使用哺乳動物β防御素治療炎性疾病的制作方法

專利名稱：：使用哺乳動物β防御素治療炎性疾病的制作方法使用哺乳動物β防御素治療炎性疾病涉及序列表本申請含有呈計算機(jī)可讀形式的序列表。該計算機(jī)可讀形式通過提述并入本文中。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過施用哺乳動物β防御素而抑制腫瘤壞死因子α(TNF-alpha或TNF-α)活性，其在多種病癥的治療(包括與發(fā)炎相關(guān)之病理學(xué)病狀的治療)中具有效用。背景人防御素在許多其它元件中，先天免疫的關(guān)鍵組分為個別顯示相當(dāng)大選擇性但集體能夠快速殺死廣譜的細(xì)菌、病毒及真菌的抗微生物肽(AMP)。AMP的生物重要性因其在自然界中之普遍分布而更為突出，且其有可能由所有多細(xì)胞生物體產(chǎn)生。在人類中，優(yōu)勢AMP為防御素。人防御素為陽離子小肽，基于其三個分子內(nèi)半胱氨酸二硫鍵之拓?fù)鋵W(xué)可分為α-防御素及β-防御素。α-防御素可進(jìn)一步細(xì)分為首先自嗜中性粒細(xì)胞顆粒分離的α-防御素(ΗΝΡ1-4)及由Paneth細(xì)胞在小腸隱窩中表達(dá)的α-防御素(HD5及HD6)。β-防御素主要由多種組織及器官中的上皮細(xì)胞產(chǎn)生，所述組織及器官包括皮膚、氣管、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、腎、胰及乳腺。β-防御素家族最具特征的(bestcharacterized)成員為hBDl_3。然而，使用多種生物信息學(xué)工具，已在人基因組中注釋了幾乎40個編碼推定β-防御素同源物的開放閱讀框。一些人防御素是組成型產(chǎn)生的，而其它是由促炎性細(xì)胞因子或外源微生物產(chǎn)物誘導(dǎo)的。已經(jīng)越來越清楚的是，除直接抗微生物活性外，人防御素也具有寬范圍的免疫調(diào)節(jié)/替代性質(zhì)。所述性質(zhì)包括誘導(dǎo)多種趨化因子及細(xì)胞因子、趨化活性及細(xì)胞凋亡活性，誘導(dǎo)前列腺素、組胺及白細(xì)胞三烯釋放，抑制補(bǔ)體，通過鐸樣受體(toll-likereceptor)信號傳導(dǎo)刺激樹突細(xì)胞成熟，以及刺激由嗜中性粒細(xì)胞的病原體清除。此外，人防御素也在傷口愈合、上皮及成纖維細(xì)胞的增殖、血管生成(angiogenesis)及血管發(fā)生(vasculogenesis)中起作用。有越來越多的人防御素在許多感染性及炎性疾病中發(fā)揮重要作用的證據(jù)。發(fā)炎和/或感染皮膚中通常觀察到人防御素之過表達(dá)，很可能是因?yàn)橛晌⑸锝M分或內(nèi)源性促炎性細(xì)胞因子局部誘導(dǎo)。在牛皮癬(psoriasis)中，hBD2及hBD3過于充足，且在患有尋常痤瘡(acnevulgaris)或淺表性毛囊炎(superficialfolliculitis)的患者的受損上皮中觀察到hBD2的顯著上調(diào)。另一方面，異位性/特應(yīng)性皮炎(topicdermatitis)與hBD2及hBD3的下調(diào)相關(guān)?；啬c克羅恩氏病(Crohn'sdisease)與HD5及HD6的缺陷表達(dá)相關(guān)，且在結(jié)腸中的克羅恩氏病中，hBD2-4的表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞因子細(xì)胞因子為來自高級真核生物的小的分泌多肽，其負(fù)責(zé)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)且影響其它細(xì)胞之生長、分裂和功能。它們是有效的多效性多肽，其例如經(jīng)由相應(yīng)受體充當(dāng)局部或全身性細(xì)胞間調(diào)控因子，且因此在許多生物過程(如免疫、發(fā)炎及造血)中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞因子由多樣細(xì)胞類型產(chǎn)生，所述細(xì)胞類型包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。TNF-α涉及多種生理病原性過程且可如在宿主防御中具有保護(hù)性或如在自體免疫中具有有害性。TNF-α為關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，其引發(fā)且維持發(fā)炎反應(yīng)，且已證明TNF-a失活在下調(diào)與自體免疫疾病相關(guān)之炎性反應(yīng)中是重要的。感染后，巨噬細(xì)胞大量分泌TNF-α且TNF-α通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生粘附分子及通過產(chǎn)生為趨化細(xì)胞因子之趨化因子來介導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞募集(recruitment)至感染部位。TNF-α有助于活化白血球及其它炎性細(xì)胞且增加損傷組織內(nèi)之血管滲透性。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突細(xì)胞產(chǎn)生，但也可由多種其它細(xì)胞類型產(chǎn)生，所述細(xì)胞類型包括淋巴樣細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪組織、成纖維細(xì)胞及神經(jīng)元組織。當(dāng)前的抗炎藥通過與TNF-α結(jié)合且因此阻止TNF_a向細(xì)胞表面上TNF_a之受體傳導(dǎo)信號來阻斷TNF-a之作用。該類型之阻斷具有某些嚴(yán)重的副作用，其中一些為感染，如肺結(jié)核、敗血癥及真菌感染且可能使癌癥發(fā)病率增加。IL-10,也稱為人細(xì)胞因子合成抑制因子(CSIF)，也作為抗炎細(xì)胞因子是免疫調(diào)控的關(guān)鍵參與者。該細(xì)胞因子由數(shù)種細(xì)胞類型產(chǎn)生，所述細(xì)胞類型包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞及肥大細(xì)胞。該細(xì)胞因子在免疫調(diào)控及發(fā)炎作用中具有多效性效應(yīng)。其下調(diào)促炎性細(xì)胞因子、由Thl/Thl7細(xì)胞分泌之細(xì)胞因子、MHC第II類Ag及共刺激分子于抗原呈遞細(xì)胞上的表達(dá)。IL-10也由稱為調(diào)控T細(xì)胞(Tregs)之T細(xì)胞群體分泌。所述細(xì)胞不阻止最初T細(xì)胞活化；相反，其抑制持續(xù)反應(yīng)且阻止慢性和潛在破壞性的反應(yīng)。在周邊中，一些T細(xì)胞被抗原及IL-10或TGF-β誘導(dǎo)成為Tregs。IL-10誘導(dǎo)之Tregs為⑶4+/⑶25+/Foxp3-且稱為Trl細(xì)胞。所述細(xì)胞通過分泌IL-10抑制免疫反應(yīng)。最近研究已公開在鑒別Thl7細(xì)胞時T細(xì)胞效應(yīng)子譜系之多樣化大于Thl/Th2/Treg。已顯示該亞群在先前歸因于Thl系之?dāng)?shù)種自體免疫疾病(如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、牛皮癬及多發(fā)性硬化)中呈病原性。由Thl7分泌之細(xì)胞因子也被IL-10下調(diào)，且阻斷TNF通過使Thl7細(xì)胞失活而預(yù)防牛皮癬。IL-10之總體活性為抗炎性，且已在數(shù)個動物研究中顯示預(yù)防發(fā)炎及損傷，然而因?yàn)镮L-10施用途徑及其生物半衰期方面的困難，所以臨床IL-10治療仍然不足。使用人防御素治療發(fā)炎引人關(guān)注的是，小腸中克羅恩氏病與潘納斯細(xì)胞(panethcell)a-防御素HD5及HD6之水平降低相關(guān)，而結(jié)腸中克羅恩氏病與β-防御素hBD2及hBD3之產(chǎn)生減少相關(guān)(Gersemann等，2008；Wehkamp等，2005)。此外，已有力地證明克羅恩氏病之發(fā)病機(jī)制中涉及腸微生物區(qū)(Swidsinski等，2002)。所述研究人員通過使用熒光原位雜交顯示在活性克羅恩氏病中，觀察到粘膜相關(guān)且具侵襲性之細(xì)菌之急劇增加，而正常小腸上皮及大腸上皮中無所述細(xì)菌。這些觀察結(jié)果一起合并成一個假設(shè)，該假設(shè)表明在健康人中，沿腸上皮屏障之適當(dāng)水平之防御素起作用以控制腔內(nèi)(luminal)細(xì)菌之組成及數(shù)目且使其不粘附及入侵粘膜而觸發(fā)發(fā)炎(Wang等，2007)。另一方面，在能力不足以產(chǎn)生保護(hù)性水平之分泌防御素的人中，抗微生物防御與腔內(nèi)細(xì)菌之間的平衡會改變。結(jié)果，這使得細(xì)菌入侵基礎(chǔ)(underlying)腸組織，從而誘導(dǎo)炎性狀態(tài)，而這又可能發(fā)展成克羅恩氏病?；谠摷僭O(shè)，WO2007/081486公開了數(shù)種人防御素在炎性腸病之治療中之用途。發(fā)明者提出以使防御素在腸腔中之適當(dāng)位置釋放之配制物形式經(jīng)口向克羅恩氏病患者施用的防御素將減少入侵細(xì)菌之?dāng)?shù)目，重建正常上皮屏障功能且因此降低炎性疾病之嚴(yán)重性。根據(jù)WO2007/081486，防御素之功能在于直接靶向且殺死腔中之細(xì)菌，從而阻止其入侵上皮組織。即，防御素完全起抗感染化合物作用。關(guān)于W0/2007/081486，令人驚訝的是胃腸外施用之hBD2能夠降低小鼠中DSS誘導(dǎo)之結(jié)腸炎的嚴(yán)重性，因?yàn)橥ㄟ^使用該施用途徑，肽從未遇到腔內(nèi)細(xì)菌。另外，我們此處顯示hBD2之作用為減小由PBMC分泌之促炎性細(xì)胞因子TNFa、IL-Iβ及IL-23之水平。已知這些細(xì)胞因子是許多炎性疾病包括炎性腸病中的關(guān)鍵參與者。多于十年已知的是，除抗微生物功能外，防御素也具有多種免疫調(diào)節(jié)功能。然而，大部分關(guān)于人防御素之免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)之著作描述其主要具有促炎性或免疫增強(qiáng)功能(參見例如，Niyonsaba等，2007；Bowdish等，2006；Lehrer,2004)。因此，確實(shí)出乎意料的是胃腸外施用之hBD2能夠降低炎性腸病中的疾病嚴(yán)重性。首先，當(dāng)胃腸外施用時，hBD2決不會到達(dá)腸腔從而遇到參與誘導(dǎo)疾病之有害細(xì)菌。此外，基于大部分公開之文獻(xiàn)，如此處所提供之著作中所觀察到的，將預(yù)期進(jìn)入血流之防御素將誘導(dǎo)促炎性而非抗炎性反應(yīng)。發(fā)明詳述為幫助理解優(yōu)選實(shí)施方案，本文提供某些定義。如本文所用之術(shù)語“TNF-α活性”為廣義術(shù)語且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言為一般且習(xí)慣之含義給出(且不局限于特定或定制之含義)，且系指(但不限于)至少部分由腫瘤壞死因子α介導(dǎo)之活性或作用。如本文所用之術(shù)語“抑制子”為廣義術(shù)語且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言為一般且習(xí)慣之含義給出(且不局限于特定或定制之含義)，且系指(但不限于)可降低TNF-α之至少一種活性之分子(例如，天然或合成化合物)。換言之，若在有抑制子進(jìn)行之測定中，與無抑制子進(jìn)行之測定相比，所測量到之TNF-α之量、TNF-α活性或細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)檢測出之TNF-α存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化，則“抑制子”改變活性。一般而言，TNF-α抑制子例如通過減少TNF-α之分泌降低TNF-α之生理功能，且因此適用于治療TNF-α可直接或間接為病原性之疾病。如本文所用之術(shù)語“IL-10活性”為廣義術(shù)語且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言為一般且習(xí)慣之含義給出(且不局限于特定或定制之含義)，且系指(但不限于)至少部分由白介素-10介導(dǎo)之活性或作用。如本文所用之術(shù)語“誘導(dǎo)劑(inducer)”為廣義術(shù)語且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言為一般且習(xí)慣之含義給出(且不局限于特定或定制之含義)，且系指(但不限于)可增加IL-10之至少一種活性之分子(例如，天然或合成化合物)。換言之，若在有誘導(dǎo)劑進(jìn)行之測定中，與無誘導(dǎo)劑進(jìn)行之測定相比，所測量之IL-10之量、IL-10活性或細(xì)胞外和/或細(xì)胞內(nèi)檢測出之IL-10存在統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化，則“誘導(dǎo)劑”改變活性。一般而言，IL-10誘導(dǎo)劑增加IL-10之生理功能，且因此適用于治療受IL-10影響之疾病。術(shù)語“修飾”在本文中意指人β防御素2之任何化學(xué)修飾。修飾可為氨基酸之取代、缺失和/或插入以及氨基酸側(cè)鏈之置換；或在氨基酸序列中使用具有類似特性之非天然氨基酸。詳言之，修飾可為酰胺化，如C-末端酰胺化。如本文所用之術(shù)語“防御素”系指本領(lǐng)域的技術(shù)人員公認(rèn)屬于抗微生物肽之防御素類之多肽。為確定多肽是否為根據(jù)本發(fā)明之防御素，可通過使用免費(fèi)可用之HMMER軟件包將氨基酸序列與PFAM數(shù)據(jù)庫之隱馬爾可夫模型序型(hiddenmarkovmodelprofile)(HMM序型)比較。PFAM防御素家族包括例如防御素-1或“哺乳動物防御素”(登錄號PF00323)及防御素_2或防御素_3或“β防御素”(登錄號PF00711)。本發(fā)明之防御素屬于β防御素類。β防御素類之防御素享有共同的結(jié)構(gòu)特征，如半胱氨酸模式。根據(jù)本發(fā)明之防御素之實(shí)例包括人β防御素1(hBDl；參見SEQIDNO:1)、人β防御素2(hBD2；參見SEQIDN0:2)、人β防御素3(hBD3；參見SEQIDN0:3)、人β防御素4_4；參見SEQIDNO4)及小鼠β防御素3(mBD3；參見SEQIDNO6)。兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”描述。就本發(fā)明而言，通過使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277;http://emboss,org)，優(yōu)選3.0.0版或更新版本之Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)確定兩個氨基酸序列之間的同一性程度。使用之任選參數(shù)為缺口開放罰分(10)、缺口延伸罰分(0.5)及EBL0SUM62(BL0SUM62之EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記之“最長同一性”之輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性且如下計算(相同殘基X100)/(比對長度_比對中之缺口總數(shù))。就本發(fā)明而言，通過使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，同上；http://emboss,org)、優(yōu)選3.0.0版或更新版本之Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch，1970，同上)確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度。使用之任選參數(shù)為缺口開放罰分(10)、缺口擴(kuò)展罰分(0.5)及EDNAFULL(NCBINUC4.4之EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記之“最長同一性”之輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性且如下計算(相同脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中之缺口總數(shù))。如本文所用之術(shù)語“經(jīng)分離變體”或“經(jīng)分離多肽”系指自來源分離之變體或多肽。在一方面中，如SDS-PAGE所測定的，變體或多肽為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，且最優(yōu)選至少90%純。術(shù)語“基本上純的多肽”在本文中表示含有按重量計至多10%、優(yōu)選至多8%、更優(yōu)選至多6%、更優(yōu)選至多5%、更優(yōu)選至多4%、更優(yōu)選至多3%、甚至更優(yōu)選至多2%、最優(yōu)選至多且甚至最優(yōu)選至多0.5%與之天然或重組相關(guān)之其它多肽物質(zhì)的多肽制備物。因此，優(yōu)選基本上純的多肽按制備物中所存在之總多肽物質(zhì)之重量計為至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明之多肽優(yōu)選呈實(shí)質(zhì)上純的形式。此可例如通過由眾所周知之重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽來實(shí)現(xiàn)。哺乳動物β防御素本發(fā)明涉及哺乳動物β防御素(如人β防御素和/或小鼠β防御素)在治療與TNF-α之(病原性)水平增加相關(guān)的疾病，如炎性疾病中的醫(yī)藥用途。治療優(yōu)選與降低所治療組織中之TNF-α活性相關(guān)。因此，本發(fā)明之哺乳動物β防御素也稱為TNF-α抑制子。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素與SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和/或SEQIDNO6中之任一氨基酸序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素與SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDN0:3和/或SEQIDNO4中之任一氨基酸序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素1(SEQIDNO:1)、人β防御素2(SEQIDNO:2)、人β防御素3(SEQIDNO:3)、人β防御素4(SEQIDNO4)、人β防御素4之變體(SEQIDNO5)和/或小鼠β防御素3(SEQIDNO6)組成。在一甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素KSEQIDΝ0:1)、人β防御素2(SEQIDN0:2)、人β防御素3(SEQIDNO3)和/或人β防御素4(SEQIDNO4)組成。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素與SEQIDNO:2之氨基酸序列具有至少80%、優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%的同一性程度。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素2(SEQIDNO2)組成。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能等效變體組成。優(yōu)選地，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3、人β防御素4及小鼠β防御素3及其功能等效變體組成。更優(yōu)選地，本發(fā)明之哺乳動物β防御素由人β防御素2及其功能等效變體組成。本發(fā)明之哺乳動物β防御素也稱為優(yōu)選實(shí)施方案之化合物。在本發(fā)明之上下文中，哺乳動物(例如人)β防御素之“功能等效變體(functionallyequivalentvariant)”為展現(xiàn)與哺乳動物(例如人)β防御素(如人β防御素2)大致相同之對TNF-α活性之功效的經(jīng)修飾哺乳動物(例如人)β防御素。更優(yōu)選地，其也展現(xiàn)與哺乳動物(例如人)β防御素(如人β防御素2)大致相同之對IL-10活性之功效。根據(jù)本發(fā)明，哺乳動物(例如人)β防御素(如人β防御素2)之功能等效變體與哺乳動物(例如人)β防御素氨基酸序列(如SEQIDNO2)相比可包含1-5個氨基酸修飾，優(yōu)選1-4個氨基酸修飾，更優(yōu)選1-3個氨基酸修飾，最優(yōu)選1-2個氨基酸修飾且尤其1個氨基酸修飾。優(yōu)選地，氨基酸修飾是性質(zhì)上較不重要的，其為不顯著影響多肽之折迭和/或活性之保守性氨基酸取代或插入；單缺失；氨基_或羧基_末端小延伸；至多約20-25個殘基之小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能而有利于純化之小延伸，如多聚組氨酸標(biāo)記、抗原表位或結(jié)合域。保守取代的實(shí)例為在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)組內(nèi)的取代。通常不改變比活的氨基酸取代在本領(lǐng)域是已知的，并由，例如，Neurath和Hill，1979在TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最通常發(fā)生的交換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定哺乳動物β防御素中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，TNF-α活性之抑制)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.2714699-4708必需氨基酸的身份(identity)也可由分析與相關(guān)于哺乳動物β防御素之多肽的同一性來推斷。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53_57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；WO95/17413；或W095/22625公開的那些方法來進(jìn)行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991,Biochem.3010832-10837；美國專利5，223，409號；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。本發(fā)明之多肽之N-末端延伸可合適地由1至50個氨基酸、優(yōu)選2-20個氨基酸、尤其3-15個氨基酸組成。在一實(shí)施方案中，N-末端肽延伸不含Arg(R)。在另一實(shí)施方案中，N-末端延伸包含如下文進(jìn)一步定義之kex2或kex2_樣切割位點(diǎn)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，N-末端延伸為包含至少兩個Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸殘基之肽，如包含以下序列之一的N-末端延伸EAE、EE、DE及DD。方法及用途TNF-α抑制子具有多種可應(yīng)用之用途，如上所述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，當(dāng)相對于TNF-α對照水平觀察到統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化(減小)時，發(fā)生抑制。發(fā)現(xiàn)人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3及人β防御素4之變體可在LPS-及LTA-攻擊的細(xì)胞中降低TNF-α活性且誘導(dǎo)IL-10活性。另外，發(fā)現(xiàn)人β防御素2可在LPS-及LTA-攻擊的細(xì)胞中減少IL-23分泌；且發(fā)現(xiàn)小鼠β防御素3可降低鼠類和人LPS-及LTA-攻擊的細(xì)胞中之TNF活性。這些發(fā)現(xiàn)支持了所測試之哺乳動物β防御素展現(xiàn)優(yōu)異的抗炎活性，尤其在自體免疫疾病或病癥中展現(xiàn)抗炎活性?？墒褂脙?yōu)選實(shí)施方案之藥物組合物治療由TNF-α活性介導(dǎo)之病癥。也提供治療由TNF-α活性介導(dǎo)之病癥之方法，該治療包含向需要該治療之受試者施用有效量之例如呈藥物組合物形式之哺乳動物β防御素，如人β防御素2。也提供的是哺乳動物β防御素(如人β防御素2)，其用于制造藥物；及哺乳動物β防御素(如人β防御素2)之用途，其用于制造用于治療由TNF-α活性介導(dǎo)之病癥的藥物，例如藥物組合物。治療包括治療已有疾病或病癥以及預(yù)防(prophylaxis(prevention))疾病或病癥。在一實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致所治療組織中TNF-α活性降低，優(yōu)選TNF-α活性降低且IL-10活性增加?？捎脙?yōu)選實(shí)施方案之化合物例如通過抑制(inhibition或suppression)TNF-α活性而治療之疾病或病癥包括由TNF-α活性介導(dǎo)之疾病或病癥。優(yōu)選地，這些病癥之治療可受益于TNF-α活性降低和/或IL-10活性增加。所述疾病或病癥包括炎性疾病或病癥、過敏性疾病及自體免疫疾病。更詳言之，病癥或疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、動脈粥樣硬化、硬皮病(全身性硬化)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡、(急性)腎小球性腎炎、哮喘(如支氣管哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫綜合征(ARDS)、炎性腸病(例如克羅恩氏病(Crohn'sDisease))、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、血管炎、葡萄膜炎、皮炎(例如炎性皮炎)、異位性/特應(yīng)性皮炎、毛發(fā)脫落、鼻炎(過敏性)、過敏性結(jié)膜炎、重癥肌無力、硬化性皮炎、肉狀瘤病、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、格雷夫斯病(Gravesdisease)、斯耶格倫氏綜合征(Sjogren'ssyndrome)及貝塞特氏病(Behcetdisease)。TNF-α抑制子可治療性用于組合物中，所述組合物經(jīng)配制用于經(jīng)由任何常規(guī)途徑施用，常規(guī)途徑包括腸內(nèi)(例如經(jīng)頰、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸)、胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))或局部(例如，表皮、鼻內(nèi)或氣管內(nèi))。在其它實(shí)施方案中，本文中描述之組合物可作為持續(xù)釋放植入物之一部分施用。在另外的其它實(shí)施方案中，可利用提供冷凍干燥物穩(wěn)定性之適當(dāng)賦形劑將優(yōu)選實(shí)施方案之組合物配制為冷凍干燥物，且接著復(fù)水。含有優(yōu)選實(shí)施方案之TNF-α抑制子之藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法，例如通過混合、造粒、包覆、溶解或凍干過程制造。在另一實(shí)施方案中，提供含有一或多種TNF-α抑制子之藥物組合物。出于施用之目的，可將優(yōu)選實(shí)施方案之化合物配制為藥物組合物。優(yōu)選實(shí)施方案之藥物組合物包含一或多種優(yōu)選實(shí)施方案之TNF-α抑制子及藥學(xué)上可接受之載體和/或稀釋劑。TNF-α抑制子優(yōu)選在藥物組合物中以有效治療特定病癥之量，即足以減少TNF-α水平或活性、減緩癥狀和/或優(yōu)選具有對患者可接受之毒性之量使用。對于該治療，適當(dāng)劑量當(dāng)然依賴于例如所使用之本發(fā)明化合物之化學(xué)性質(zhì)及藥物動力學(xué)數(shù)據(jù)、個體宿主、施用模式及接受治療之病狀之性質(zhì)及嚴(yán)重性而變化。然而，一般而言，為在例如人之較大哺乳動物中獲得令人滿意的結(jié)果，指示每日劑量優(yōu)選為約0.OOlg至約1.5g、更優(yōu)選約0.Olg至1.Og；或約0.01mg/kg體重至約20mg/kg體重、更優(yōu)選約0.lmg/kg體重至約IOmg/kg體重，例如以多至一天四次之分開的劑量施用。優(yōu)選實(shí)施方案之化合物可通過與TNF-α活性之其它調(diào)節(jié)劑(例如低分子量抑制物)通常使用之類似施用模式及類似劑量向例如人之較大哺乳動物施用。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選實(shí)施方案之藥物組合物可包括TNF-α抑制子，TNF-α抑制子之量取決于施用途徑為每單位劑型約0.5mg或更少至約1500mg或更多，優(yōu)選約0.5、0.6,0.7,0.8或0.9mg至約150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或IOOOmg,且更優(yōu)選約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg至約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或lOOmg。然而，在一些實(shí)施方案中，比以上所提及之更低或更高的劑量可為優(yōu)選的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)?shù)臐舛燃皠┝?。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉藥學(xué)上可接受之載體和/或稀釋劑。對于配制成液體溶液之組合物，可接受之載體和/或稀釋劑包括鹽水及無菌水，且可任選地包括抗氧化劑、緩沖齊、抑菌劑及其它常見添加劑。組合物也可配制成丸劑、膠囊、顆粒劑、片劑(包覆或未包覆)、(可注射)溶液、固體溶液、懸浮液、分散液、固態(tài)分散液(例如呈安瓿、小瓶、乳膏、凝膠、糊狀物、吸入劑粉末、泡沫、酊劑、唇膏、滴劑、噴霧劑或栓劑的形式)。配制物可含有(除一或多種TNF-α抑制子及其它任選之活性成分外)載體、填充劑、崩解劑、流動調(diào)節(jié)劑、糖及甜味劑、芳香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓之鹽、緩沖劑、稀釋齊U、分散劑及表面活性劑、粘合劑、潤滑劑和/或如本領(lǐng)域已知之其它藥物賦形劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)一步以適當(dāng)方式且根據(jù)公認(rèn)的實(shí)踐(如Remington'sPharmaceuticalSciences,GennaroH,MackPublishingCo.，Easton,PA1990巾Μδ白勺)MMTNF-α抑制子。TNF-α抑制子可單獨(dú)使用或以與一種、兩種或更多種其它藥物化合物或藥物物質(zhì)和/或與一或多種藥學(xué)上可接受之賦形劑之組合療法使用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，TNF-α抑制子與所使用之常規(guī)藥物組合提供以治療TNF-α為病原性或TNF-α在疾病過程中發(fā)揮關(guān)鍵或其它作用之疾病或病狀。在尤其優(yōu)選實(shí)施方案中，提供包含一或多種TNF-α抑制子與一或多種其它藥物化合物組合之藥物組合物，該一或多種TNF-α抑制子包括(但不限于)優(yōu)選實(shí)施方案之化合物，該一或多種其它藥物化合物包括(但不限于)用于治療哮喘或其它呼吸道疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎或其它炎性疾病、免疫病癥或TNF-α為病原性之其它疾病或病癥的藥物。優(yōu)選實(shí)施方案之TNF-α抑制子可單獨(dú)或與一或多種其它藥物活性劑(例如適用于治療發(fā)炎或相關(guān)疾病之藥劑)組合用于醫(yī)藥治療。所述其它藥物活性劑包括例如類固醇、糖皮質(zhì)激素、其它炎性細(xì)胞因子之抑制物(例如抗TNF-α抗體、抗IL-I抗體、抗IFN-γ抗體)及其它細(xì)胞因子(如IL-IRA或IL-10)及其它TNF-α抑制物。組合療法可包括兩種以上藥物活性劑在同一配制物中的固定組合；獨(dú)立配制物中之兩種以上藥物活性劑例如與用于共施用之說明書在同一包裝中出售的套組；及藥物活性劑分開包裝但提供同時或連續(xù)施用之說明書的自由組合。其它套組元件可包括診斷劑、測定、連續(xù)或同時施用之多個劑型、復(fù)原藥物組合物之凍干或濃縮形式之說明書及物質(zhì)、施用藥物活性劑之裝置等。例如，提供一種醫(yī)藥包裝，其包含為優(yōu)選實(shí)施方案之化合物之第一藥物物質(zhì)及至少一種第二藥物物質(zhì)以及組合施用之說明書。也提供一種醫(yī)藥包裝，其包含優(yōu)選實(shí)施方案之化合物以及與至少一種第二藥物物質(zhì)組合施用之說明書。也提供一種醫(yī)藥包裝，其包含至少一種第二藥物物質(zhì)以及與本發(fā)明化合物組合施用之說明書。用根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案之組合治療與由組合中之任一組分單獨(dú)治療相比可提供改善或優(yōu)良效果。例如，可使用包含一定量之優(yōu)選實(shí)施方案之化合物及一定量之第二藥物物質(zhì)的藥物組合，其中所述量適于產(chǎn)生協(xié)同治療性效應(yīng)。也提供一種改進(jìn)優(yōu)選實(shí)施方案之化合物之治療性效用的方法，該方法包括例如相伴或順序共施用治療有效量之優(yōu)選實(shí)施方案之化合物及第二藥物物質(zhì)。也提供一種改進(jìn)第二藥物物質(zhì)之治療性效用的方法，該方法包括例如相伴或順序共施用治療有效量之優(yōu)選實(shí)施方案之化合物及第二藥物物質(zhì)。本發(fā)明與作為組合搭配物(partner)之第二藥物的組合可由例如以上關(guān)于優(yōu)選實(shí)施方案之化合物所述之任何常規(guī)途徑施用。第二藥物可以適當(dāng)劑量施用，例如與單一治療所使用之劑量范圍類似的劑量范圍或例如在協(xié)同作用之情況下，甚至低于常規(guī)劑量范圍。合適的第二藥物物質(zhì)包括化學(xué)治療藥，尤其任何除優(yōu)選實(shí)施方案之TNF-α抑制子以外的化學(xué)治療劑。所述第二藥物物質(zhì)可包括例如抗炎藥和/或免疫調(diào)節(jié)藥等。可與優(yōu)選實(shí)施方案之化合物組合使用之抗炎藥和/或免疫調(diào)節(jié)藥包括例如mTOR抑制物，包括雷帕霉素(rapamycin)，例如40_0_(2-羥基乙基)-雷帕霉素、32-脫氧雷帕霉素、16-0-取代的雷帕霉素(如16-戊-2-炔基氧基-32-脫氧雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S或R)-二氫-雷帕霉素、16-戊-2-炔基氧基-32(S或R)-二氫-40-0-(2-羥基乙基)_雷帕霉素)、40-[3_羥基_2-(羥基-iEtaethyl)-2-甲基丙酸酯]_雷帕霉素(也稱為CCI779)、40-erhoi-(四唑基)-雷帕霉素(也稱為ABT578)、所謂雷帕霉素類似物(rapalog)如PCT國際申請第WO98/02441號、PCT國際申請第WO01/14387號及PCT國際申請第W003/64383號中所公開之類似物(如AP23573)及以名稱TAFA-93及biolimus(biolimusA9)公開之化合物；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin)抑制物，例如環(huán)孢素A或506；具有免疫抑制性質(zhì)之子囊霉素，例如ABT-281、ASM981；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；咪唑硫嘌呤(azathioprene)；來氟米特(leflunomide)；咪唑立賓(mizoribine)；霉酚酸或鹽；霉酚酸嗎啉乙酯(mycophenolatemofetil)；15-脫氧精胍菌素(15-deoxyspergualine)或其免疫抑制物同源物、類似物或衍生物；bcr-abl酪氨酸激酶抑制物；c-kit受體酪氨酸激酶抑制物；PDGF受體酪氨酸激酶抑制物，例如Gleevec(伊馬替尼(imatinib))；p38MAP激酶抑制物、VEGF受體酪氨酸激酶抑制物、PKC抑制物，例如PCT國際申請第WO02/38561號或PCT國際申請第WO03/82859號中所公開之抑制物，例如實(shí)施例56或70之化合物；JAK3激酶抑制物，例如N-苯甲基-3，4-二羥基-亞芐基-氰基乙酰胺α-氰基-(3，4_二羥基)]-N-苯甲基肉桂酰胺(TyrphostinAG490)、靈菌紅素25-C(PNUI56804)、[4-(4‘-羥基苯基)-胺基_6，7-二甲氧基喹唑啉](WHI-PI31)、[4-(3'-溴-4'-羥基苯基)-胺基-6，7-二甲氧基喹唑啉](冊1寸154)、[4-(3'，5-二溴-4‘-羥基苯基)_胺基-6，7-二甲氧基喹唑啉]WHI-P97、KRX_211、3_{(3R，4R)-4-甲基-3-[甲基-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶_4_基)-胺基]-哌啶-1-基}-3-氧代-prorhoionitrile(呈游離形式或藥學(xué)上可接受之鹽形式(例如單檸檬酸鹽)(也稱為CP-690,550))或PCT國際申請第WO2004/052359號或PCT國際申請第WO2005/066156號中所公開之化合物；SIP受體激動劑或調(diào)節(jié)劑，例如任選經(jīng)磷酸化之FTY720或其類似物，例如任選經(jīng)磷酸化之2-胺基-2-[4-(3-苯甲氧基苯基硫基)-2-氯苯基]乙基-1，3-丙二醇或1-{4-[1-(4-環(huán)己基-3-三氟甲基-苯甲氧基亞胺基)_乙基]-2-乙基-苯甲基}-吖丁啶-3-羧酸或其藥學(xué)上可接受之鹽；免疫抑制單克隆抗體，例如白血球受體之單克隆抗體,例如Blys/BAFF受體、MHC,CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD52、CD58、⑶80、⑶86、IL-12受體、IL-17受體、IL-23受體或其配體；其它免疫調(diào)節(jié)化合物，例如具有CTLA4或其突變體之細(xì)胞外域之至少一部分的重組結(jié)合分子，例如與非CTLA4蛋白質(zhì)序列連接之CTLA4或其突變體之至少細(xì)胞外部分，例如CTLA41g(例如指定為ATCC68629)或其突變體，例如LEA29Y；粘附分子抑制物，例如LFA-I拮抗劑、ICAM-I或ICAM-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑、CCR9拮抗劑、MIF抑制物、5-胺基水楊酸鹽(5-ASA)齊IJ，如柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、Azulfidine(柳氮磺吡啶)、Asacol(安薩科)⑧、Dipentum(奧柳氮鈉)、Pentasa(頗得斯安)、Rowasa、Canasa、Colazal，例如含美沙拉秦(mesalamine)藥物，例如美沙拉秦與肝素之組合；TNF-α抑制物或抑制子，例如除本發(fā)明之TNF-α抑制物或抑制子以外，如結(jié)合TNF-α之抗體，例如英夫利昔單抗(infliximab)(Remicade)、氧化氮釋放型非類固醇抗炎藥(NSAID)，例如包括COX抑制型NO供體型藥物(CINOD)；磷酸二酯酶，例如PDE4B抑制物、胱天蛋白酶抑制物；“多功能抗炎”藥(MFAID)，例如胞質(zhì)磷脂酶A2(cPLA2)抑制物，如與糖胺聚糖連接之膜錨定的磷脂酶A2抑制物。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，一或多種優(yōu)選實(shí)施方案之TNF-α抑制化合物與一或多種非類固醇抗炎藥(NSAID)或治療關(guān)節(jié)炎或其它炎性疾病之其它藥物化合物組合提供。優(yōu)選化合物包括(但不限于)塞來考昔(celecoxib)；羅非考昔(rofecoxib)；NSAID，例如阿司匹林(aspirin)、塞來考昔、三水楊酸膽堿鎂(cholinemagnesiumtrisalicylate)、雙氯芬酸鉀(diclofenacpotassium)、雙氯芬酸鈉(diclofenacsodium)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮基布洛芬(ketoprofen)、酮洛酸(ketorolac)、甲芬那酸(melenamicacid)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生鈉(naproxensodium)、奧沙普秦(oxaprozin)、吡羅昔康(piroxicam)、羅非考昔、雙水楊酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)、及托美丁(tolmetin)；及皮質(zhì)類固醇(corticosteroid)，例如可的松(cortisone)、氫化可的松(hydrocortisone)、甲撥尼龍(methylprednisolone)、撥尼松(prednisone)、撥尼松龍(prednisolone)、倍他米松(betamethesone)、二丙酸氯地米松(beclomethasonedipropionate)、布地奈德(budesonide)、地塞米松磷酸鈉(dexamethasonesodiumphosphate)、氟尼縮松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasonepropionate)、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、倍他米松(betamethasone)、氟輕松(fluocinolone)、醋酸氟輕松(fluocinonide)、二丙酸倍他米松(betamethasonedipropionate)、戊酸倍他米松(betamethasonevalerate)、地奈德(desonide)、去輕米松(desoximetasone)、膚輕松(fluocinolone)、曲安西龍(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、丙酸氯倍他索(clobetasolpropionate)及地塞米松(dexamethasone)。在尤其優(yōu)選實(shí)施方案中，一或多種TNF-α抑制化合物與一或多種β刺激劑、吸入皮質(zhì)類固醇、抗組織胺劑、激素或治療哮喘、急性呼吸窘迫或其它呼吸道疾病之其它藥物化合物組合提供。優(yōu)選化合物包括(但不限于)β刺激劑，例如通常開出之支氣管擴(kuò)張藥；吸入皮質(zhì)類固醇，例如倍氯米松、氟替卡松、曲安西龍、莫米松(mometasone)及潑尼松形式(如潑尼松、潑尼松龍及甲潑尼龍)；抗組胺劑，例如阿扎他定(azatadine)、卡比沙、明/偽麻黃喊(carbinoxamine/pseudoephedrine)、西替禾Ijf1秦(cetirizine)、賽庚F(cyproheptadine)、右氣苯敏(dexchlorpheniramine)、與巨索定(fexofenadine)、氯雷他定(Ioratadine)、異丙嗪(promethazine)、曲吡那敏(tripelennamine)、溴苯那敏(brompheniramine)、氯苯那敏(cholopheniramine)、氯馬斯汀(clemastine)、苯海拉明(diphenhydramine)；及激素，例如腎上腺素。在尤其優(yōu)選實(shí)施方案中，一或多種TNF-α抑制化合物與一或多種麻醉劑組合提供，該一或多種麻醉劑例如乙醇、布比卡因(bupivacaine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、左布比卡因(Ievobupivacaine)、利多卡因(Iidocaine)、甲哌卡因(m印ivacaine)、普魯卡因(procaine)、羅哌卡因(ropivacaine)、丁卡因(tetracaine)、地氟燒(desflurane)、異氟烷(isoflurane)、開他敏(ketamine)、丙泊酚(propofol)、七氟烷(sevoflurane)、可待因(codeine)、芬太尼(fentanyl)、氫嗎啡酮(hydromorphone)、丁哌卡因(marcaine)、哌替唆(meperidine)、美沙酮(methadone)、嗎啡(morphine)、輕考酮(oxycodone)、瑞芬太尼(remifentanil)、舒芬太尼(sufentanil)、布托啡諾(butorphanol)、納布啡(nalbuphine)、曲馬多(tramadol)、苯佐卡因(benzocaine)、狄步卡因(dibucaine)、氯乙燒(ethylchloride)、賽洛卡因(xylocaine)及非那吡啶(phenazopyridine)。在尤其優(yōu)選實(shí)施方案中，一或多種TNF-α抑制化合物與治療過敏性腸病(irritableboweldisease)之藥物化合物(如硫唑嘌呤或皮質(zhì)類固醇)組合提供于藥物組合物中。在尤其優(yōu)選實(shí)施方案中，一或多種TNF-α抑制化合物與免疫抑制化合物組合提供于藥物組合物中，在尤其優(yōu)選實(shí)施方案中，一或多種TNF-α抑制與一或多種治療自體免疫病癥之藥物組合提供，所述藥物例如生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，如依那西普(etanerc印t)、英夫利昔單抗；及抑制或干擾腫瘤壞死因子之其它化合物。在尤其優(yōu)選實(shí)施方案中，一或多種TNF-α抑制化合物與類固醇組合提供，類固醇包括皮質(zhì)類固醇，例如可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松、潑尼松龍、倍他米松、二丙酸倍氯米松、布地縮松、地塞米松磷酸鈉、氟尼縮松、丙酸氟替卡松、曲安奈德、倍他米松、氟輕松、醋酸氟輕松、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、地奈德、去羥米松、膚輕松、曲安西龍、曲安奈德、丙酸氯倍他索及地塞米松。在某些疾病之治療中，用TNF-α抑制子與麻醉劑組合治療患者可為有益的，該麻醉劑例如乙醇、布比卡因、氯普魯卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、普魯卡因、羅哌卡因、丁卡因、地氟烷、異氟烷、開他敏、丙泊酚、七氟烷、可待因、芬太尼、氫嗎啡酮、丁哌卡因、哌替啶、美沙酮、嗎啡、羥考酮、瑞芬太尼、舒芬太尼、布托啡諾、納布啡、曲馬多、苯佐卡因、狄步卡因、氯乙烷、賽洛卡因及非那吡啶。體外合成哺乳動物β防御素如人β防御素2可使用如本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法通過體外合成制備。多種商業(yè)合成裝置是可用的，例如AppliedBiosystems公司、Beckman等之自動合成儀。通過使用合成儀，可用非天然氨基酸、尤其D-異構(gòu)物(或D-形式)(例如D-丙氨酸及D-異亮氨酸)、非對映異構(gòu)物、具有不同長度或官能團(tuán)之側(cè)鏈等取代天然存在之氨基酸。特定序列及制備方式將由適宜性、經(jīng)濟(jì)性、所需純度等確定。可提供與包含便于鍵聯(lián)的官能團(tuán)之多種肽或蛋白質(zhì)之化學(xué)連接，所述官能團(tuán)對于酰胺或經(jīng)取代胺形成(例如還原胺基化)而言為胺基，對于硫醚或二硫化物形成而言為硫醇基，對于酰胺形成而言為羧基等。如果需要，在合成期間或表達(dá)期間可向肽中引入多個允許與其它分子或表面連接之基團(tuán)。因此，可使用半胱氨酸制得硫醚，組氨酸用于連接于金屬離子復(fù)合物，羧基用于形成酰胺或酯，胺基用于形成酰胺及其類似物。也可根據(jù)重組合成之常規(guī)方法分離且純化哺乳動物β防御素。裂解物可由表達(dá)宿主制備，且裂解物可使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其它純化技術(shù)純化。本發(fā)明之其它方面及實(shí)施方案概述如下權(quán)利要求10.—種哺乳動物β防御素，其用于治療選自下組的炎性疾病或病癥類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、動脈粥樣硬化、硬皮病(全身性硬化)、狼瘡、全身性紅斑狼瘡(SLE)、(急性)腎小球性腎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫綜合征(ARDS)、血管炎、葡萄膜炎、皮炎、異位性/特應(yīng)性皮炎、毛發(fā)脫落、鼻炎(過敏性)、過敏性結(jié)膜炎、重癥肌無力、硬皮病、肉狀瘤病、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、格雷夫斯病、斯耶格倫氏綜合征及貝塞特氏病。權(quán)利要求11.如權(quán)利要求10之哺乳動物β防御素，其系胃腸外施用。權(quán)利要求12.如權(quán)利要求11之哺乳動物β防御素，其系皮下或靜脈內(nèi)施用。權(quán)利要求13.如權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)之哺乳動物β防御素，其為人β防御素。權(quán)利要求14.如權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)之哺乳動物β防御素，其與SEQIDNO=USEQIDN0:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4之氨基酸序列具有至少80%的同一性。權(quán)利要求15.如權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)之哺乳動物β防御素，其為人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。權(quán)利要求16.如權(quán)利要求10至15中任一項(xiàng)之哺乳動物β防御素，其與SEQIDNO2之氨基酸序列具有至少80%的同一性。權(quán)利要求17.如權(quán)利要求10至16中任一項(xiàng)之哺乳動物β防御素，其為人β防御素2。權(quán)利要求18.如權(quán)利要求10至17中任一項(xiàng)之哺乳動物β防御素，其中在所治療組織中TNF-α活性降低。本發(fā)明由下列實(shí)施例進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明之范圍。實(shí)施例實(shí)施例1人β防御素2(hBD2)之抗炎活性在測試hBD2之免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)期間，出乎意料地觀察到hBD2具有巨大的抗炎潛力。在人PBMC培養(yǎng)物中，觀察到用hBD2治療對LPS、LTA或肽聚糖刺激培養(yǎng)物之細(xì)胞因子譜產(chǎn)生重大影響。先前已觀察到hBD2能夠誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子及趨化因子IL-6、IL-1β、RANTES、IP-IO及IL-8(Niyonsaba等，2007;BoniottoΜ.等，2006)。此處，我們顯示hBD2對兩種促炎性細(xì)胞因子TNF及IL-Iβ具有下調(diào)潛力；且hBD2在酯多醣(LPS)、脂磷壁酸(LTA)或肽聚糖(PGN)誘導(dǎo)炎性刺激后也誘導(dǎo)IL-10。IL-10為潛在抗炎細(xì)胞因子且因此所得hBD2之效應(yīng)為抗炎效應(yīng)。人PBMC、單核細(xì)胞細(xì)胞系及類樹突細(xì)胞系(dendritoidcellline)已觀察到該結(jié)果。材料及方法hBD2之產(chǎn)牛重組產(chǎn)生hBD2。將編碼hBD2之合成DNA片段(DNA2.0)克隆入pET_32(+)表達(dá)載體(Novagen)中。所得質(zhì)體編碼翻譯融合肽，該翻譯融合肽含有N-末端硫氧還蛋白部分，繼之以his-標(biāo)記、腸激酶切割位點(diǎn)且最后為hBD2肽。將表達(dá)質(zhì)體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)菌株BL21中。在含有100微克/毫升氨芐青霉素之TB-甘油中將該菌株之過夜培養(yǎng)物稀釋100倍且在37°C生長至0D600為約8且用0.5mMIPTG誘導(dǎo)3小時，此后通過離心收獲細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在Ni-NTA珠(QIAGEN)上純化his標(biāo)記之trx_hBD2融合肽。接著將his-標(biāo)記純化的融合肽過夜透析于腸激酶緩沖劑(50mMtris-HCKpH7.5)UmMCaCl2)中，且用腸激酶切割以釋放成熟hBD2。使用Source15S基質(zhì)(AmershamBiosciences)通過陽離子交換層析進(jìn)一步純化hBD2肽。使用MALDI-T0F質(zhì)譜驗(yàn)證hBD2之正確分子量。使用相同的規(guī)程產(chǎn)生mBD3(參見實(shí)施例4)。隨后使用與LC-MS及NMR光譜偶聯(lián)之胰蛋白酶消化驗(yàn)證hBD2分子之適當(dāng)折迭及二硫橋拓?fù)鋵W(xué)。由制備型RP-HPLC在低pH值自hBD2及mBD3制備物移除內(nèi)毒素，且由LAL測定(EndosafeKTA2)測定內(nèi)毒素含量且發(fā)現(xiàn)水平低于測定之檢測限(0.05EU/mg)。為確定低于內(nèi)毒素測定之檢測限的水平不能刺激PBMC，作以極有效脂多醣(大腸桿菌，0111:B4,SigmaL4391)刺激之滴定曲線。極低水平之該LPS(0.06ng/ml)能夠刺激PBMC產(chǎn)生可檢測之細(xì)胞因子。分離及刺激PBMC自健康志愿者(經(jīng)丹麥相關(guān)倫理委員會批準(zhǔn))抽取外周血。用RPMI1/1(ν/ν)稀釋肝素化血液，且在抽取的2小時內(nèi)使之進(jìn)行Ficoll密度離心。自個別供體之上層收集血漿且保持在冰上直至其以2%用于培養(yǎng)基中(自體培養(yǎng)基)。將經(jīng)分離PBMC重懸于自體培養(yǎng)基中且接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔255，000個細(xì)胞，總體積為200微升。以100、10或1μg/mlhBD2單獨(dú)刺激或與0.6ng/mL或20ng/mLLPS(大腸桿菌，0111:B4,SigmaL4391)、1.25μg/ml脂磷壁酸(LTA)(來自枯草桿菌(B.subtilis)，SigmaL3265)或40μg/ml肽聚糖(PGN)(來自金黃色葡萄球菌(S.aureus),Sigma77140)一起刺激來自相同供體之PBMC。在最初實(shí)驗(yàn)中針對3種不同供體優(yōu)化用于刺激之濃度，對于LPS，使用兩種不同濃度以確保其處于有可能調(diào)節(jié)之細(xì)胞因子水平。在一些實(shí)驗(yàn)中，用地塞米松及吲哚美辛單獨(dú)以及與LPS或LTA—起處理PBMC作為下調(diào)炎性細(xì)胞因子之對照。在37°C溫育24小時后收集上清液，且儲存在_80°C直至測量細(xì)胞因子。在所有實(shí)驗(yàn)中由AlamarBlue(Biosource，DALLl100)測量生存力，且在一些情況下也根據(jù)制造商之說明書由MTS(Promega)測量生存力，且在一些實(shí)驗(yàn)中，也通過以Nucleocounter計數(shù)細(xì)胞來判斷。培養(yǎng)及刺激MUTZ-3將人骨髓白血病衍生之細(xì)胞系MUTZ_3(DSMZ，Braunschweig,Germany)維持在補(bǔ)充有20%[體積/體積(ν/ν)]胎牛血清(SigmaF6178)及40ng/mlrhGM-CSF(R&DSystems215-GM-050)的a-MEM(SigmaM4526)中。所述祖細(xì)胞位于以下說明之單核細(xì)胞細(xì)胞系中且所述單核細(xì)胞用100、10或1μg/mlhBD2單獨(dú)刺激或與LPS或LTA—起刺激。樹突細(xì)胞分化為產(chǎn)生類樹突細(xì)胞系，使人骨髓白血病細(xì)胞系MUTZ-3(1XIO5個細(xì)胞/毫升)在rhGM-CSF(150ng/ml)及rhlL_4(50ng/ml)存在下分化成不成熟DC歷時7天。每2_3天更換培養(yǎng)基。進(jìn)一步在hBD2存在或不存在下用LPS或LTA刺激分化之細(xì)胞系以探索hBD2對樹突細(xì)胞之效應(yīng)。細(xì)胞因子測量在FACSarray流式細(xì)胞儀上根據(jù)制造商之說明書(BD)用人發(fā)炎細(xì)胞計數(shù)珠陣列(CBA)通過流式細(xì)胞術(shù)測量上清液中細(xì)胞因子之產(chǎn)生。測量以下細(xì)胞因子IL-8、IL-Iβ、IL-10、TNF、IL-12p70、IL-6。在一些實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)制造商之說明書由R&Dsystems之ELISA套組(IL-10、TNF-α、IL-Iβ)測量細(xì)胞因子。數(shù)據(jù)分析所有實(shí)驗(yàn)執(zhí)行至少兩次，顯示代表性結(jié)果。所呈現(xiàn)之?dāng)?shù)據(jù)可以平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。由變量為治療(hBD2、地塞米松等)及刺激(LPS、LTA、肽聚糖等)之雙因子O-way)AN0VA，然后是Bonferroni后檢驗(yàn)(post-test)確定統(tǒng)計顯著性，如表標(biāo)注中所報導(dǎo)的。ρ<0.05視為差異顯著。MM測試hBD2對經(jīng)或未經(jīng)LPS及LTA治療之人PBMC之效應(yīng)(表1、2及幻。hBD2之治療使得所有三個測試濃度之刺激培養(yǎng)物中之TNF顯著下調(diào)(表1)，該下調(diào)對0.6ng/ml之LPS而言及對LTA而言系劑量依賴的。對于IL-Iβ，主要在最高劑量下觀察到下調(diào)(表2)。引人關(guān)注的是IL-10劑量依賴性顯著上調(diào)(表幻。促炎性細(xì)胞因子之下調(diào)及抗炎細(xì)胞因子之誘導(dǎo)顯示hBD2之極強(qiáng)抗炎潛力。由兩種不同測定測量生存力以排除hBD2歸因于細(xì)胞毒性效應(yīng)之抗炎效應(yīng)。在表4及表5中，可見hBD2不對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)，所觀察到之效應(yīng)為歸因于導(dǎo)致細(xì)胞增殖之LPS或LTA之刺激的刺激效應(yīng)。因此，hBD2對所述細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性效應(yīng)。在表6、7及8中，由ELISA而不是由流式細(xì)胞術(shù)以細(xì)胞計數(shù)珠陣列分析另一供體之上清液之細(xì)胞因子，此處觀察到相同結(jié)果，但測定之靈敏度較低且檢測限高得多，且因此效應(yīng)不顯著。為測試另一鐸樣受體配體，研究hBD2對肽聚糖刺激之PBMC的效應(yīng)(表9及10)。觀察到相同結(jié)果TNF劑量依賴性下調(diào)且IL-10劑量依賴性誘導(dǎo)。作為TNF下調(diào)之陽性對照，在測定中測試兩種抗炎化合物，地塞米松及吲哚美辛。選擇濃度以使化合物無毒且為由于培養(yǎng)基中之溶解度可實(shí)現(xiàn)之濃度。經(jīng)LTA刺激后，僅吲哚美辛抑制TNF(表11)，而地塞米松有效下調(diào)TNF產(chǎn)生，IL-Iβ也觀察到相同結(jié)果(表13)。吲哚美辛為C0X-1及C0X-2抑制物且為用于治療輕度至中度疼痛之非類固醇抗炎藥(NSAID)且有助于減輕關(guān)節(jié)炎之癥狀，且地塞米松為主要用于治療炎性病癥之合成糖皮質(zhì)激素且其在極低劑量下對促炎性細(xì)胞因子具有極有效的下調(diào)效應(yīng)(Rowland等，1998)，對于TNF-α及IL-Iβ，我們也觀察到相同結(jié)果。hBD2與該兩種抗炎化合物一樣有效或比其更好。在表14及15中，顯示了hBD2對單核細(xì)胞細(xì)胞系中之下調(diào)TNF及樹突細(xì)胞的效應(yīng)，對PBMC也觀察到相同結(jié)果。經(jīng)hBD2及LPS或hBD2及LTA刺激之樹突細(xì)胞也誘導(dǎo)IL-10(結(jié)果未顯不)。為排除hBD2與LPS或LTA之結(jié)合引起TNF及IL-Iβ之下調(diào)，測試hBD2對合成配體(Pam3CSK4(TLR2-TLR1配體)，InvivoGentlrt-pms)所致之PBMC刺激的效應(yīng)。在經(jīng)該配體刺激后，hBD2也能夠下調(diào)TNF，表明LPS或LTA之中和不會引起所觀察到的效應(yīng)(結(jié)果未顯示)。此外，含有TNF-α及IL-a之細(xì)胞因子混合物(cocktail)連同hBD2對樹突細(xì)胞之刺激與單獨(dú)用細(xì)胞因子混合物之刺激相比對IL-Iβ及IL-8及IL-6具有下調(diào)效應(yīng)。顯然，未分析到歸因于TNF-α之刺激之對TNF的效應(yīng)(結(jié)果未顯示)。表1在hBD2存在及不存在下經(jīng)LPS或LTA處理后，自人外周血單核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生TNF，所有樣本針對相同供體測試，出自5個供體之代表性實(shí)驗(yàn)。在FACSarray上由細(xì)胞計數(shù)珠陣列(CBA)測量TNF，_指由雙因子ANOVA分析(各數(shù)據(jù)組之N=約200)，與各自對照(粗體)相比，ρ<0.001。權(quán)利要求1.哺乳動物β防御素在制造用于治療選自下組的炎性疾病或病癥的藥物中的用途類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、動脈粥樣硬化、硬皮病(全身性硬化)、狼瘡、全身性紅斑狼瘡(SLE)、(急性)腎小球性腎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫綜合征(ARDS)、血管炎、葡萄膜炎、皮炎、異位性/特應(yīng)性皮炎、毛發(fā)脫落、鼻炎(過敏性)、過敏性結(jié)膜炎、重癥肌無力、硬化性皮炎、肉狀瘤病、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、格雷夫斯病(Gravesdisease)、斯耶格倫氏綜合征(Sjogren'ssyndrome)、及貝塞特氏病(Behfetdisease)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中該藥物是胃腸外施用的。3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中該藥物是皮下或靜脈內(nèi)施用的。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動物β防御素以約0.001mg/kg體重至約10mg/kg體重，優(yōu)選約0.01mg/kg體重至約10mg/kg體重的每日劑量施用。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動物β防御素為人β防御素。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動物β防御素與SEQIDNO=USEQIDNO2,SEQIDNO:3或SEQIDNO4的氨基酸序列具有至少80%的同一性。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的用途，其中該人β防御素為人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動物β防御素與SEQIDΝ0:2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的用途，其中該哺乳動物β防御素為人β防御素2。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中TNF-α活性在所治療的組織中降低。11.一種治療哺乳動物組織中的炎性疾病或病癥的方法，其包括向需要所述治療的哺乳動物以有效量施用哺乳動物β防御素，其中該炎性疾病或病癥選自下組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、動脈粥樣硬化、硬皮病(全身性硬化)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡、(急性)腎小球性腎炎、哮喘(如支氣管哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫綜合征(ARDS)、炎性腸病(例如克羅恩氏病(Crohn'sdisease))、結(jié)腸炎(例如潰瘍性結(jié)腸炎)、血管炎、葡萄膜炎、皮炎(例如炎性皮炎)、異位性/特應(yīng)性皮炎、毛發(fā)脫落、鼻炎(過敏性)、過敏性結(jié)膜炎、重癥肌無力、硬化性皮炎、肉狀瘤病、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、格雷夫斯病、斯耶格倫氏綜合征、及貝塞特氏病。12.權(quán)利要求11的方法，其中該有效量有效降低所治療組織中之TNF-α活性。13.權(quán)利要求11的方法，其中該人β防御素是胃腸外施用的，如皮下或靜脈內(nèi)施用的。14.權(quán)利要求11的方法，其中該哺乳動物β防御素以約0.01mg/kg體重至約10mg/kg體重，優(yōu)選約0.lmg/kg體重至約10mg/kg體重的每日劑量施用。15.權(quán)利要求11的方法，其中該哺乳動物β防御素為人β防御素。16.權(quán)利要求11的方法，其中該哺乳動物β防御素與SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO4之氨基酸序列具有至少80%的同一性。17.權(quán)利要求11的方法，其中該哺乳動物β防御素與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80%的同一性。18.權(quán)利要求11的方法，其中該人β防御素為人β防御素1、人β防御素2、人β防御素3或人β防御素4。全文摘要本發(fā)明系關(guān)于使用哺乳動物β防御素抑制TNF-α活性，其在治療與腫瘤壞死因子α相關(guān)之病理學(xué)病狀具有效用。文檔編號A61P19/00GK102159232SQ200980136342公開日2011年8月17日申請日期2009年7月17日優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日發(fā)明者伯吉特·安德森,卡羅琳·S·布林奇,坦賈·M·R·凱爾,托馬斯·克魯澤,澤倫·凱拉爾夫,珀?duì)枴·邁金德申請人:諾維信阿德寧生物技術(shù)公司