一種pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法

一種pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法。本發(fā)明采用混酸氧化后的碳納米管為載體，抗腫瘤藥物通過作用負(fù)載在碳納米管表面，接著采用RGD偶聯(lián)的殼聚糖對(duì)碳納米管表面進(jìn)一步修飾制備得到pH敏感型的碳納米管革E向遞藥載體。碳納米管載體載藥量高，通過殼聚糖的修飾和RGD靶向?qū)б碾p重作用將藥物傳遞腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)藥物在低pH的腫瘤細(xì)胞環(huán)境中的釋放，使藥物在腫瘤組織濃度增加，殺傷腫瘤細(xì)胞，增加抗腫瘤效果，降低毒副作用。本發(fā)明公開的制備方法操作簡(jiǎn)單、制備條件溫和，產(chǎn)物易得、可靠，后處理簡(jiǎn)單，.適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種藥物靶向傳遞體系的制備，具體涉及一種pH 敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見疾病之一。目前主要的治療方 法包括手術(shù)、化療和放療，化學(xué)藥物治療是目前腫瘤的常用治療方法。由于大多數(shù)抗腫瘤藥 物缺少對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性，在化療殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)殺傷正常細(xì)胞，毒副作用較 大?；熕幬锿ㄟ^注射途徑進(jìn)入全身血液循環(huán)后要經(jīng)過同蛋白結(jié)合、代謝、排泄等步驟，藥 物到達(dá)腫瘤部位的藥物較少。要提高腫瘤組織內(nèi)化療藥物濃度就必須提高達(dá)到腫瘤細(xì)胞藥 物的濃度，腫瘤靶向給藥體系可以解決這一問題。利用制劑新技術(shù)，研究一種新型抗腫瘤藥 物的遞藥體系，可以提高對(duì)靶細(xì)胞的指向性，增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，同時(shí)減小對(duì)正常 細(xì)胞的毒副作用。
[0003] 碳納米管（CNT)從發(fā)現(xiàn)以來就以其獨(dú)特的性質(zhì)吸引廣大研究者的目光，近十年來 CNT在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究越來越多。人們利用CNT特殊的物理化學(xué)性質(zhì)研究其作為藥物 載體的應(yīng)用。碳納米管作為全新而有效的藥物釋放體系有利于提高各種藥物療效。單壁碳 納米管（SWCNT)具有納米尺度的圓柱形孔洞，有很強(qiáng)的吸附能力，其空腔管體或者表面可 容納生物特異性分子及藥物，SWCNT可以穿透細(xì)胞膜載送生物活性分子及藥物到達(dá)細(xì)胞。但 是由于碳納米管之間的范德華力很強(qiáng)易團(tuán)聚成束，使其分散性較差，影響其生物相容性，因 而提高SWCNT的分散性和生物相容性是研究其作為藥物載體的前提。
[0004] 殼聚糖（CS)是一種天然多糖，以其良好的生物相容性、體內(nèi)可降解性以及與腫瘤 組織的親和性，已成為抗腫瘤藥物新制劑的理想輔料。殼聚糖中存在可供反應(yīng)的氨基適于 修飾CNT，也可以與藥物靶向配體連接；殼聚糖的親水性和陽離子電荷可以增加 CNT在水中 的穩(wěn)定性；殼聚糖是天然高分子中少有的堿性多糖，不溶于水和有機(jī)溶劑。采用殼聚糖修飾 CNT能增加遞藥體系的生物相容性，不過作為一種腫瘤用藥體系，還需具有較好的靶向性。
[0005] RGD肽是一種含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp)的短肽，作為整合素 αvβ3和其配體相互作用的識(shí)別位點(diǎn)，介導(dǎo)外源物與細(xì)胞之間的相互作用。腫瘤細(xì)胞或者 新生血管可以特異表達(dá)某些整合素如a v β 3,能以一定的親和力結(jié)合RGD肽，成為腫瘤治 療的新祀點(diǎn)。
[0006] 至今未見將RGD肽用于碳納米管遞藥體系的報(bào)道，同時(shí)作為腫瘤遞藥體系，還需 具有pH響應(yīng)性與優(yōu)異的生物相容性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，由此制 備的遞藥體系在水中分散性較好，生物相容性好，藥物負(fù)載能力高；該遞藥體系抗腫瘤效果 好，具有明顯的腫瘤細(xì)胞靶向能力和控制藥物釋放的能力，且其制備方法操作簡(jiǎn)單、易得、 可靠。
[0008] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的： 一種pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，包括如下步驟： (1) 將碳納米管加入濃硫酸和濃硝酸的混合酸溶液中，超聲分散后在80°C條件下攪拌 得到混合物，將混合物過濾，再將得到的濾餅洗滌后真空干燥，制得氧化的碳納米管； (2) 將氧化的碳納米管加入抗癌藥物溶液中，超聲分散后加入pH值為7. 0-7. 5的磷酸 鹽緩沖液形成混合液；混合液經(jīng)超聲處理后離心分離，再將得到的固體洗滌后干燥，得到載 藥的碳納米管； (3) 將R⑶肽和醋酸處理后的殼聚糖溶于醇中得到混合溶液；混合溶液于60°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)10-30分鐘，然后加入蒸餾水，再透析48h后得到RGD偶聯(lián)殼聚糖的接枝物溶液； (4) 將載藥的碳納米管加入RGD偶聯(lián)殼聚糖的接枝物溶液中形成混合物；混合物超 聲分散后，于攪拌條件下過夜；然后將混合物離心分離，得到的固體經(jīng)洗滌、冷凍干燥得到 RGD偶聯(lián)殼聚糖修飾的載藥碳納米管，即pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系。
[0009] 上述技術(shù)方案中，步驟（1)中，碳納米管為單壁碳納米管，其直徑為l-10nm，長(zhǎng)度 為 l_5Mm。
[0010] 上述技術(shù)方案中，步驟（1)的混合酸溶液中，濃硫酸和濃硝酸的體積比為1 : (1-3)?？梢赃x用濃度為98%的&504和65 %的ΗΝ03。
[0011] 上述技術(shù)方案中，步驟（2)中，抗癌藥物為多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、柔紅霉素 中的一種；抗癌藥物與氧化碳納米管的質(zhì)量比為1 : (2-4);抗癌藥物溶液中，溶劑為甲醇。
[0012] 上述技術(shù)方案中，步驟（2)中，超聲處理混合溶液的條件是超聲功率為200-400W ; 處理時(shí)間為l-5min。
[0013] 上述技術(shù)方案中，步驟（3)中，殼聚糖的分子量為5-6萬；醇為甲醇。
[0014] 上述技術(shù)方案中，步驟（4)中，載藥碳納米管和R⑶偶聯(lián)殼聚糖的接枝物的質(zhì)量比 為 1 : (2-4)。
[0015] 上述技術(shù)方案中，所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的直徑為10-20 nm，長(zhǎng)度 為 200-500 nm。
[0016] 本發(fā)明首先制得表面帶有羧基的碳納米管，然后通過物理吸附及η---作用成功 將具有芳環(huán)類結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物負(fù)載到SWCNT上，隨后將RGD偶聯(lián)的殼聚糖修飾在碳納米 管的表面，使碳納米管的分散性和生物相容性增加，并具有較好的靶向作用，該制備方法操 作簡(jiǎn)單可行可靠，原料易得。所得到的碳納米管載體載藥量高，藥物具有明顯的pH相應(yīng)性 釋放，具有明顯的腫瘤細(xì)胞靶向能力，體內(nèi)外抗腫瘤效果好，為新型碳納米管靶向遞藥體系 的研究提供理論依據(jù)。
[0017] 由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)： (1)本發(fā)明將RGD偶聯(lián)的殼聚糖修飾在負(fù)載抗腫瘤藥物的碳納米管的表面，首次公開 了碳納米管/殼聚糖/RGD遞藥體系，其在水中分散性較好，生物相容性好，藥物負(fù)載能力 高；并且該遞藥體系具有pH敏感性，抗腫瘤效果好，具有明顯的腫瘤細(xì)胞靶向能力和控制 藥物釋放的能力。
[0018] (2)本發(fā)明公開的pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系中，碳納米管具有大π共軛體 系，可以很容易負(fù)載，結(jié)構(gòu)中存在芳環(huán)的抗腫瘤藥物，且載藥量高。
[0019] (3)本發(fā)明公開的pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系中，殼聚糖改善了 CNT的分散 性和生物相容性；同時(shí)使得遞藥體系具有pH響應(yīng)性，藥物釋放具有pH依賴性，可以提高腫 瘤胞內(nèi)的有效藥物濃度，改善藥物的治療效果。
[0020] (3)本發(fā)明公開的pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系中，碳納米管遞藥載體上修飾 RGD肽作為靶向分子，RGD肽提高了載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，能實(shí)現(xiàn)碳納米管遞藥體系的 主動(dòng)靶向，從而提高腫瘤組織藥物濃度。
[0021] (4)本發(fā)明首先將藥物負(fù)載至碳納米管，未經(jīng)過殼聚糖修飾的碳納米管比表面積 更大，并且無其他相互作用力的影響，能增加藥物的負(fù)載量；再利用R⑶偶聯(lián)的殼聚糖修飾 載藥的碳納米管，RGD偶聯(lián)殼聚糖的后修飾能使靶向分子充分裸露發(fā)揮作用，也能增加殼聚 糖對(duì)藥物釋放行為的影響。
[0022] (5)本發(fā)明制備的pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系利用強(qiáng)的穿透細(xì)胞的能力和 主動(dòng)靶向性將藥物的帶入癌細(xì)胞中，利用pH敏感性促進(jìn)藥物在低pH的腫瘤細(xì)胞環(huán)境中的 釋放，使藥物在腫瘤組織濃度增加，提高了載體向腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)和胞內(nèi)藥物的 高濃度釋放，增加了體內(nèi)外的抗腫瘤作用，從而提高藥物的治療效果，并能減少對(duì)正常組織 的毒性。
[0023] (6)本發(fā)明公開的制備方法操作簡(jiǎn)單、制備條件溫和，產(chǎn)物易得、可靠，后處理簡(jiǎn) 單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為實(shí)施例一中單壁碳納米管，多西他賽和載藥碳納米管的紅外譜圖； 圖2為實(shí)施例一中氧化的碳納米管、載藥碳納米管SWCNT-DTX、pH敏感型載藥碳納米管 RGD-CS-SWCNT-DTX的透射電鏡圖； 圖3為實(shí)施例二中碳納米管靶向遞藥體系中藥物在不同pH條件的釋放曲線圖； 圖4為實(shí)施例三中碳納米管靶向遞藥體系對(duì)A549和MCF-7腫瘤細(xì)胞毒性結(jié)果圖； 圖5為實(shí)施例三中腫瘤細(xì)胞A549和MCF-7對(duì)碳納米管靶向遞藥體系攝取的定量分析 結(jié)果圖； 圖6為實(shí)施例四中碳納米管靶向遞藥體系在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述： 實(shí)施例一：pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備 (1) 將長(zhǎng)度為l_5Mm的單壁碳納米管加入強(qiáng)酸混合溶液中（98% H2S04和65 % ΗΝ03 體積比為1:1 )，超聲分散30 min，80°C油浴中機(jī)械攪拌下冷凝回流8 h，反應(yīng)結(jié)束后冷 卻靜置一段時(shí)間，去除上層酸液并用蒸餾水稀釋，經(jīng)〇. 22 μ m混合纖維素濾膜真空抽濾，濾 餅用大量去離子水洗滌至濾液pH值為中性，50°C真空干燥，得到截短的氧化的單壁碳納米 管（SWCNT); (2) 將氧化的單臂碳納米管分散于多西他賽（DTX)甲醇溶液中，藥物和氧化的單臂碳 納米管的質(zhì)量比例為1:3 ;混合物溶液超聲30 min，隨后逐滴加入pH7. 4的磷酸鹽緩沖液 (PBS)，然后采用細(xì)胞粉碎機(jī)超聲400W超聲2min，復(fù)合物溶液繼續(xù)磁力攪拌過夜，將混合物 經(jīng)10000 rpm離心10 min，移除上層清液，加入PBS或者甲醇洗滌，再此以相同條件離心。 用PBS (pH 7. 4)和甲醇各洗滌2次，以除去游離的多西他賽，產(chǎn)物置于真空干燥箱40°C烘 干，得到載藥的單壁碳納米管（SWCNT-DTX); (3) 將1%的醋酸處理過的殼聚糖（CS)和R⑶肽溶于甲醇溶液中，兩者質(zhì)量比例為5:1， 60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20 min，加入10 mL蒸餾水水化，所得溶液注入截留相對(duì)分子量為10KD的透 析袋中，在蒸餾水溶液中透析48 h，內(nèi)部溶液離心分離（3000gX30 min)，得到RGD偶聯(lián)殼 聚糖的接枝物溶液，溶液凍干后置于4°C保存； (4) 將步驟2中制得的載藥的碳納米管（10mg)分別分散于20 mL的RGD殼聚糖的接枝 物（1 mg/mL)溶液以及殼聚糖溶液（1 mg/mL)中，在室溫避光攪拌過夜，離心（10000 rpm) 水洗3-5次，冷凍干燥，制備得到RGD-CS-SWCNT-DTX，即pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系和 不含RGD的遞藥體系CS-SWCNT-DTX，稱為遞藥復(fù)合物。
[0026] 附圖1為上述單壁碳納米管，多西他賽和載藥碳納米管的紅外圖譜，紅外圖譜說 明是藥物多西他賽成功負(fù)載到單壁碳納米管上。
[0027] 附圖2為上述氧化的碳納米管（a)、載藥碳納米管SWCNT-DTX(b)、pH敏感型載藥 碳納米管RGD-CS-SWCNT-DTX(c)的透射電鏡圖，TEM圖表明殼聚糖成功的修飾SWCNT，也可 以看出pH敏感的碳納米管祀向遞藥體系的直徑在10-20 nm。
[0028] 實(shí)施例二：藥物體外釋放實(shí)驗(yàn) 將RGD-CS-SWCNT-DTX和DTX分別分散于pH 7. 4和pH 5. 0的PBS含0. 5%吐溫溶 液中，使上述四種樣品中DTX濃度均保持在一致（70 μ g/mL)。分別取2 mL的樣品溶液置于 截留分子量為8KD的透析袋中，將透析袋用透析夾夾緊后放入相應(yīng)的40 mL PBS緩沖溶液 中，置于37°C的水平恒溫振蕩器內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)透析(頻率為100 r/min)，并開始計(jì)時(shí)，每隔一 定時(shí)間后取0.5 mL透析液，同時(shí)補(bǔ)充0.5 mL新鮮PBS溶液，樣品平行3份并計(jì)算累積釋 放度。樣品離心后采用HPLC測(cè)定DTX的含量，附圖3為功能化SWCNT載藥體系中藥物的釋 放曲線，釋放曲線中可以看出原料藥在pH 7.4和pH5.0條件下釋放較一致，在72 h時(shí)累積 釋放達(dá)到18%左右，表明藥物本身不是pH依賴性的，而制備的RGD-CS-SWCNT-DTX遞藥復(fù)合 物在生理中性條件下藥物釋放49%，在弱酸性條件下藥物釋放達(dá)到了 68%，表明載藥復(fù)合物 中藥物的釋放具有pH依賴性。
[0029] 實(shí)施例三：腫瘤細(xì)胞體外試驗(yàn) ⑴細(xì)胞培養(yǎng)：選用整合素受體高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌A549和低表達(dá)的乳腺癌MCF-7 細(xì)胞，A549細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS)的PRMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，而MCF-7細(xì)胞用含有 10%FBS高糖DMB1培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0030] (2)腫瘤細(xì)胞存活率的檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和MCF-7細(xì)胞，按每孔8X 104 個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，將制備得到的碳納米管遞藥復(fù)合物（SWCNT-DTX， CS-SWCNT-DTX，RGD-CS-SWCNT-DTX)和原料藥DTX分別加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和MCF-7細(xì) 胞中，在37°C，5% C02條件下培養(yǎng)48h。培養(yǎng)中止時(shí)用PBS洗2次，每孔加入90 μ?的培 養(yǎng)基和10 μ? ΜΤΤ繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入100 μ? DMS0,于微型振蕩器上震 蕩10 min，30 min內(nèi)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570nm處測(cè)定其吸光度值，計(jì)算得到腫瘤細(xì)胞的 存活率。附圖4是藥物濃度為10 Pg/mL的碳納米管遞藥復(fù)合物與原料藥對(duì)兩種細(xì)胞毒性 的比較，由圖中可以看出載藥的SWCNT對(duì)A549、MCF-7的細(xì)胞毒性均有所增加，特別是帶有 RGD的碳納米管遞藥復(fù)合物能更有效的抑制腫瘤細(xì)胞；尤其RGD-CS-SWCNT-DTX對(duì)A549細(xì) 胞的抑制率達(dá)到66%，說明R⑶能選擇性的將DTX輸送入整合素受體高表達(dá)的A549細(xì)胞內(nèi) 部的能力，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0031] (3)遞藥載體復(fù)合物靶向性的檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以2X 105/mL接種 于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，培養(yǎng)24h，去除培養(yǎng)基，分別加入2 mL含CS-SWCNT-DTX (40 μ g/ mL)、RGD-CS-SWCNT-DTX (40 μ g/mL)的培養(yǎng)基以及空白培養(yǎng)基（陰性對(duì)照）共同孵育1，2， 4h，然后棄去培養(yǎng)基，用冷的PBS洗三次，用0. 25%的胰酶消化，lOOOrpm離心5min，收集細(xì) 胞，再用PBS洗2次后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞對(duì)功能化載藥碳納米管的攝取率。流式細(xì)胞 定量分析的結(jié)果如附圖5, A549與RGD-CS-SWCNT-DTX載藥體系共培養(yǎng)lh，2h，4h后的攝取 率分別為54%、88. 8%、98. 8%，而與CS-SWCNT-DTX共培養(yǎng)后的攝取率分別為44. 1%、64. 2%、 75. 1%，可以看出A549細(xì)胞對(duì)R⑶修飾的CS-SWCNT-DTX的攝取顯著強(qiáng)于未用R⑶修飾的 CS-SWCNT-DTX，RGD能使功能化SWCNT遞藥體系識(shí)別細(xì)胞表面的整合素受體，進(jìn)而增加細(xì)胞 的對(duì)其的攝取，說明RGD能特異性的識(shí)別A549細(xì)胞，增加載藥復(fù)合物對(duì)A549細(xì)胞的特異 性。
[0032] 實(shí)施例四：體內(nèi)抗腫瘤活性的檢測(cè) (1) 荷瘤裸鼠模型的建立：健康雌性BALB/c裸小鼠26只，3-4周齡裸鼠分籠飼養(yǎng)，自 由飲食，于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。裸鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境7天后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞接種，細(xì)胞用生理鹽水調(diào)成懸液濃度為lxl〇7cell S/mL。在4-5周齡的BALB/c裸鼠的 腋窩處皮下注射100 μ L細(xì)胞懸液，共接種BALB/c裸鼠26只。接種后BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于 SPF環(huán)境中； (2) 抗腫瘤試驗(yàn)：接種2-3周后裸鼠的腫瘤形成，待皮下瘤組織長(zhǎng)至50-80 mm3大小 時(shí)入組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取24只荷瘤裸鼠分為4組，每組分別依次為CS-SWCNT-DTX、 RGD-CS-SWCNT-DTX、DTX及生理鹽水（NS對(duì)照組)。尾靜脈每隔兩天分別注射4組藥物， DTX的給藥量為10 mg/kg。對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。治療當(dāng)天開始隔日用游標(biāo)卡 尺測(cè)量裸鼠腫瘤最長(zhǎng)直徑a和最短直徑b，稱體重，直到第14天結(jié)束試驗(yàn)。按下列公式 計(jì)算腫瘤體積：V= aXb2X0. 5，根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積（relative tumor volume，RTV)，計(jì)算公式為：RTV=Vd/V0,其中Vt為給藥后測(cè)得腫瘤體積，V0為d0時(shí)測(cè)量 所得腫瘤體積，Vd為給藥后測(cè)量所得腫瘤體積。腫瘤抑制率計(jì)算公式：抑瘤率=(對(duì)照 組平均腫瘤體積-治療組平均腫瘤體積）/對(duì)照組平均腫瘤體積X 100%。根據(jù)測(cè)得腫 瘤體積分別繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線，見附圖6;從圖可以發(fā)現(xiàn)NS組腫瘤生長(zhǎng)較快，而DTX、 CS-SWCNT-DTX和RGD-CS-SWCNT-DTX給藥組腫瘤生長(zhǎng)得到抑制，各給藥組的抑瘤率分別為 34. 5%、60%和79%。在給藥14天時(shí)，NS組腫瘤的相對(duì)體積為4. 33 ±0. 66, DTX、CS-SWCNT-DTX 和 RGD-CS-SWCNT-DTX 組的 RTV 分別為 2. 47± 1. 03(P = 0· 014 vs NS)，1. 58± 1. 10(P = 0.002 vs NS，P = 0.127 vs DTX)，0.79± 0·35(Ρ = 0.0004 vs NS，P = 0.004 vs DTX)。 各組腫瘤體積與生理鹽水組有顯著性差異（P < 〇. 05)，荷瘤裸鼠給予DTX后能有效抑制 A549腫瘤的生長(zhǎng)，且RGD-CS-SWCNT-DTX復(fù)合物比DTX組具有更好的抑瘤效果（P < 0. 01 )。
[0033] 本發(fā)明制備的RGD-CS-SWCNT-DTX遞藥復(fù)合物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后藥物由于殼聚糖 修飾呈現(xiàn)pH依賴性的增加釋放，使藥物在腫瘤組織濃度增加，殺傷腫瘤細(xì)胞，提高了藥 物的治療效果。對(duì)給藥14天后各組的裸鼠的臟器和腫瘤組織進(jìn)行切片觀察。NS組腫瘤 細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，細(xì)胞組織多而密，DTX和CS-SWCNT-DTX組中有部分細(xì)胞壞死出現(xiàn)空泡，而 RGD-CS-SWCNT-DTX組中大部分腫瘤細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞的空泡比較多，有明顯的壞死，說明 RGD-CS-SWCNT-DTX能有效的殺死A549腫瘤細(xì)胞。給藥組的心臟切片中的心肌細(xì)胞呈短柱 狀，且均具有明顯橫紋，與對(duì)照組結(jié)構(gòu)相似，未發(fā)生明顯的病變。肝臟組織的切片顯示給藥 組和生理鹽水組干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核均清晰可見，未出現(xiàn)明顯的腫脹和空泡性病變。同 樣其他的脾臟，肺和腎臟組織也均未發(fā)生明顯的病變。
【權(quán)利要求】
1. 一種pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將碳納米管加入濃硫酸和濃硝酸的混合酸溶液中，超聲分散后在80°C條件下攪拌 得到混合物，將混合物過濾，再將得到的濾餅洗滌后真空干燥，制得氧化的碳納米管； (2) 將氧化的碳納米管加入抗癌藥物溶液中，超聲分散后加入pH值為7. 0-7. 5的磷酸 鹽緩沖液形成混合液；混合液經(jīng)超聲處理后離心分離，再將得到的固體洗滌后干燥，得到載 藥的碳納米管； (3) 將R⑶肽和醋酸處理后的殼聚糖溶于醇中得到混合溶液；混合溶液于60°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)10-30分鐘，然后加入蒸餾水，再透析48h后得到RGD偶聯(lián)殼聚糖的接枝物溶液； (4) 將載藥的碳納米管加入RGD偶聯(lián)殼聚糖的接枝物溶液中形成混合物；混合物超 聲分散后，于攪拌條件下過夜；然后將混合物離心分離，得到的固體經(jīng)洗滌、冷凍干燥得到 RGD偶聯(lián)殼聚糖修飾的載藥碳納米管，即pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于：步 驟（1)中，碳納米管為單壁碳納米管，其直徑為l-l〇nm，長(zhǎng)度為l-5Mm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于：步 驟（1)的混合酸溶液中，濃硫酸和濃硝酸的體積比為1 : (1-3)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于，步 驟（2)中，抗癌藥物為多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、柔紅霉素中的一種；抗癌藥物溶液中， 溶劑為甲醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于，步 驟（2)中，抗癌藥物與氧化碳納米管的質(zhì)量比為1 : (2-4)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于，步 驟（3)中，殼聚糖的分子量為5-6萬。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于，步 驟（3)中，醇為甲醇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于，步 驟（4)中，載藥碳納米管和RGD偶聯(lián)殼聚糖的接枝物的質(zhì)量比為1 : (2-4)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法，其特征在于：所 述pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的直徑為10-20 nm，長(zhǎng)度為200-500 nm。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9所述任意一種pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系的制備方法制備 得到的pH敏感的碳納米管靶向遞藥體系。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104208704SQ201410416979
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】曹青日, 徐衛(wèi)娟, 崔京浩 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)