖底物在木聚糖酶中被顯著降解，并因此可將木聚糖酶作為酶用于諸如食品、飼料的各個行業(yè)部門以及其它行業(yè)中。

附圖說明

本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的應用參考附圖可以得到最好的理解，其中：

圖1是說明本發(fā)明中分離的新型木聚糖酶的基因序列和氨基酸序列的圖示。

圖2是說明本發(fā)明中分離的木聚糖酶的氨基酸序列的活性結(jié)構(gòu)域區(qū)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域區(qū)域的圖示：

Sme：鏈霉菌HY-14的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶；

Ssp：鏈霉菌Ame12xE9的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶(GenBank登錄號：WP_019983605)；

Sli：變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)TK24的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶(GenBank登錄號：WP_003978188)；

Spr：始旋鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)ATCC 25486的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶(GenBank登錄號：WP_005310297)；

Smg：巨孢鏈霉菌(Streptomyces megasporus)的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶(GenBank登錄號：ADZ99362)；

→，←：用于設計簡并PCR引物的肽序列；

*：生物催化反應所必需的氨基酸；

GH10結(jié)構(gòu)域：糖苷水解酶家族10，活性結(jié)構(gòu)域；以及

CBM2結(jié)構(gòu)域：碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2；CBM2)，底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

圖3是說明顯示除了結(jié)合至木聚糖酶的底物結(jié)合域(CBM2)之外的木聚糖酶的分子量的SDS-PAGE結(jié)果的圖示：

S：蛋白標志物；

1：IPTG誘發(fā)后包含XylU的可溶性裂解物；

2：純化的XylU；

3：純化的XylUΔCBM2；以及

4：IPTG誘發(fā)后包含XylUΔCBM2的可溶性裂解物。

圖3是說明對木聚糖酶的最佳反應條件(pH和溫度)進行研究的圖示，木聚糖酶的酶活性通過使用樺木木聚糖作為底物來測量：

○：木聚糖酶(XylU)；以及

●：除了底物結(jié)合域之外的木聚糖酶(XylUΔCBM2)。

具體實施方式

下文，對本發(fā)明進行詳細地描述。

本發(fā)明提供了具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列的木聚糖酶。

上述木聚糖酶優(yōu)選分離自鏈霉菌菌株HY-14(保藏號KCTC 12531BP)。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，將東方螻蛄(Gryllotalpa orientalis)腸懸浮液涂覆于含有偶氮木聚糖的細菌分離培養(yǎng)基上，然后分離顯示出由偶氮木聚糖的降解所形成的清晰的環(huán)的微生物菌落。對分離菌株的16srDNA序列(GenBank登錄號：JQ943651)進行檢查，結(jié)果該分離菌株被鑒定為鏈霉菌(GenBank登錄號：JQ943651)。將所鑒定的菌株命名為鏈霉菌菌株HY-14，并于2013年12月16日保藏于韓國生物科學與生物技術研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology，KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)，保藏號：KCTC 12531BP。

上述木聚糖酶具有以下特性：

(a)在SDS-PAGE上具有約44.0kDa的分子量；

(b)表現(xiàn)出5.82的pI值；

(c)在5.0-7.5之間的pH下顯示最大活性；

(d)在65℃顯示最大活性；

(e)內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶；

(f)包含處于N-末端的糖苷水解酶-10結(jié)構(gòu)域(GH-10結(jié)構(gòu)域)；以及

(g)包含處于C-末端的碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2；CBM2)結(jié)構(gòu)域。

上述木聚糖酶優(yōu)選分離自鏈霉菌菌株HY-14的木聚糖酶，并且上述糖苷水解酶-10結(jié)構(gòu)域優(yōu)選由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列組成。上述碳水化合物結(jié)合域家族2結(jié)構(gòu)域優(yōu)選由SEQ.ID.NO:3表示的氨基酸序列組成。

上述木聚糖酶的特征優(yōu)選在于水解樺木木聚糖(來自樺木的木聚糖)、山毛櫸木聚糖(來自山毛櫸的木聚糖)、小麥阿拉伯木聚糖(來自小麥的阿拉伯木聚糖)、斯卑爾脫燕麥(oat spelts)木聚糖(來自斯卑爾脫燕麥的木聚糖)、PNP-纖維二糖糖苷以及PNP-木吡喃糖苷。

上述木聚糖酶的特征優(yōu)選在于使用木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)和木六糖(X6)作為底物來產(chǎn)生低聚木糖。

上述木聚糖酶優(yōu)選顯示出內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶活性。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，從上述菌株提取基因組DNA，隨后使用由SEQ.ID.NO:6和SEQ.ID.NO:7表示的引物用木聚糖酶基因進行PCR。結(jié)果，獲得351bp PCR產(chǎn)物。進行基因組步移(genome walking)和巢式PCR，獲得對應于總的木聚糖酶基因(XylU，SEQ.ID.NO:12)的PCR產(chǎn)物。通過用由SEQ.ID.NO:8和SEQ.ID.NO:9表示的、含有限制性酶切位點的引物進行PCR獲得XylU。通過用由SEQ.ID.NO:10和SEQ.ID.NO:11表示的引物進行PCR來獲得XylUΔCBM2(其中，碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2，CBM2)結(jié)構(gòu)域被除去)。結(jié)果，確認了本發(fā)明的木聚糖酶(XylU)包含對應于處于N末端的糖苷水解酶-10結(jié)構(gòu)域(GH-10結(jié)構(gòu)域，SEQ.ID.NO:2)的活性結(jié)構(gòu)域以及處于C末端的碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2；CBM2，SEQ.ID.NO:3)，并由包含1,350bp開放閱讀框的449個氨基酸組成。純化后的蛋白質(zhì)的分子量被確認為44.0kDa(參見圖1-圖3)。

為了研究上述分離的XylU和XylUΔCBM2的最佳反應條件和酶活性，本發(fā)明人使用樺木木聚糖作為底物通過DNS(二硝基水楊酸)定量來測量酶活性。結(jié)果，如圖4所示，在pH 5.5和65℃的溫度下，顯示最大酶活性。在此期間，在60℃下，XylUΔCBM2的最大活性于1小時內(nèi)持續(xù)為約70％(參見圖4)。

為了研究上述分離的木聚糖酶(XylU)對各種木聚糖和糖底物的降解活性，本發(fā)明人使用各種木糖聚合物(如山毛櫸木聚糖、樺木木聚糖以及斯卑爾脫燕麥木聚糖)和其它聚合物(如淀粉、果膠、葡聚糖和PNP(對硝基苯基)糖衍生物)對底物依賴性酶活性進行了測量。結(jié)果，確認了斯卑爾脫燕麥木聚糖得到最有效地降解(參見表1)。

為了研究上述分離的木聚糖酶(XylU)的酶學特性，本發(fā)明人對木聚糖降解產(chǎn)物進行了分析。尤其是，通過使用樺木木聚糖(BX)、木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)和木五糖(X5)作為底物來誘發(fā)酶反應，然后通過高效液相色譜(HPLC)對降解產(chǎn)物進行研究。結(jié)果，樺木木聚糖的水解產(chǎn)物為X2(83.9％，w/v)和X3(11.0％，w/v)；木三糖(X3)的水解產(chǎn)物為X2(76.2％，w/v)和X3(20.0％，w/v)；木四糖(X4)的水解產(chǎn)物為X2(82.4％，w/v)、X3(13.5％，w/v)和X4(0.3％，w/v)；木五糖(X5)的水解產(chǎn)物為X2(80.0％，w/v)、X3(16.4％，w/v)和X4(0.3％，w/v)；并且木六糖(X6)的水解產(chǎn)物為X2(76.1％，w/v)、X3(20.7％，w/v)和X4(0.4％，w/v)(參見表2)。從上述結(jié)果確認了上述木聚糖酶具有內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶的典型活性。

本發(fā)明涉及分離自鏈霉菌菌株HY-14的新型木聚糖酶，該木聚糖酶與對應于糖苷水解酶家族10(GH10)結(jié)構(gòu)域的酶同源并包含作為底物結(jié)合域的碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2，CBM2)結(jié)構(gòu)域。尤其是，在5.0至7.5之間的pH下，最大酶活性持續(xù)為至少80％，并且包含木聚糖在內(nèi)的糖底物在木聚糖酶中被顯著降解，從而可將本發(fā)明的木聚糖酶作為食品酶、飼料酶和工藝酶有效地用于各個行業(yè)部門中。

本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步驟：

1)在含有木聚糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)鏈霉菌菌株HY-14，并通過離心從其獲得上清液；

2)通過向步驟1)中獲得的上清液添加沉淀劑，誘發(fā)水溶性蛋白的沉淀；

3)從步驟2)的沉淀物中除去不溶性沉淀物，并通過透析獲得粗酶溶液；以及

4)通過柱色譜將步驟3)中獲得的粗酶溶液純化。

在上述方法中，步驟2)中的沉淀劑選自于由硫酸銨、丙酮、異丙醇、甲醇、乙醇和聚乙二醇所組成的組。所述沉淀可通過使用具有不同孔徑的膜經(jīng)由超濾進行濃縮來代替。

在上述方法中，可通過使用填充有填充物的柱色譜來實施步驟4)中使用柱色譜進行的純化，所述填充物選自于由硅膠、sephadex、RP-18、聚酰胺、Toyo-pearl以及XAD樹脂所組成的組。如果需要的話，可用適當選擇的填充物進行多次柱色譜。

本發(fā)明還提供了飼料添加劑，所述飼料添加劑包含上述木聚糖酶作為活性成分。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的木聚糖酶在pH 5.5下表現(xiàn)出最大活性，在5.0-7.5之間的pH下最大活性持續(xù)為至少80％。該酶對PNP-纖維二糖糖苷顯示出最高的切割活性，該切割活性甚至比已知的當?shù)孜锵嗤瑫r的另一木聚糖酶的切割活性更高(Haga KM等，1991；Kim DY等，2009，Proc.Biochem.44：1055-1059)。經(jīng)確認本發(fā)明的木聚糖酶對樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖、斯卑爾脫燕麥木聚糖以及PNP(對硝基苯基)-纖維二糖糖苷具有高的降解能力。然而，該酶不能降解可溶性淀粉和羧甲基纖維素。因此，確認了本發(fā)明的木聚糖酶為不具有纖維素酶活性的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶。另外，確認了本發(fā)明的木聚糖酶具有能夠切割PNP-木吡喃糖苷的木糖置換活性。

從上述結(jié)果確認了本發(fā)明的木聚糖酶適合作為飼料添加劑，以提高包含在主要用于動物生長的植物谷物飼料中的木聚糖的降解。

非反芻動物(如豬和雞)的飼料不具有能夠降解植物細胞壁的酶，使得包含在谷物中的淀粉或蛋白的使用效率降低。本發(fā)明的飼料添加劑能夠使木聚糖(細胞壁的主要成分)糖化，從而當非反芻動物(如豬和雞)的飼料中包含該飼料添加劑時，能夠提高飼料的價值。

本發(fā)明的飼料添加劑的活性成分木聚糖酶優(yōu)選以相對于飼料總重量的0.01重量份-10重量份的濃度、更優(yōu)選以0.05重量份-5重量份的濃度、且最優(yōu)選以0.12重量份的濃度包含在飼料中。

上述飼料添加劑還可包含非反芻動物可接受的載體。在本發(fā)明中，可將飼料添加劑按原樣獨立添加、或與所建議的載體和穩(wěn)定劑等一起添加。如果需要的話，還可向其中添加各種營養(yǎng)素(如維生素、氨基酸和礦物質(zhì))、抗氧化劑和其它添加劑?？蓪暳咸砑觿┡渲瞥缮?、顆粒劑、丸劑和混懸劑等的形式。當向非反芻動物給予本發(fā)明的飼料添加劑時，可將該飼料添加劑獨立提供或混合在飼料中提供。

因此，與對應于糖苷水解酶家族10(GH10)結(jié)構(gòu)域的酶同源并包含作為底物結(jié)合域的碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2，CBM2)結(jié)構(gòu)域的新型木聚糖酶(分離自鏈霉菌菌株HY-14)可被用于各個領域中，例如，用于包括物理性質(zhì)改善和寡糖生產(chǎn)工藝的食品行業(yè)中、用于具有提高的飼料谷物可用性的飼料行業(yè)中以及用于包括紙漿和生物能源原材料的預處理(可以作為化學工藝的替代)的預處理工藝中。因此，本發(fā)明的酶對于如下而言可以是有用的酶：開發(fā)使用酶的環(huán)保工藝、通過改善消化效率來照料牛的健康以及提高各種谷物或谷物副產(chǎn)品的附加價值。

如以下實施例所示，本發(fā)明的實踐的和當前優(yōu)選的實施方式是示例性的。

然而，應當理解的是，本領域技術人員在考慮了本公開內(nèi)容的情況下，可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進行修改和改進。

實施例

實施例1：鏈霉菌菌株的分離和鑒定

為了分離產(chǎn)生木聚糖酶的微生物，本發(fā)明人進行了以下實驗，以從東方螻蛄的共生的腸道微生物中分離具有水解木聚糖的酶活性的微生物。

具體而言，將收集的東方螻蛄在70％(w/w)乙醇中浸泡1分鐘-2分鐘，以將該昆蟲表面上的任何污染物除去。用無菌蒸餾水洗滌昆蟲軀體兩次，以除去乙醇。將昆蟲解剖，用鑷子將腸取出。將腸放置到磷酸鹽緩沖鹽水(0.8％NaCl、0.02％KCl、0.144％Na₂HPO₄、0.024％KH₂PO₄)中并粉碎。為了分離能夠水解木聚糖的微生物，使用Difco^TM R2A瓊脂(BD)作為基礎培養(yǎng)基，并用補充有2g/L的偶氮木聚糖(Megazyme)的培養(yǎng)基來制備選擇培養(yǎng)基。通過使用連續(xù)稀釋法，將含有經(jīng)粉碎的腸的微生物懸浮液稀釋于PBS中，將其以各100μl分配到選擇培養(yǎng)基中，隨后在25℃下培養(yǎng)48小時。將顯示出由偶氮木聚糖的降解所形成的清晰的環(huán)的微生物菌落從各培養(yǎng)基中選擇性地進行收集。

為了鑒定分離的微生物，在30℃于120rpm下在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時。通過在6,000rpm下將培養(yǎng)基離心10分鐘來回收細胞。通過NucleoSpin組織試劑盒(Machery-Nagel)從所獲得的細胞中提取基因組DNA。通過使用上述引物[27F引物：5’-AGACTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ.ID.NO:4)；1492R引物：5’-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3’(SEQ.ID.NO:5)]，用16S rDNA序列進行PCR。PCR反應混合物的總體積為50μl，且組成如下：1μl的總DNA(50ng/μl-200ng/μl)、5μl的10X Taq DNA聚合酶緩沖液(含有MgCl₂)、5μl的2.5mM dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、5μl的各引物(3.2pmol)以及1單位-2單位的Taq DNA聚合酶(Promega，USA)。添加足夠多的蒸餾水以使反應混合物的總體積達到50μl。按照如下進行PCR反應：在94℃下預變性5分鐘，在94℃下變性30秒，在65℃下退火30秒，在72℃下延伸3分鐘，從變性到延伸進行30個循環(huán)，在72℃下終延伸7分鐘。然后，將PCR產(chǎn)物保持在4℃下。通過使用ABI prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready反應試劑盒和ABI 3730x1DNA分析儀(Applied Biosystems)，對獲得自上述PCR的16S rDNA序列進行分析。

通過使用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST程序和EzTaxon server Genbank，對獲得的16S rDNA的序列(GenBank登錄號JQ943651)進行分析。結(jié)果，將其鑒定為鏈霉菌，本發(fā)明人將其命名為鏈霉菌菌株HY-14，并保藏于作為國際保藏單位的韓國生物科學與生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(保藏號：KCTC 12531BP)。

實施例2：木聚糖酶基因的確定

為了找到實施例1中分離的鏈霉菌菌株HY-14(保藏號：KCTC 12531BP)的能夠降解木聚糖的基因，如圖1所示，通過使用基于上述菌株的基因組DNA的GH10(糖苷水解酶家族10)木聚糖酶基因保守序列(WDVVNE，ITELDI)構(gòu)建的引物，對編碼木聚糖酶(XylU)蛋白(SEQ.ID.NO:1)的多核苷酸序列(SEQ.ID.NO:12)進行擴增。

特別是，從上述菌株分離基因組DNA。通過使用基因組DNA作為模板用如下進行PCR：10×緩沖液(MgCl₂)、2.5mM dNTPs、5×緩沖液、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)以及引物[GF-10引物：5’-TGGGACGTCSTCAACGAG-3’(SEQ.ID.NO:6)；GR-10引物：5’-GATGTCGAGCTCSGTGAT-3’(SEQ.ID.NO:7)]。此時，PCR條件如下：在95℃下預變性5分鐘，在95℃下變性30秒，在50℃下退火30 秒，在72℃下延伸40秒，從變性到延伸進行35個循環(huán)，在72℃下終延伸7分鐘。使用DNA Walking SpeedUp premix試劑盒(Seegene，韓國)，用獲得的351bp PCR產(chǎn)物進行基因組步移和巢式PCR。結(jié)果，獲得對應于總的木聚糖酶基因(XylU)的PCR產(chǎn)物。使用含有NdeI和HindIII位點的引物[F-GN引物：5’-CATATGGCCGACACGCTGGGCTC-3’(SEQ.ID.NO:8)；R-GH引物：5’-AAGCTTTCACGACGCCGTGCAGG-3’(SEQ.ID.NO:9)]，用由DNA步移獲得的總序列，按照如下進行PCR：在95℃下預變性5分鐘，在95℃下變性30秒，在62℃下退火30秒，在72℃下延伸40秒，從變性到延伸進行35個循環(huán)，在72℃下終延伸7分鐘。結(jié)果，獲得含有限制性酶切位點的XylU PCR產(chǎn)物。為了確定碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2；CBM2，SEQ.ID.NO:3)敲除的木聚糖酶(XylUΔCBM2)基因，使用含有NdeI和HindIII位點的引物[F-GN1引物：5’-CATATGGCCGACACGCTGGGCTC-3’(SEQ.ID.NO:10)；R-GH1引物：5’-AAGCTTTCAGGCGGCACCGGTGT-3’(SEQ.ID.NO:11)]用總的XylU基因序列根據(jù)如下進行PCR：在95℃下預變性5分鐘，在95℃下變性30秒，在54℃下退火30秒，在72℃下延伸40秒，從變性到延伸進行35個循環(huán)，在72℃下終延伸7分鐘。結(jié)果，獲得含有限制性酶切位點的XylUΔCBM2PCR產(chǎn)物。

如圖2所示，使用NCBI數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)blast調(diào)查(protein blast survey)，對擴增的基因序列進行分析，并對氨基酸序列進行研究。然后，確認了木聚糖酶(XylU)具有對應于處于N-末端的糖苷水解酶-10結(jié)構(gòu)域(GH-10結(jié)構(gòu)域，SEQ.ID.NO:2)的活性結(jié)構(gòu)域和處于C末端的碳水化合物結(jié)合域家族2(纖維素結(jié)合域家族2；CBM2，SEQ.IF.NO:3)。由基因測序也確認了該酶具有1,350bp開放性閱讀框(ORF)編碼的蛋白質(zhì)(由449個氨基酸組成)，并具有46,774Da的分子量。該酶的pI值被確認為6.24(圖2)。在SignalP 3.0數(shù)據(jù)庫中，對分泌信號區(qū)域進行了研究。結(jié)果，確認了木聚糖酶由419個氨基酸組成，分子量為43,838Da，且pI值為5.82。

實施例3：木聚糖酶重組載體的構(gòu)建

進行如下實驗，以克隆在實施例2中獲得的總的XylU和XylUΔCBM2。

具體而言，通過使用NucleoSpinGel和PCR Clean-up試劑盒(Machery-Nagel)對上述獲得的PCR產(chǎn)物進行純化，隨后在pGEM-T easy載體(Promega，Madison，USA)中連接。用上述載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α，然后從補充有氨芐青霉素的LB瓊脂平板中對轉(zhuǎn)化菌株進行選擇。從所選擇的轉(zhuǎn)化菌株中分離和純化重組的pGEM-T載體，將其命名為“pGEM-T-XylU”和“pGEM-T-XylUΔCBM2”。用NdeI和HindIII對pGEM-T-XylU和pGEM-T-XylUΔCBM2進行消化，然后通過使用NucleoSpinGel和PCR Clean-up試劑盒(Machery-Nagel)對XylU和XylUΔCBM2基因進行純化。另外用NdeI和HindIII對表達載體pET-28a(+)(Novagen，USA)進行消化，隨后進行純化。在1單位的連接酶(TaKaRa)的存在下，使純化的XylU和XylUΔCBM2基因以及表達載體pET-28a(+)各100ng在16℃下反應16小時。連接完成后，用重組表達載體pET-28a(+)對大腸桿菌BL21(Novagen)進行轉(zhuǎn)染。從含有卡那霉素的平板中選擇菌落。從選擇的菌株中對重組表達載體pET-28a(+)進行純化，隨后用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進行消化。確定含有XylU和XylUΔCBM2基因片段的載體。最后，通過測序確定XylU和XylUΔCBM2重組表達載體。

將確定的XylU和XylUΔCBM2重組表達載體命名為“pET-XylU”和“pET-XylUΔCBM2”。

實施例4：木聚糖酶蛋白的純化

在大腸桿菌中過表達實施例3中制備的重組表達載體pET-XylU和pET-XylUΔCBM2。然后，進行以下實驗以將重組蛋白XylU(rXylU)和XylUΔCBM2(rXylUΔCBM2)分離和純化。

具體而言，將轉(zhuǎn)染有上述各表達載體的大腸桿菌接種在液體LB培養(yǎng)基中，隨后在37℃下振蕩培養(yǎng)。當各大腸桿菌培養(yǎng)液的OD₆₀₀達到0.4-0.5時，向其中添加1.0mM的IPTG，隨后在30℃下振蕩培養(yǎng)5小時。通過將培養(yǎng)溶液離心，收集細胞。通過超聲處理對細胞進行裂解，以獲得包涵體。用含有20mM咪唑和0.5M氯化鈉的20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)將所獲得的包涵體溶解。通過使用150mM-200mM的咪唑，使溶解的細胞裂解物于5ml的His-trap HP柱(GE Healthcare，英國)中重新折疊，隨后進行純化。然后，使用LC系統(tǒng)(GE Healthcare，英國)進行液相色譜(LC)。另外，使用HiLoad 26/60Superdex 200prep-grade(GE Healthcare，英國)進行凝膠滲透色譜，這為本領域技術人員公知的方法。通過12％SDS-PAGE對純化的rXylU和rXylUΔCBM2蛋白進行確認。通過使用Bradford試劑(Bio-Rad，美國)，對純化的rXylU和rXylUΔCBM2蛋白進行定量。將定量的蛋白冷凍干燥并儲存在-20℃。

結(jié)果，如圖3所示，確認了rXylU和rXylUΔCBM2的分子量分別為44.0kDa和33.0kDa的(圖3)。

實施例5：木聚糖酶的生化特性的分析

<5-1>木聚糖酶的酶活性的測量

進行以下實驗，以對實施例4中分離的rXylU和rXylUΔCBM2的酶活性和最佳反應條件(pH和溫度)進行研究。

具體而言，將樺木木聚糖用作研究底物。為了研究酶活性的最佳pH，用50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.0-5.5)、50mM磷酸鈉緩沖液(pH 5.5-7.5)、50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5-9.0)以及50mM甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0-10.5)在60℃下誘發(fā)反應15分鐘，隨后測量酶活性。

為了測量酶活性，使用了DNS(二硝基水楊酸)定量方法(Miller GL，Anal.Chem.，55:952-959，1959)。確切地說，將逐步稀釋的100μl酶溶液加入到含有1％(w/v)山毛櫸木聚糖的50mM甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0)中，隨后在55℃下反應15分鐘。向其中加入750μl的DNS(3,5-二硝基水楊酸)溶液。將混合溶液在100℃靜置5分鐘，并對OD₅₄₀進行測量。將1單位的酶確定為1分鐘內(nèi)能夠釋放1μmol還原糖的酶的量。

為了確認酶的最佳反應溫度，在40℃-75℃，以5℃的間隔對酶活性進行了測量。為了研究取決于溫度的穩(wěn)定性，在30℃-75℃將反應混合物置于50mM磷酸鈉緩沖液(pH 5.5)中1小時。然后，在60℃誘發(fā)反應10分鐘，并測量酶活性。

結(jié)果，如圖4所示，在pH 5.5(圖4a)和65℃(圖4b)下，rXylU 和rXylUΔCBM2的酶活性最高。在5.0-7.5之間的pH下，最大酶活性持續(xù)為至少80％。rXylUΔCBM2的酶活性在60℃下于1小時內(nèi)持續(xù)為70％(圖4c)。

<5-2>木聚糖酶的底物特異性

進行以下實驗，以對實施例4中分離的XylU降解各種木聚糖和糖底物的能力進行研究。

具體而言，用各種木糖聚合物(如山毛櫸木聚糖、樺木木聚糖、斯卑爾脫燕麥木聚糖)、聚合物(如淀粉、果膠、葡聚糖)以及5mM PNP(對硝基苯基)糖衍生物，對底物特異性進行研究。通過如實施例<5-1>所述的相同的方式，將含有木聚糖酶的酶溶液(0.05ml)(稀釋于包含各底物(1％w/v)的50mM甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0)中)的標準分析混合物(0.5ml)用于在45℃下誘發(fā)酶反應10分鐘。通過在標準分析條件下，經(jīng)由1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol還原糖或PNP所必需的酶的量而確定的單位，定義對于木聚糖或PNP-糖底物而言的木聚糖酶活性。

結(jié)果，如表1所示，在木聚糖中，木聚糖酶(XylU)最有效地水解了斯卑爾脫燕麥木聚糖，隨后依次為山毛櫸木聚糖、樺木木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖。在PNP(對硝基苯基)底物中，對于PNP-纖維二糖糖苷而言的酶活性是所有中最高的(表1)。

【表1】

對于各種木聚糖和糖底物而言的XylU的降解活性

ND：未檢出

U/mg：以三重復實驗所獲得的每蛋白單位重量的酶活性單位

<5-3>由木聚糖酶獲得的木聚糖降解產(chǎn)物的特性

對木聚糖降解產(chǎn)物進行分析，以對實施例4中分離的XylU的酶特性進行研究，為此進行以下實驗。

具體而言，通過如實施例<5-1>所述的相同的方式，用樺木木聚糖(BX)、木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)和木五糖(X5)作為底物，誘發(fā)實施例4中分離的XylU的酶反應。將反應混合物在100℃下加熱5分鐘以終止酶反應。然后，使用Asahipak NH2P-50 2D柱(5μm，2.0×150mm，Shodex)，使水解產(chǎn)物進行高效液相色譜(HPLC)(流動相：洗脫溶液A，0.05％甲酸/無菌水；洗脫溶液B，0.05％甲酸/無菌水:乙腈/甲醇＝6:4)。

結(jié)果，如表2所示，樺木木聚糖的水解產(chǎn)物為X2(83.9％，w/v)和X3(11.0％，w/v)；木三糖(X3)的水解產(chǎn)物為X2(76.2％，w/v)和X3(20.0％，w/v)；木四糖(X4)的水解產(chǎn)物為X2(82.4％，w/v)、X3(13.5％，w/v)和X4(0.3％，w/v)；木五糖(X5)的水解產(chǎn)物為X2(80.0％，w/v)、X3(16.4％，w/v)和X4(0.3％，w/v)；以及木六糖(X6)的水解產(chǎn)物為X2(76.1％，w/v)、X3(20.7％，w/v)和X4(0.4％，w/v)。從上述結(jié)果確認了，上述木聚糖酶具有內(nèi)切-木聚糖酶的典型活性(表2)。

【表2】

木聚糖酶(XylU)降解的木聚糖降解產(chǎn)物的LC結(jié)果

【保藏號】

保藏機構(gòu)：韓國生物科學與生物技術研究所

保藏號：KCTC 12531BP

保藏日：2013年12月16日