一種6?芐氨基嘌呤的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種6-芐氨基嘌呤的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

當(dāng)組織器官血液供應(yīng)不足時，常導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能障礙甚至發(fā)生壞死，然而血流的迅速恢復(fù)會進(jìn)一步加重器官的損傷程度。腸是機(jī)體內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素的最大儲存庫，當(dāng)局部缺血再灌注損傷引發(fā)腸屏障功能破壞后會引起一系列疾病的發(fā)生，如膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合癥、大量器官機(jī)能障礙(肝、肺、腎等)，因此腸被認(rèn)為是引發(fā)機(jī)體器官系統(tǒng)異常的“馬達(dá)”。

小腸細(xì)胞極易受到局部缺血的影響，再灌注后會進(jìn)一步導(dǎo)致黏膜受損。在急性腸系膜缺血，出血性、外傷性、感染性休克或者嚴(yán)重?zé)齻约耙恍┦中g(shù)操作如小腸移植術(shù)、腹主動脈術(shù)等過程中常伴有局部缺血再灌注損傷發(fā)生。

目前，市場上有許多抗小腸損傷的物質(zhì)，但是大多數(shù)都有不易提取獲得、純度不高、有效成分不明確等缺點，給實際應(yīng)用帶來了很大的麻煩。因此，開發(fā)一種來源廣，純度高，成分明確，效果好，安全無毒無害的抗小腸損傷的物質(zhì)將是非常迫切且具有重要意義的任務(wù)。

6-芐氨基嘌呤(6-ba)成分明確，在酸堿中穩(wěn)定，來源廣、成分明確、純度高，可以作為植物生長調(diào)節(jié)劑使用，對動物體肝臟和腦組織也具有抗損傷效果，但是對小腸損傷的保護(hù)作用還未見報道，開發(fā)其在制備抗小腸組織損傷制品中的新應(yīng)用具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種6-芐氨基嘌呤的應(yīng)用，6-芐氨基嘌呤(6-ba)成分明確，在酸堿中穩(wěn)定，來源廣、成分明確、純度高，在制備抗小腸缺血再灌注損傷制品中的新應(yīng)用具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸組織損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細(xì)胞氧化損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸組織損傷食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細(xì)胞氧化損傷食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細(xì)胞凋亡食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第七個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸組織損傷保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第八個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細(xì)胞氧化損傷保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第九個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細(xì)胞凋亡保健品中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種6-芐氨基嘌呤的應(yīng)用，具有以下有益效果：

本發(fā)明證實了6-芐氨基嘌呤可以作為抗小腸局部缺血再灌注損傷的活性物質(zhì)，并且6-芐氨基嘌呤能有效防護(hù)小腸缺血再灌注引起的氧化損傷和小腸細(xì)胞凋亡，將其添加到藥物、食品或保健品當(dāng)中，抑制小腸組織損傷，延緩衰老抗疲勞，增強(qiáng)小腸組織抗缺血再灌注損傷的能力，具有重要的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是不同組大鼠小腸細(xì)胞dna凝膠電泳結(jié)果(×200)；

其中，圖1a為對照組，圖1b為i/r損傷模型組，圖1c為低劑量6-ba保護(hù)組，圖1d為高劑量6-ba保護(hù)組；

圖2是不同組大鼠小腸細(xì)胞caspase-3表達(dá)情況(×400)；

其中，圖2a為對照組，圖2b為i/r損傷模型組，圖2c為低劑量6-ba保護(hù)組，圖2d為高劑量6-ba保護(hù)組。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例

1.藥品與試劑

6-芐氨基嘌呤(6-ba)，購于廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司，由美國sanland公司生產(chǎn)，用0.06mol/l的鹽酸配制成1000mg/l、2000mg/l的儲備液；丙二醛(mda)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(t-sod)檢測試劑盒和考馬斯亮蘭試劑盒，均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。低熔點瓊脂糖，sigma；兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體，abcam；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

2.動物分組

雄性sd大鼠80只，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。適應(yīng)環(huán)境7d后，隨機(jī)分為4組，每組20只。依次為對照組、i/r損傷模型組(按照常規(guī)方法獲得i/r損傷模型組，此處不再詳述)、低劑量6-ba保護(hù)組和高劑量6-ba保護(hù)組。低劑量6-ba保護(hù)組于術(shù)前3周連續(xù)灌胃6-ba，每天一次按照10mg/kg大鼠的量灌胃一次；高劑量6-ba保護(hù)組于術(shù)前3周連續(xù)灌胃6-ba，每天一次按照20mg/kg大鼠的量灌胃一次；對照組和i/r損傷模型組給予同體積的生理鹽水灌胃。

動物術(shù)前12h禁食，不禁水，以3％戊巴比妥鈉(1ml/kg)腹腔注射麻醉。固定后取腹正中切口，對照組在開腹顯露腸系膜上動脈后不作阻斷；i/r損傷模型組、低劑量6-ba保護(hù)組和高劑量6-ba保護(hù)組則均用無創(chuàng)動脈夾阻斷其系膜血管30min后再灌注60min。實驗結(jié)束后，立即剪取空腸標(biāo)本待用。

3.6-ba對大鼠小腸i/r損傷后t-sod、gsh-px活性和mda含量的影響

3.1t-sod活力、gsh-px活力和mda含量測定方法

制作10g/100ml小腸組織勻漿，用生理鹽水稀釋成1g/100ml小腸組織勻漿液后參照總超氧化物歧化酶(t-sod)檢測試劑盒說明操作，最后用紫外可見分光光度計在550nm處比色，測定吸光度，計算t-sod活力。

取10g/100ml小腸組織勻漿用生理鹽水稀釋成0.8g/100ml的小腸組織勻漿液后，參照谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)檢測試劑盒說明操作，最后用紫外可見分光光度計在412nm處比色，測定吸光度，計算gsh-px活力。

取10g/100ml小腸組織勻漿用生理鹽水稀釋成5g/100ml勻漿液后通過tba法參照丙二醛(mda)檢測試劑盒說明操作，最后用紫外可見分光光度計在532nm處比色，測定吸光度，計算mda含量。

3.26-ba對大鼠小腸i/r損傷后t-sod活力、gsh-px活力和mda含量的影響

各組t-sod、gsh-px活力和mda含量的測定結(jié)果見表1。與對照組相比，i/r損傷模型組大鼠t-sod、gsh-px的活力顯著降低(p<0.05)，mda含量顯著升高(p<0.05)，證實i/r損傷模型復(fù)制成功。低劑量6-ba保護(hù)組和高劑量6-ba保護(hù)組大鼠小腸組織t-sod活力和gsh-px活力顯著高于i/r損傷模型組(p<0.05)，mda含量顯著低于i/r損傷模型組(p<0.05)。高劑量6-ba組的mda含量與對照組間無顯著差異。

表1結(jié)果顯示，6-ba可以顯著修復(fù)小腸組織損傷造成的t-sod活力、gsh-px活力下降問題，可以修復(fù)小腸組織損傷造成的mda含量升高的問題，且高劑量的6-ba修復(fù)效果高于低劑量的6-ba。

表16-ba對大鼠小腸i/r損傷后t-sod、gsh-px活性和mda含量的影響(mean±sd，n＝7)

注：同列數(shù)據(jù)間標(biāo)有不同字母表示差異顯著(p<0.05)

4.6-ba對大鼠小腸i/r損傷后dna損傷的影響

4.1單細(xì)胞凝膠電泳法檢測大鼠小腸dna損傷

分別取對照組、i/r損傷模型組、低劑量6-ba保護(hù)組和高劑量6-ba保護(hù)組的空腸，制作小腸單細(xì)胞懸液，保存?zhèn)溆谩?0℃、0.75％的正常熔點的瓊脂糖100μl鋪于全磨砂載玻片上，放入37℃烘箱過夜烘干后作為底層膠；再取上述50℃、0.75％瓊脂糖110μl加在底膠上，水平放于4℃冰箱中保存20min至凝固，作為第二層膠；吸取70μl制備好的小腸單細(xì)胞懸液和140μl在37℃水浴中保溫的0.65％的低熔點瓊脂糖混勻，吸取混勻液110μl滴加在第二層膠上，水平放于4℃冰箱中保存20min至凝固，作為第三層膠。將制備好的膠板浸入細(xì)胞裂解液，4℃裂解1h，然后置于電泳槽中加入電泳緩沖液，4℃解旋25min，電泳20min，電泳條件為20v，200ma。電泳結(jié)束后加入中和液中和15min，然后滴加10mg/l的eb水溶液40μl，染色10min。在暗室中用熒光顯微鏡觀察并拍照。每組隨機(jī)選取3張膠片，每張顯微鏡下隨機(jī)選取8個視野，將彗星尾長>35μm視為拖尾，采用casp軟件測量各組細(xì)胞彗星尾部dna含量、彗星尾長并統(tǒng)計拖尾率。

其中，每升細(xì)胞裂解液的配方是：2.5mol/lnacl、100nmol/lna2edta、10nmol/ltris，10g/l肌氨酸鈉，臨用前加體積分?jǐn)?shù)為1％的tritonx-100，10％dmso，溶劑為超純水，ph＝10。每升電泳緩沖液的配方是：lmmol/lna2edta，300mmol/lnaoh，ph＝13，溶劑為超純水，4℃預(yù)冷備用。每升中和液的配方是：0.4mol/l的tris-hcl，溶劑為超純水，ph＝7.5。

各組大鼠小腸細(xì)胞dna損傷程度見圖1，其中圖1a為對照組，圖1b為i/r損傷模型組，圖1c為低劑量6-ba保護(hù)組，圖1d為高劑量6-ba保護(hù)組，由圖1可知，對照組細(xì)胞核大小比較均一，為圓形熒光團(tuán)，熒光強(qiáng)度均勻，邊緣光滑，未出現(xiàn)明顯彗星狀拖尾；i/r損傷模型組小腸dna損傷嚴(yán)重、彗星頭部較其它組變小，出現(xiàn)明顯彗星狀尾巴；低劑量6-ba保護(hù)組和高劑量6-ba保護(hù)組小腸細(xì)胞dna拖尾減輕，尾長減小，且高劑量6-ba保護(hù)組的小腸細(xì)胞dna拖尾減輕幅度更大，尾長明顯減小。

各組細(xì)胞尾部dna含量和拖尾率見表2。由表2可知，與對照組相比，i/r損傷模型組細(xì)胞尾部dna含量和拖尾率顯著升高(p<0.05)。與模型組相比，低劑量6-ba保護(hù)組和高劑量6-ba保護(hù)組顯著降低尾部dna含量和拖尾率(p<0.05)，且高劑量6-ba保護(hù)組降低幅度更大。上述結(jié)果表明，6-ba可以顯著修復(fù)大鼠小腸i/r引發(fā)的dna損傷，較少小腸細(xì)胞凋亡。

表26-ba對大鼠小腸i/r損傷后dna損傷的影響(mean±sd，n＝5)

注：同列數(shù)據(jù)間標(biāo)有不同字母表示差異顯著(p<0.05)

5.6-ba對大鼠小腸i/r損傷后caspase-3表達(dá)的影響

5.1免疫組化法檢測大鼠小腸凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)水平

采用免疫組化法檢測大鼠小腸組織切片中caspase-3(1:200)蛋白表達(dá)。參照免疫組化試劑盒，嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行。一抗4℃過夜，以pbs做陰性對照。dab染色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥。光學(xué)顯微鏡下觀察到組織細(xì)胞中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性。

各組大鼠小腸i/r損傷后caspase-3表達(dá)情況見圖2，其中，圖2a為對照組，圖2b為i/r損傷模型組，圖2c為低劑量6-ba保護(hù)組，圖2d為高劑量6-ba保護(hù)組。與對照組相比，i/r損傷模型組大鼠小腸i/r損傷后caspase-3免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多；而低劑量6-ba保護(hù)組和高劑量6-ba保護(hù)組caspase-3陽性率明顯弱于i/r損傷模型組，證實6-ba明顯改善了小腸缺血再灌注誘發(fā)的小腸組織損傷。

i/r損傷是由缺血組織或者器官在恢復(fù)血流灌注后，產(chǎn)生的組織或器官損傷加重的現(xiàn)象，i/r損傷主要是由于再灌注期間，自由基的大量生成、炎癥反應(yīng)、凋亡等引起的。上述實驗證明大量實驗證實了6-芐氨基嘌呤可以作為抗小腸局部缺血再灌注損傷的活性物質(zhì)，并且6-芐氨基嘌呤能有效防護(hù)小腸缺血再灌注引起的氧化損傷和小腸細(xì)胞凋亡，將其添加到藥物、食品或保健品當(dāng)中，抑制小腸組織損傷，延緩衰老抗疲勞，增強(qiáng)小腸組織抗缺血再灌注損傷的能力，具有重要的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價值。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。