無載體共組裝腫瘤靶向抗癌納米藥物及其制備方法與應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及無載體共組裝腫瘤靶向抗癌納米藥物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病之一,腫瘤轉(zhuǎn)移則是癌癥患者死亡的最主要原因，資料表明,惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的比例達(dá)60％-62.5％，因此控制腫瘤轉(zhuǎn)移是決定癌癥患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。某種程度上說，防止腫瘤轉(zhuǎn)移即能控制腫瘤所致的死亡。腫瘤轉(zhuǎn)移過程牽涉到細(xì)胞脫落、浸潤、遷移運行、著床、新生血管生成等，理論上講，只要能夠阻止上述一個或多個過程，就能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，找出抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物刻不容緩。

核酸適配體(aptamer)是一類寡核苷酸片段,包括核糖核酸(rna)和單鏈脫氧核糖核酸(ssdna)，可與不同的靶標(biāo)分子高親和力特異性結(jié)合。它可作用于蛋白質(zhì)、金屬離子、小分子化合物、細(xì)胞膜表面受體等靶標(biāo)。較之抗體、多肽等較常見的靶向性配體，核酸適配體具有體積相對較小、免疫原性較低且易于體外篩選、性質(zhì)穩(wěn)定、易合成、易標(biāo)記、分子量較小和目標(biāo)分子廣泛等優(yōu)勢。隨著研究不斷深入，以適配體靶向納米遞送系統(tǒng)在腫瘤治療中將會有廣闊的應(yīng)用前景。

近幾年來，納米藥物載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用極為廣泛，尤其是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，得到越來越多研究者的關(guān)注，納米藥物載體已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿和熱點問題，在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用和明尤其確的產(chǎn)業(yè)化前景。雖然納米藥物載體以其優(yōu)異且獨特的性質(zhì)在疾病診斷、治療和衛(wèi)生保健方面發(fā)揮重要作用，但是能夠應(yīng)用臨床的很少。當(dāng)前的納米藥物載體雖在一定程度上提高了疏水性藥物的生物利用度，但是載體本身的生物相容性和細(xì)胞毒性不容忽視。最新的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人工合成的納米載體存在安全性問題，據(jù)報道一些納米載體在臨床試驗中引起休克、呼吸困難、低血壓等十分嚴(yán)重的不良癥狀，甚至有死亡的現(xiàn)象。納米載體在體內(nèi)的代謝機制不明確，對細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用將成為阻礙納米載藥體系向前發(fā)展和進(jìn)一步應(yīng)用于臨床的棘手問題。與傳統(tǒng)的納米載藥體系相比，無載體納米載藥體系解決了納米載體體系復(fù)雜、質(zhì)控困難、作用機制不明確和代謝不清楚等問題。無載體納米載藥體系消除了引入載體對人體帶來的安全問題，同時減輕對人體額外代謝的負(fù)擔(dān)，更解決了載體納米粒制備過程中批次質(zhì)量不可控的問題。

熊果酸(ursolicacid，ua)又名烏索酸(烏蘇酸)，屬五環(huán)三萜類化合物。它在自然界分布很廣，如存在于杜鵑花科植物熊果的葉、果實中，玄參科植物毛泡桐的葉中，以及木樨科植物女貞的葉中。熊果酸具有廣泛的生物活性，包括抗癌、對肝損傷的保護(hù)、抗菌消炎和抗病毒等作用。近年來體內(nèi)試驗證明發(fā)現(xiàn)：熊果酸的抗腫瘤作用廣泛，熊果酸不僅對多種致癌、促癌物有抵抗作用,而且能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長，此外熊果酸可以明顯增強機體免疫功能，這說明熊果酸極有可能成為低毒有效的新型抗癌藥物。

阿霉素(doxorubicin，dox)是一種蒽環(huán)糖苷類的廣譜抗腫瘤藥物，阿霉素結(jié)構(gòu)上既有脂溶性蒽環(huán)配基和水溶性柔紅糖胺，又有酸性酚羥基和堿性氨基，易通過細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，具有很強的藥理活性。臨床上用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、軟組織肉瘤、成骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膀胱瘤、甲狀腺瘤、絨毛膜上皮癌、前列腺癌、睪丸癌、胃癌、肝癌等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種無載體共組裝腫瘤靶向抗癌納米藥物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過π-π堆積、疏水和靜電力形成的具有靶向抗癌活性的共組裝納米藥物，以解決現(xiàn)有技術(shù)中人工合成的載體納米體系復(fù)雜、質(zhì)控困難、作用機制不明確和代謝不清楚等問題，以達(dá)到協(xié)同治療腫瘤的目的。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

無載體共組裝腫瘤靶向抗癌納米藥物，其是由雙抗癌納米藥物吸附具有腫瘤靶向功能的靶標(biāo)而獲得，所述雙抗癌納米藥物為熊果酸與抗癌藥物共組裝而成。

所述靶標(biāo)為核酸適配體、分子靶標(biāo)、抗體或多肽。

所述核酸適配體為epcam、her2或muc1。

所述分子靶標(biāo)為葉酸、乳糖酸或透明質(zhì)酸。

與熊果酸共組裝的抗癌藥物包括但不限于鹽酸阿霉素、鹽酸厄洛替尼、甲苯磺酸索拉非尼、阿柔比星、阿柔比星b、伊達(dá)比星、吡柔比星、多西他賽、福美坦、埃博霉素、雷公藤內(nèi)酯醇、米非司酮、喜樹堿、10-羥基喜樹堿、秋水仙堿、長春新堿、甲氨蝶呤、他莫西芬、替尼泊苷、順鉑和6-巰基嘌呤、鹽酸柔紅霉素、鹽酸表阿霉素、鹽酸佐柔比星或鹽酸米托蒽醌和5-氟尿嘧啶。

本發(fā)明將熊果酸與抗癌藥物共組裝得到雙抗癌納米藥物，雙抗癌納米藥物通過電荷間相互作用吸附熒光標(biāo)記核酸適配體或分子靶標(biāo)或抗體、多肽等，形成無載體共組裝腫瘤靶向抗癌納米藥物，該腫瘤靶向抗癌納米藥物同時兼具靶向性、成像和治療的功能，可作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物而應(yīng)用，能夠達(dá)到很好的腫瘤治療效果。

本發(fā)明所述無載體共組裝腫瘤靶向抗癌納米藥物的制備方法，包括以下步驟：

1)將熊果酸溶于良性溶劑a中，得到溶液a，所述溶液a中的熊果酸濃度范圍為1000μm‐20000μμ，所述良性溶劑a為二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、正丙醇、甲醇、吡啶、乙酸、二甲基亞砜中的一種或多種；

2)將待與熊果酸共組裝的抗癌藥物溶于良性溶劑b中，得到溶液b，所述溶液b中的抗癌藥物濃度范圍為1000μm‐20000μm，所述良性溶劑b為待組裝抗癌藥物的良性溶劑；

3)a.當(dāng)所述良性溶劑b為水：

在攪拌狀態(tài)下，將溶液a緩慢滴入溶液b中，攪拌一定的時間后得到溶液c1，溶液a與溶液b的體積為1:10‐1:100，溶液c1中熊果酸的濃度范圍為100μm‐2000μm；

b.當(dāng)所述良性溶劑b為非水良性溶劑：

將溶液a和溶液b混合得到混合液，混合液中熊果酸與抗癌藥物的物質(zhì)的量的濃度比為5:1-10:1，抗癌藥物的物質(zhì)的量的濃度范圍為10μm-4000μm；然后在攪拌狀態(tài)下，將混合液緩慢滴入熊果酸的不良溶劑中，攪拌一定的時間后得到溶液c2，混合液與不良溶劑的體積為1:10-1:100，溶液c2中的熊果酸濃度范圍為100μm-2000μm；

所述不良溶劑為磷酸鹽緩沖液、水、生理鹽水、葡萄糖溶液中的一種或多種；

4)將上述得到的溶液c1或溶液c2攪拌0.5-2h后得到雙抗癌納米藥物；

5)將上述雙抗癌納米藥物中的有機溶劑吹干，之后滴加具有腫瘤靶向功能的靶標(biāo)分子溶液，然后超聲10-60min，得到腫瘤靶向抗癌納米藥物。

進(jìn)一步，與熊果酸組裝的抗癌藥物為阿霉素，靶標(biāo)分子為aptamer，得到的腫瘤靶向抗癌納米藥物為ap/ud納米粒，所述ap/ud納米粒的制備方法包括以下步驟：

1)將熊果酸溶于良性溶劑a中，得到溶液a，所述溶液a中的熊果酸濃度范圍為1000μm‐20000μμ，所述良性溶劑a為二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、正丙醇、甲醇、吡啶、乙酸、二甲基亞砜中的一種或多種；

2)將鹽酸阿霉素溶于良性溶劑b中，得到溶液b，所述溶液b中的鹽酸阿霉素濃度范圍為1000μm‐20000μm，所述良性溶劑b為水、甲醇、吡啶、乙酸、二甲基亞砜中的一種或多種；

3)a.當(dāng)所述良性溶劑b為水：

在攪拌狀態(tài)下，將溶液a緩慢滴入溶液b中，攪拌一定的時間后得到溶液c1，溶液a與溶液b的體積為1:10‐1:100，溶液c1中的熊果酸濃度范圍為100μm‐2000μm；

b.當(dāng)所述良性溶劑b為甲醇、吡啶、乙酸、二甲基亞砜中的一種或多種：

將溶液a和溶液b混合得到混合液，混合液中熊果酸與鹽酸阿霉素的物質(zhì)的量的濃度比為5:1-10:1，鹽酸阿霉素的物質(zhì)的量的濃度范圍為10μm-4000μm；然后在攪拌狀態(tài)下，將混合液緩慢滴入不良溶劑中，攪拌一定的時間后得到溶液c2，混合液與不良溶劑的體積為1:10-1:100，溶液c2中的熊果酸濃度范圍為100μm-2000μm；

所述不良溶劑為磷酸鹽緩沖液、水、生理鹽水、葡萄糖溶液中的一種或多種；

4)將上述得到的溶液c1或溶液c2攪拌0.5-2h后得到雙抗癌納米藥物ud；

5)將上述雙抗癌納米藥物ud中的有機溶劑吹干，之后滴加aptamer溶液，然后超聲10-60min，得到ap/ud納米粒，即腫瘤靶向抗癌納米藥物。

本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，用疏水性藥物熊果酸和廣譜抗腫瘤藥物如阿霉素(或其它抗癌藥物)共組裝形成無載體納米藥物(ua-dox，簡稱ud)，并通過電荷間相互作用在其表面吸附具有腫瘤靶向功能的熒光標(biāo)記核酸適配體或分子靶標(biāo)或抗體、多肽等，獲得的腫瘤靶向抗癌納米藥物同時兼具靶向性、成像和治療的功能，從而達(dá)到協(xié)同的抗腫瘤作用，實現(xiàn)診療一體化，尤其在抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面作用突出，更重要的是解決了傳統(tǒng)納米載體帶來的體系復(fù)雜和體內(nèi)代謝不明確等問題。

所述的熊果酸的結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示，阿霉素的結(jié)構(gòu)式如式ⅱ所示：

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明所制備的雙抗癌納米藥物中所用的熊果酸既具有良好的抗癌效果又具有抗轉(zhuǎn)移效果；

2、本發(fā)明所制備的無載體雙抗癌納米藥物中的熊果酸在水中可以通過溶劑交換法自組裝成為納米粒，并且可以和抗癌藥物阿霉素等共組裝形成新的納米粒，有效地解決了抗癌藥物熊果酸的水溶性和生物利用度的問題；

3、本發(fā)明的無載體雙抗癌納米藥物具備ph響應(yīng)性；

4、本發(fā)明雙抗癌納米藥物表面電勢是正，可以對本發(fā)明的無載體雙抗癌納米藥物進(jìn)行表面修飾，例如連上帶有負(fù)電荷的葉酸或核酸適配體，使無載體雙抗癌納米藥物具有靶向性和成像等功能，增加雙抗癌納米藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷力，并可實現(xiàn)診療一體化；

5、本發(fā)明所制備的無載體雙抗癌納米藥物制備過程簡單，方便，可以解決傳統(tǒng)納米載體在體內(nèi)代謝不明確，體系復(fù)雜等問題，消除了人工合成載體帶來的臨床安全性問題，并能為以后新藥研發(fā)和制備提供新的思路。

附圖說明

圖1為實施例1中ua納米膠束粒徑圖；

圖2為實施例1中ua甲醇溶液與ua膠束溶液的對比成像圖；

圖3為實施例2中ud納米粒的粒徑圖；

圖4為實施例2中ud納米粒的電勢圖；

圖5為實施例2中ud溶液與實施例1中的ua納米膠束以及ua甲醇溶液的對比成像圖；

圖6為實施例3中fud納米粒的粒徑圖；

圖7為實施例4中ap/ud納米藥物的粒徑圖；

圖8為實施例5中ap/ud電泳圖；

圖9為實施例6中ap/ud對mcf-7腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；

圖10為實施例7中ap/ud對mcf-7腫瘤細(xì)胞的抗遷移作用；

圖11為實施例8中ap/ud對mcf-7腫瘤細(xì)胞的抗侵襲作用；

圖12為實施例9中ap/ud對mcf-7腫瘤細(xì)胞的抗粘附作用；

圖13為實施例10中ud、ua納米膠束的丁達(dá)爾效應(yīng)；

圖14為實施例11中ud的ph響應(yīng)圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1

熊果酸納米膠束的制備方法

精確稱取ua粉末0.00456g，溶于1ml甲醇中，超聲溶解，配置成10mm的熊果酸甲醇溶液；取100μl上述溶液，在攪拌過程中逐滴滴加到含有2ml二次水中(注：滴加過程中高速攪拌，滴加時間為30s)，此時ua在溶液中的濃度為500μm，然后攪拌8min，即得ua納米膠束。

本實施例制備的ua納米膠束平均粒徑98.32納米左右，粒徑圖如圖1所示。

本實施例制備的ua納米膠束溶液與ua甲醇溶液的對比成像圖如圖2所示。

實施例2

精確稱取ua粉末0.00456g，溶于1ml甲醇中，超聲溶解，配制成10mm的ua甲醇溶液；精確稱取鹽酸阿霉素粉末0.00579g，溶于1ml二次水中，超聲溶解，配制成10mm的鹽酸阿霉素水溶液；取200μlua甲醇溶液，逐滴滴加到含有2000μl含阿霉素水溶液的燒杯中(注：滴加過程中高速攪拌，滴加時間為30s，鹽酸阿霉素水溶液濃度為0.2μm)，ua在溶液中的濃度為1000μm，攪拌8min后，高速攪拌2h后，吹干甲醇溶液，即得無載體雙抗癌納米藥物ud；

本實施例制備的無載體雙抗癌納米藥物ud的平均粒徑在207納米左右，粒徑圖如圖3所示。電勢在15.1mv左右，電勢如圖4所示。

本實施例制備的ud溶液與實施例1中的ua納米膠束以及ua甲醇溶液的對比成像圖如圖5所示。

實施例3

取實施例2制備的ud納米溶液，滴加20μl葉酸溶液(水懸液，10mm)，然后超聲20min，混懸液消失，制備出具有葉酸靶向的fud納米粒。

本實施例制備的無載體雙抗癌納米藥物fud的平均粒徑在164納米左右，粒徑圖如圖6所示。

實施例4

在實施例2備的ud納米粒的基礎(chǔ)上，取100μl于ep管中，滴加10μl(her2適配體，10μm)，超聲20min后，制備所得ap/ud納米粒，使用dls檢測粒徑大小。

本實施例制備的ap/ud納米藥物的粒徑118納米左右，其粒徑圖如圖7所示。

實施例5

實施例4制備所得ap/ud納米粒，用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測適配體是否成功吸附在ud納米粒表面。

如圖8所示，適配體成功地吸附在納米粒表面(1為阿霉素，2為適配體，3為ap/ud納米粒)。

實施例6

ud和ap/ud納米藥物的抗癌活性，通過細(xì)胞毒性來實現(xiàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)mtt法測定ap/ud、ud、ua和dox及ua+dox對mcf-7細(xì)胞的增殖抑制活性，具體步驟為：

(1)取處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的mcf-7細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為0.8×10⁵個/ml，配成細(xì)胞懸液。于每孔100μl接種到96孔板中，周圍用nacl封板，置于37℃,5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(2)去除舊的培養(yǎng)基，每孔加入100μl不同濃度梯度的含樣品的培養(yǎng)基，另設(shè)空白對照組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h。

(3)移除培養(yǎng)基，于每孔中加入100μlmtt溶液(無血清、無酚紅的rmpi1640培養(yǎng)基：mtt母液＝9:1，v:v)，繼續(xù)孵育4h。

(4)取出96孔板終止培養(yǎng)，用移液槍輕輕吸去96孔板中的上清液，每孔加入dmso溶液100μl，振蕩搖勻10min，使藍(lán)紫色結(jié)晶全部溶解，用酶標(biāo)儀于490nm波長處測定每孔的od值，使用graphpadprism5處理，實驗結(jié)果如圖9所示。

結(jié)果顯示，藥物的聯(lián)合使用有一定的協(xié)同效果，納米藥物組的細(xì)胞毒性顯著提高，在每組對應(yīng)的濃度下都是ap/ud腫瘤靶向抗癌納米藥物組的抗腫瘤效果最好，和單藥相比有顯著性差異。

實施例7

ud和ap/ud納米藥物抗腫瘤細(xì)胞遷移活性，通過細(xì)胞劃痕來測定ap/ud、ud、ua和dox及ua+dox對mcf-7細(xì)胞的遷移抑制作用，具體步驟為：

(1).取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的mcf-7細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為8×10⁵個/ml，配成細(xì)胞懸液。于每孔150μl接種到12孔板中，周圍用nacl封板，置于37℃,5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(2).第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于孔板，槍頭要垂直，每個孔劃3天平行的直線。

(3).pbs洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基

(4).按照相應(yīng)的藥物濃度加入藥物(ua:1.25μm；dox:0.25μm；ua+dox,udnps和ap/udnps相應(yīng)的濃度)。

(5).放入37℃5％co2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。24h取樣，拍照。

結(jié)果如圖10所示，ua和dox在該濃度下和空白組對比有一定的抗腫瘤細(xì)胞遷移效果，混合物的抗腫瘤細(xì)胞遷移和單藥沒有顯著性差異，納米組有顯著性提高了兩藥抗mcf-7細(xì)胞遷移效果，尤其是ap/udnps增加her2適配體靶向后，進(jìn)一步提高了藥物抗腫瘤細(xì)胞遷移效果。

實施例8

為了驗證ap/ud納米粒的抗侵襲能力，利用traswell實驗驗證ap/ud納米粒對mcf-7的抗侵襲能力，具體步驟如下：

1、transwell法測定不同腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，用1mg/ml的matrigel稀釋液包被transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。棄小室中殘余液體，每孔加入50μl的1％bsa無血清培養(yǎng)液，于37℃放置1h。

2、取指數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，消化離心，棄去上清液后用含0.1％bsa的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁶/ml，吸取200μl加入transwell上室，下室加入500μl含有20％fbs及含有納米藥物(ap/ud濃度含ua:1.25μm；dox:0.25μm)的培養(yǎng)基。

3、37℃培養(yǎng)24小時后，取出transwell小室用pbs洗2遍，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用95％預(yù)冷的甲醇溶液中固定20min，后用0.1％的結(jié)晶紫染色15min，棄去染色液，用pbs清洗2遍。室溫晾干后于正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。隨機選取8個不同的視野細(xì)胞拍照并計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

結(jié)果如圖11所示，ap/udnps增加her2適配體靶向后，對mcf-7細(xì)胞具有顯著的抗侵襲能力。

實施例9

為了驗證ap/ud納米粒的抗粘附能力，利用細(xì)胞粘附實驗驗證ap/ud納米粒對mcf-7的抗粘附能力，具體步驟如下：

細(xì)胞粘附實驗：將處于對數(shù)期的huvec細(xì)胞消化后接種于24孔板，待上述24孔板的內(nèi)皮細(xì)胞長滿孔板時，用pbs清洗兩三次，然后加入含有內(nèi)皮刺激因子il-1β，濃度為1ng/l的培養(yǎng)基，在37℃,5％co2的條件下孵育4h，以此激活內(nèi)皮細(xì)胞。4h后取出孔板，用pbs清洗兩三次后，取對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，熒光標(biāo)記后制成4×105/ml-1單細(xì)胞懸液，并加入不同濃度藥物(ap/ud濃度含ua:1.25μm；dox:0.25μm)的rpm-1640培養(yǎng)液，每孔500μl。37℃、5％co2孵育2h后，pbs輕洗3遍，控干后加入無血清培養(yǎng)液500μl。然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照。

結(jié)果如圖12所示，ap/udnps增加her2適配體靶向后，對mcf-7細(xì)胞具有顯著的抗粘附能力。

實施例10

將實施例1制備的ua納米膠束和實施例2制備的無載體共組裝雙抗癌納米藥物ud，分裝白色瓶中，然后用激光筆照射，觀察現(xiàn)象，結(jié)果如圖13所示。觀察到一束均一的光束，明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象。

實施例11

將實施例2制備的ud各取500μl三份于比色皿中，然后分別加入ph為5.0、6.5和7.4的pbs溶液1500μl，觀察現(xiàn)象。

如圖14所示，ph5.0出現(xiàn)明顯的渾濁，ph6.5出現(xiàn)少量析出，ph7.4的情況下納米藥物能夠均一的存在。

以上所述僅為本發(fā)明的舉例說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化、修改、替換和變型，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。