菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽粕制備菜籽肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中采用單純的混菌固態(tài)發(fā)酵存在的導(dǎo)致菜籽肽得率比較低的問(wèn)題。利用具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌及霉菌與蛋白酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵菜籽粕制備菜籽肽，通過(guò)菜籽粕粉碎、制備發(fā)酵劑、固態(tài)發(fā)酵、滅酶、分離去除殘?jiān)?、脫色、脫苦、脫鹽、分離純化和干燥等步驟獲得菜籽肽粉。本發(fā)明利用細(xì)菌及霉菌與蛋白酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵制備多肽，一方面微生物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物及酶類，能水解蛋白質(zhì)并有效降解菜籽粕中的有毒物質(zhì)，與酶解法相比，提高效率的同時(shí)也大大降低了苦味；另一方面中性蛋白酶的加入將輔助作用于肽段，與單純微生物發(fā)酵相比將大大增強(qiáng)蛋白質(zhì)的降解程度，提高菜籽肽得率。
【專利說(shuō)明】菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽粕制備菜籽肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物酶解發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是世界上油菜籽產(chǎn)量最大的國(guó)家，油菜籽資源十分豐富。油菜籽經(jīng)加工可得到約35%的菜籽油和65%的餅柏，菜籽餅柏中所含的菜籽蛋白高達(dá)35%~42%，其氨基酸含量非常豐富且平衡性強(qiáng)，幾乎不存在限制性氨基酸，是一種非常優(yōu)良的蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與酪蛋白和動(dòng)物蛋白相媲美。然而菜籽餅柏中含有較多硫甙、植酸、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)成分，這就導(dǎo)致菜籽餅柏作為植物蛋白資源在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制。
[0003]隨著對(duì)蛋白質(zhì)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，人類攝食的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作用后，更多是以低聚肽(如二肽、三肽等)形式被吸收。菜籽肽是以菜籽蛋白或菜籽柏作為原材料，通過(guò)物理方法、化學(xué)方法或酶法處理后所得到的一種小分子蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)較菜籽蛋白更為簡(jiǎn)單且分子量更小，具有較好的蛋白質(zhì)功能特性:溶解性、起泡性、乳化性，且與菜籽蛋白的氨基酸組成幾乎完全一致，從而更容易被動(dòng)物體攝入和吸收。
[0004]肽的制備主要是將大分子蛋白質(zhì)用化學(xué)或酶的方法水解成小分子的肽鏈，其水解過(guò)程是蛋白質(zhì)首先被水解成大分子肽，再得到小分子肽，若進(jìn)一步水解，將最終得到游離氨基酸。目前利用菜籽柏或菜籽蛋白制備菜籽生物活性肽的方法主要有:化學(xué)水解法、酶水解法?；瘜W(xué)水解法不能按規(guī)定水解程度進(jìn)行水解、生產(chǎn)條件較苛刻、破壞了氨基酸原有的構(gòu)型，從而降低了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；酶水解法是目前我國(guó)制備多肽最常用的方法，但生產(chǎn)所用酶制劑用量大、價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本較高，且不能完全脫除菜籽柏或菜籽蛋白中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，難以形成大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]中國(guó)專利CN101440390提供一種混菌固態(tài)發(fā)酵制備菜籽活性肽的方法，將通過(guò)壓榨或浸出制油工藝得到的菜籽柏粉碎，獲得粉碎的菜籽柏；將枯草芽孢桿菌、乳酸菌或產(chǎn)朊假絲酵母之一與雅致放射毛霉或宇佐美曲霉復(fù)配，制備發(fā)酵劑；將所述發(fā)酵劑接入所述粉碎的菜籽柏，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；加水提取所述固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基，分離去除殘?jiān)?，得到菜籽活性肽的粗提液；將所述粗提液?jīng)過(guò)脫色、脫鹽和干燥獲得菜籽活性肽。但是，采用單純的混菌固態(tài)發(fā)酵，雖其脫毒效果較好，但發(fā)酵周期較長(zhǎng)，且隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵罐中菌數(shù)增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，其所產(chǎn)蛋白酶活力即趨于平緩，這就導(dǎo)致菜籽肽得率比較低。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種菌酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵制備菜籽肽的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中采用單純的混菌固態(tài)發(fā)酵存在的導(dǎo)致菜籽肽得率比較低的問(wèn)題。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，利用具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌及霉菌與蛋白酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽，具體步驟為:a.將通過(guò)壓榨或浸出制油工藝得到的菜籽柏粉碎，得到菜籽柏粉；
b.將具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌與霉菌復(fù)配，制備發(fā)酵劑；
c.將步驟b制得的發(fā)酵劑與中性蛋白酶接入步驟a所得的菜籽柏粉，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；
d.對(duì)步驟c所得的固態(tài)發(fā)酵后基質(zhì)進(jìn)行滅酶；
e.加水浸提步驟d中固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基，分離去除殘?jiān)?，獲得菜籽肽的粗提液；
f將步驟e所得菜籽肽粗提液經(jīng)過(guò)脫色、脫苦、脫鹽、分離純化和干燥獲得菜籽肽粉。
[0008]優(yōu)選的，步驟a中所述菜籽柏的原料是普通油菜籽或雙低油菜籽，粉碎后的菜籽柏粉的粒徑為200-800μπι，粉碎后的菜籽柏直接用于發(fā)酵或者經(jīng)過(guò)105°C ~121°C溫度滅菌或濕熱滅菌后用于發(fā)酵。
[0009]優(yōu)選的，步驟b中，所述的具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌為枯草芽孢桿菌，霉菌為雅致放射毛霉菌。
[0010]優(yōu)選的，步驟b中，制備發(fā)酵劑的步驟為:
b-Ι.配制無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液，其組成為:葡萄糖與無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液體積的質(zhì)量體積比為0.5%~l%g/mL, KH2PO4與無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液體積的質(zhì)量體積比為0.3%~0.5%g/mL, pH為6.0-8.0 ；
b-2.將活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后的微生物菌種，用步驟b-Ι中配置的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液配制成菌種量為IX IO6~IX IO8個(gè)/mL的菌懸液，即為發(fā)酵劑。
[0011]優(yōu)選的，步驟c中，發(fā)酵劑的加入總量為菜籽柏質(zhì)量的I~1.5倍，枯草芽孢桿菌與雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑體積比為1:1~4:1，中性蛋白酶添加量為50~250U/g，發(fā)酵劑與中性蛋白酶同步或分步接入菜籽柏粉中，發(fā)酵溫度為25°C~45°C，發(fā)酵時(shí)間為I~5天，環(huán)境濕度40%~100%，發(fā)酵容器為固態(tài)發(fā)酵罐或發(fā)酵池。
[0012]優(yōu)選的，步驟c中，中性蛋白酶經(jīng)溫度為40°C的溫水活化Ih后接入菜籽柏粉。
[0013]優(yōu)選的，步驟d中，滅酶條件為:水浴，溫度95°C~100°C，時(shí)間l(Tl5min。
[0014]優(yōu)選的，步驟e中所述的水為去離子水、蒸餾水或自來(lái)水，固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基與水的固液比1:5~l:30g/mL，提取溫度為15。。~80°C，提取時(shí)間為3(Tl80min，提取I~3次。
[0015]優(yōu)選的，步驟e中，分離去除殘?jiān)姆椒檫^(guò)濾或離心，其中，所述過(guò)濾采用真空過(guò)濾器或壓力過(guò)濾器，所述離心的離心力為1000~14000g。
[0016]優(yōu)選的，步驟f 中，所述脫色、脫苦的步驟采用活性炭；所述脫鹽的步驟采用離子交換色譜或反滲透；所述分離純化的步驟為:通過(guò)截留分子量為30KDa、10KDa、5kDa，3kDa和IkDa的超濾膜超濾，獲得五種不同生物活性的菜籽肽，或采用離子交換、凝膠層析、親和層析方法，獲得生物活性專一的菜籽肽；所述干燥的步驟為熱風(fēng)干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，直接以菜籽柏為原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽，原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，不需要對(duì)其進(jìn)行酸、堿的處理，更不需要分離出菜籽蛋白，生產(chǎn)規(guī)模大，變廢為寶，有利于環(huán)境保護(hù)；本發(fā)明利用具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌及霉菌與蛋白酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵取代單純菌種發(fā)酵或純酶制劑水解菜籽蛋白制備多肽，一方面微生物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物及酶類，能水解蛋白質(zhì)并有效降解菜籽柏中的有毒物質(zhì)，與酶解法相比，提高效率的同時(shí)也大大降低了苦味，且降低了成本；另一方面中性蛋白酶的加入將輔助作用于肽段，與單純微生物發(fā)酵相比將大大增強(qiáng)蛋白質(zhì)的降解程度，提高菜籽肽得率。因此，此方法結(jié)合微生物發(fā)酵與酶解，反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境友好，是一種低成本、適合工業(yè)化大批量制備菜籽肽的方法。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0020]一種菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，利用具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌及霉菌與蛋白酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽，具體步驟為:
(1)將通過(guò)壓榨或浸出制油工藝得到的菜籽柏粉碎，得到菜籽柏粉；菜籽柏的原料是普通油菜籽或雙低油菜籽，粉碎后的菜籽柏粉的粒徑為200-800 μ m，粉碎后的菜籽柏直接用于發(fā)酵或者經(jīng)過(guò)105°C ~121°C溫度滅菌或濕熱滅菌后用于發(fā)酵；
(2)將具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌與霉菌復(fù)配，制備發(fā)酵劑；具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌優(yōu)選為枯草芽孢桿菌，霉菌優(yōu)選為雅致放射毛霉菌；
制備發(fā)酵劑的步驟為:
(2-1)配制無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液，其組成為:葡萄糖與無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液體積的質(zhì)量體積比為0.5%~l%g/mL, KH2PO4與無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液體積的質(zhì)量體積比為0.3%~0.5%gmL, pH為6.0-8.0 ；
(2-2)將活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后的微生物菌種，用步驟(2-1)中配置的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液配制成菌種量為IX IO6~IX IO8個(gè)/mL的菌懸液，即為發(fā)酵劑；
(3)將步驟(2)制得的發(fā)酵劑與中性蛋白酶接入步驟(1)所得的菜籽柏粉，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；發(fā)酵劑的加入總量為菜籽柏質(zhì)量的I~1.5倍，枯草芽孢桿菌與雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑體積比為1:1~4:1，中性蛋白酶添加量為50~250U/g，發(fā)酵劑與中性蛋白酶同步或分步接入菜籽柏粉中，發(fā)酵溫度為25°C~45°C，發(fā)酵時(shí)間為I~5天，環(huán)境濕度40%~100%，發(fā)酵容器為固態(tài)發(fā)酵罐或發(fā)酵池；中性蛋白酶經(jīng)溫度為40°C的溫水活化Ih后接入菜籽柏粉。
[0021](4)對(duì)步驟(3)所得的固態(tài)發(fā)酵后基質(zhì)進(jìn)行滅酶；滅酶條件為:水浴，溫度95°C~100。。，時(shí)間 10~15min ；
(5)加水浸提步驟(4)中固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基，分離去除殘?jiān)?，獲得菜籽肽的粗提液；加水浸提的水為去離子水、蒸餾水或自來(lái)水，固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基與水的固液比1:5~l:30g/mL，提取溫度為15°C~80°C，提取時(shí)間為3(Tl80min，提取f 3次；分離去除殘?jiān)姆椒檫^(guò)濾或離心，其中，所述過(guò)濾采用真空過(guò)濾器或壓力過(guò)濾器，所述離心的離心力為1000 ~14000g ；
(6)將步驟(5)所得菜籽肽粗提液經(jīng)過(guò)脫色、脫苦、脫鹽、分離純化和干燥獲得菜籽肽粉；脫色、脫苦的步驟采用活性炭；所述脫鹽的步驟采用離子交換色譜或反滲透；所述分離純化的步驟為:通過(guò)截留分子量為30KDa、10KDa、5kDa，3kDa和IkDa的超濾膜超濾，獲得五種不同生物活性的菜籽肽，或采用離子交換、凝膠層析、親和層析方法，獲得生物活性專一的菜籽肽；所述干燥的步驟為熱風(fēng)干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0023]實(shí)施例1
混菌與酶分步固態(tài)發(fā)酵菜籽柏生產(chǎn)菜籽肽枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ;營(yíng)養(yǎng)瓊脂2.0g ；自來(lái)水IOOmL ；pH7.2~7.4。
[0024]種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ；自來(lái)水IOOmL ；pH 7.2~7.4。
[0025]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖5.0g ；KH2P043.0g ;無(wú)菌水 1000mL ；ρΗ 7.0。
[0026]發(fā)酵劑的制備:從活化后的菌種保藏斜面中，挑取兩環(huán)枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，8層紗布封口，35°C，120r/min，搖床培養(yǎng)24h，使菌體濃度達(dá)到IO8個(gè)/mL。用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液稀釋種子液，配制成菌體濃度為3X107個(gè)/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑。
[0027]雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯30g，葡萄糖2g，瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0028]平板擴(kuò)大培養(yǎng)基:馬鈴薯30g，葡萄糖2g,瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0029]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖5.0g ；KH2P043.0g ;無(wú)菌水 1000mL ；pH 7.0。
[0030]發(fā)酵劑的制備:雅致放射毛霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28°C恒溫培養(yǎng)4d，然后接種于平板28°C下擴(kuò)大培養(yǎng)，4d后用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液洗下孢子，并將其濃度調(diào)整為3 X IO7個(gè)/mL。
[0031]將上述枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑按體積比3:1混合即為混菌發(fā)酵劑。
[0032]中性蛋白酶經(jīng)溫度為400C的溫水活化Ih。
[0033]將菜籽柏粉碎后過(guò)40目篩，滅菌，于發(fā)酵罐內(nèi)，按固液比1:1.5的比例加入發(fā)酵劑，發(fā)酵溫度為35°c，環(huán)境濕度為90%，定時(shí)攪拌通風(fēng)，發(fā)酵I天后，按150U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，相同條件下再發(fā)酵2天，然后在95°C下水浴IOmin滅酶，按固液質(zhì)量比1:15的比例加入蒸餾水，30°C下浸提30min，低速離心(離心力為2500g)分離去除柏渣，再高速離心(離心力為14000g)除菌除雜，獲得菜籽肽粗提液。
[0034]向菜籽肽粗提液中加入10g/L活性炭，于50°C脫色、脫苦l(xiāng)h，然后高速離心(離心力為14000g)除雜，上清液經(jīng)冷凍干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉，其中蛋白質(zhì)含量83%(干基，NX 6.25)，分子量在IkDa~5kDa的肽含量為62%。
[0035]實(shí)施例2
混菌與酶同步固態(tài)發(fā)酵菜籽柏生產(chǎn)菜籽肽 枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ;營(yíng)養(yǎng)瓊脂2.0g ；自來(lái)水IOOmL ；pH7.2~7.4。
[0036]種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ；自來(lái)水IOOmL ；pH 7.2^7.4。
[0037]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖5.0g ；KH2P043.6g ;無(wú)菌水 1000mL ；pH 6.5。
[0038]發(fā)酵劑的制備:從活化后的菌種保藏斜面中，挑取兩環(huán)枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，8層紗布封口，35°C，120r/min，搖床培養(yǎng)24h，使菌體濃度達(dá)到IO8個(gè)/mL。用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液稀釋種子液，配 制成菌體濃度為3X107個(gè)/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑。
[0039]雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯30g，葡萄糖2g，瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0040]平板擴(kuò)大培養(yǎng)基:馬鈴薯30g，葡萄糖2g,瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0041]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖5.0g ；KH2P043.6g ;無(wú)菌水 1000mL ；pH 6.5。[0042]發(fā)酵劑的制備:雅致放射毛霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28°C恒溫培養(yǎng)4d，然后接種于平板28°C下擴(kuò)大培養(yǎng)，4d后用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液洗下孢子，并將其濃度調(diào)整為3 X IO7個(gè)/mL。
[0043]將上述枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑按體積比4:1混合即為混菌發(fā)酵劑。
[0044]中性蛋白酶經(jīng)溫度為400C的溫水活化Ih。
[0045]將菜籽柏粉碎后過(guò)40目篩，滅菌，于發(fā)酵罐內(nèi)，按固液比1:1.35的比例加入發(fā)酵劑，同時(shí)按150U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆颍l(fā)酵溫度為40°C，環(huán)境濕度為90%,定時(shí)攪拌通風(fēng),發(fā)酵3天后,在95°C下水浴IOmin滅酶,按固液比1:15的比例加入蒸餾水，30°C下浸提30min，低速離心(離心力為2500g)分離去除柏渣，再高速離心(離心力為14000g)除菌除雜，獲得菜籽肽粗提液。
[0046]菜籽肽粗提液經(jīng)過(guò)活性炭柱、脫鹽柱(HiPap? 26/10,流速30mL/min，室溫)脫色、脫苦、脫鹽后，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白質(zhì)含量88% (干基，NX6.25)，分子量在IkDa~5kDa的肽含量為65%。
[0047]實(shí)施例3
混菌與酶同步固態(tài)發(fā)酵菜籽柏生產(chǎn)菜籽活性肽 與實(shí)施例2不同之處在于，按下列方法進(jìn)行提純:
菜籽肽粗提液經(jīng)過(guò)活性炭柱、脫鹽柱(HiPi^p? 26/10,流速30mL/min，室溫)脫色、脫苦、脫鹽后，再分別通過(guò)截留分子量為30kDa、10kDa、5kDa、3kDa和IkDa的超濾膜進(jìn)行超濾，收集不同截留分子量的濾液，經(jīng)冷凍干燥得到生物活性不同的五個(gè)組分菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白質(zhì)含量90% (干基，NX6.25)，分子量在IkDa~5kDa的肽含量為70%。
[0048]分子量范圍在IkDa~3kDa的組分再經(jīng)過(guò)離子交換(HiTrap?離子交換柱SP XL;流速lmL/min,磷酸鹽緩沖液ρΗ7.0,室溫)和凝膠過(guò)濾(Superdex Peptide HR 10/30 ;流速
0.5mL/min，室溫)純化后，經(jīng)冷凍干燥得到生物活性專一的菜籽肽。
[0049]實(shí)施例4
混菌與酶分步固態(tài)發(fā)酵菜籽柏生產(chǎn)菜籽肽 枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ;營(yíng)養(yǎng)瓊脂2.0g ；自來(lái)水IOOmL ；pH7.2~7.4。
[0050]種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ；自來(lái)水IOOmL ；pH 7.2~7.4。
[0051]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖10.0g ；KH2P045.0g ;無(wú)菌水 1000mL ；ρΗ 8.0。
[0052]發(fā)酵劑的制備:從活化后的菌種保藏斜面中，挑取兩環(huán)枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，8層紗布封口，35°C，120r/min，搖床培養(yǎng)24h，使菌體濃度達(dá)到IO8個(gè)/mL。用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液稀釋種子液，配制成菌體濃度為I X IO6個(gè)/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑。
[0053]雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯30g，葡萄糖2g，瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0054]平板擴(kuò)大培養(yǎng)基:馬鈴薯30g,葡萄糖2g,瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0055]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖10.0g ；KH2P045.0g ;無(wú)菌水 1000mL ；pH 8.0。
[0056]發(fā)酵劑的制備:雅致放射毛霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28°C恒溫培養(yǎng)4d，然后接種于平板28°C下擴(kuò)大培養(yǎng)，4d后用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液洗下孢子，并將其濃度調(diào)整為I X IO6個(gè)/mL。[0057]將上述枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑按體積比1:1混合即為混菌發(fā)酵劑。
[0058]中性蛋白酶經(jīng)溫度為400C的溫水活化Ih。
[0059]將菜籽柏粉碎后過(guò)40目篩，滅菌，于發(fā)酵罐內(nèi)，按固液比1:1的比例加入發(fā)酵劑，發(fā)酵溫度為25°C，環(huán)境濕度為40%，定時(shí)攪拌通風(fēng)，發(fā)酵2天后，按50U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，相同條件下再發(fā)酵3天，然后在100°C下水浴12min滅酶，按固液質(zhì)量t匕1:5的比例加入蒸餾水，15°C下浸提180min，提取3次，低速離心(離心力為1000g)分離去除柏渣，再高速離心(離心力為14000g)除菌除雜，獲得菜籽肽粗提液。
[0060]菜籽肽粗提液經(jīng)過(guò)活性炭柱、脫鹽柱(HiPrepTM 26/10,流速30mL/min,室溫)脫色、脫苦、脫鹽后，再分別通過(guò)截留分子量為30kDa、10kDa、5kDa、3kDa和IkDa的超濾膜進(jìn)行超濾，收集不同截留分子量的濾液，經(jīng)冷凍干燥得到生物活性不同的五個(gè)組分菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白質(zhì)含量78% (干基，NX6.25)，分子量在IkDaIkDa的肽含量為56%。
[0061]分子量范圍在IkDa~3kDa的組分再經(jīng)過(guò)離子交換(HiTrapTM離子交換柱SP XL ；流速lmL/min,磷酸鹽緩沖液ρΗ7.0,室溫)和凝膠過(guò)濾(Superdex Peptide HR 10/30 ;流速
0.5mL/min，室溫)純化后，經(jīng)冷凍干燥得到生物活性專一的菜籽肽。
[0062]實(shí)施例5
混菌與酶同步固態(tài)發(fā)酵菜籽柏生產(chǎn)菜籽肽 枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ;營(yíng)養(yǎng)瓊脂2.0g ；自來(lái)水IOOmL ；pH
7.2~7.4。
[0063]種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ；自來(lái)水IOOmL ；pH 7.2^7.4。
[0064]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖7.0g ；KH2P044.0g ;無(wú)菌水 1000mL ；pH 6。
[0065]發(fā)酵劑的制備:從活化后的菌種保藏斜面中，挑取兩環(huán)枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，8層紗布封口，35°C，120r/min，搖床培養(yǎng)24h，使菌體濃度達(dá)到IO8個(gè)/mL。用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液稀釋種子液，配制成菌體濃度為I X IO8個(gè)/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑。
[0066]雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑的制備: 斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯30g，葡萄糖2g，瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0067]平板擴(kuò)大培養(yǎng)基:馬鈴薯30g,葡萄糖2g,瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0068]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖7.0g ；KH2P044.0g ;無(wú)菌水 1000mL ；pH 6。
[0069]發(fā)酵劑的制備:雅致放射毛霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28°C恒溫培養(yǎng)4d，然后接種于平板28°C下擴(kuò)大培養(yǎng)，4d后用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液洗下孢子，并將其濃度調(diào)整為I X IO8個(gè)/mL。
[0070]將上述枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑按體積比2:1混合即為混菌發(fā)酵劑。
[0071 ] 中性蛋白酶經(jīng)溫度為40 V的溫水活化Ih。
[0072]將菜籽柏粉碎后過(guò)40目篩，滅菌，于發(fā)酵罐內(nèi)，按固液比1:1.25的比例加入發(fā)酵劑，同時(shí)按250U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，發(fā)酵溫度為45 V，環(huán)境濕度為100%,定時(shí)攪拌通風(fēng),發(fā)酵I天后,在98°C下水浴15min滅酶,按固液比1:30的比例加入蒸餾水，80°C下浸提lOOmin，提取2次，低速離心(離心力為1000g)分離去除柏渣，再高速離心(離心力為12000g)除菌除雜，獲得菜籽肽粗提液。[0073]向菜籽肽粗提液中加入10g/L活性炭，于50°C脫色、脫苦l(xiāng)h，然后高速離心(離心力為14000g)除雜，上清液經(jīng)冷凍干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉，其中蛋白質(zhì)含量81%(干基，NX 6.25)，分子量在IkDa~5kDa的肽含量為72%。
[0074]實(shí)施例6
混菌與酶同步固態(tài)發(fā)酵菜籽柏生產(chǎn)菜籽肽 枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ;營(yíng)養(yǎng)瓊脂2.0g ；自來(lái)水IOOmL ；pH
7.2~7.4。
[0075]種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.3g ;蛋白胨1.0g ；NaCl 0.5g ；自來(lái)水IOOmL ；pH 7.2~7.4。
[0076]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖8.0g ；KH2P045.0g ;無(wú)菌水 1000mL ；ρΗ 7。
[0077]發(fā)酵劑的制備:從活化后的菌種保藏斜面中，挑取兩環(huán)枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，8層紗布封口，35°C，120r/min，搖床培養(yǎng)24h，使菌體濃度達(dá)到IO8個(gè)/mL。用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液稀釋種子液，配制成菌體濃度為I X IO7個(gè)/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑。
[0078]雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑的制備:
斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯30g，葡萄糖2g，瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0079]平板擴(kuò)大培養(yǎng)基:馬鈴薯30g，葡萄糖2g,瓊脂2g,自來(lái)水100mL。
[0080]無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液:葡萄糖8.0g ；KH2P045.0g ;無(wú)菌水 1000mL ；pH 7。
[0081]發(fā)酵劑的制備:雅致放射毛霉接種到斜面培養(yǎng)基上于28°C恒溫培養(yǎng)4d，然后接種于平板28°C下擴(kuò)大培養(yǎng)，4d后用無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液洗下孢子，并將其濃度調(diào)整為I X IO7個(gè)/mL。
[0082]將上述枯草芽孢桿菌發(fā)酵劑及雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑按體積比3:1混合即為混菌發(fā)酵劑。
[0083]中性蛋白酶經(jīng)溫度為400C的溫水活化Ih。
[0084]將菜籽柏粉碎后過(guò)40目篩，滅菌，于發(fā)酵罐內(nèi)，按固液比1:1.2的比例加入發(fā)酵劑，同時(shí)按250U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，發(fā)酵溫度為25°C，環(huán)境濕度為80%，定時(shí)攪拌通風(fēng)，發(fā)酵4天后，在100°C下水浴14min滅酶，按固液比1:20的比例加入蒸餾水，50°C下浸提120min，提取I次，低速離心(離心力為2000g)分離去除柏渣，再高速離心(離心力為13000g)除菌除雜，獲得菜籽肽粗提液。
[0085]菜籽肽粗提液經(jīng)過(guò)活性炭柱、脫鹽柱(HiPap? 26/10，流速30mL/min，室溫)脫色、脫苦、脫鹽后，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白質(zhì)含量80%(干基，NX 6.25)，分子量在IkDa~5kDa的肽含量為68%。
[0086]對(duì)照例
混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽柏生產(chǎn)菜籽肽
與實(shí)施例2不同之處在于，只加入混菌發(fā)酵劑、不加中性蛋白酶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。經(jīng)與實(shí)施例2相同的后處理方法獲得菜籽肽粉。所得到的菜籽肽蛋白質(zhì)含量76%(干基，NX6.25)，分子量在IkDa~5kDa的肽含量為52%。
[0087]下表是本發(fā)明的實(shí)施例與對(duì)照例的試驗(yàn)效果對(duì)比
【權(quán)利要求】
1.一種菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:利用具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌及霉菌與蛋白酶協(xié)同固態(tài)發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽，具體步驟為: a.將通過(guò)壓榨或浸出制油工藝得到的菜籽柏粉碎，得到菜籽柏粉； b.將具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌與霉菌復(fù)配，制備發(fā)酵劑； c.將步驟b制得的發(fā)酵劑與中性蛋白酶接入步驟a所得的菜籽柏粉，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵； d.對(duì)步驟c所得的固態(tài)發(fā)酵后基質(zhì)進(jìn)行滅酶； e.加水浸提步驟d中固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基，分離去除殘?jiān)?，獲得菜籽肽的粗提液； f.將步驟e所得菜籽肽粗提液經(jīng)過(guò)脫色、脫苦、脫鹽、分離純化和干燥獲得菜籽肽粉。
2.如權(quán)利要求1所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟a中，所述菜籽柏的原料是普通油菜籽或雙低油菜籽，粉碎后的菜籽柏粉的粒徑為200-800μm，粉碎后的菜籽柏直接用于發(fā)酵或者經(jīng)過(guò)105°C ~121°C溫度滅菌或濕熱滅菌后用于發(fā)酵。
3.如權(quán)利要求1所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟b中，所述的具有產(chǎn)蛋白酶能力的細(xì)菌為枯草芽孢桿菌，霉菌為雅致放射毛霉菌。
4.如權(quán)利要求1所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟b中，制備發(fā)酵劑的步驟為: b-Ι.配制無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液，其組成為:葡萄糖與無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液體積的質(zhì)量體積比為0.5%~l%g/mL, KH2PO4與無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液體積的質(zhì)量體積比為0.3%~0.5%g/mL, pH為6.0-8.0 ； b-2.將活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后的微生物菌種，用步驟b-1中配置的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液配制成菌種量為IX IO6~IX IO8個(gè)/mL的菌懸液，即為發(fā)酵劑。
5.如權(quán)利要求3所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟c中，發(fā)酵劑的加入總量為菜籽柏質(zhì)量的I~1.5倍，枯草芽孢桿菌與雅致放射毛霉菌發(fā)酵劑體積比為1:1~4:1，中性蛋白酶添加量為50~250U/g，發(fā)酵劑與中性蛋白酶同步或分步接入菜籽柏粉中，發(fā)酵溫度為25°C~45°C，發(fā)酵時(shí)間為I~5天，環(huán)境濕度40%~100%，發(fā)酵容器為固態(tài)發(fā)酵罐或發(fā)酵池。
6.如權(quán)利要求5所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟c中，中性蛋白酶經(jīng)溫度為40°C的溫水活化Ih后接入菜籽柏粉。
7.如權(quán)利要求1所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟d中，滅酶條件為:水浴，溫度95°C~100°C，時(shí)間l(Tl5min。
8.如權(quán)利要求1所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟e中所述的水為去離子水、蒸餾水或自來(lái)水，固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基與水的固液比1:5~l:30g/mL，提取溫度為15°C~80°C，提取時(shí)間為3(Tl80min，提取I~3次。
9.如權(quán)利要求1或8所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟e中，分離去除殘?jiān)姆椒檫^(guò)濾或離心，其中，所述過(guò)濾采用真空過(guò)濾器或壓力過(guò)濾器，所述離心的離心力為1000~14000g。
10.如權(quán)利要求1所述的菌酶協(xié)同發(fā)酵菜籽柏制備菜籽肽的方法，其特征在于:步驟f中，所述脫色、脫苦的步驟采用活性炭；所述脫鹽的步驟采用離子交換色譜或反滲透；所述分離純化的步驟為:通過(guò)截留分子量為30KDa、10KDa、5kDa，3kDa和IkDa的超濾膜超濾，獲得五種不同生物活性的菜籽肽，或采用離子交換、凝膠層析、親和層析方法，獲得生物活性專一的菜籽肽；所述干燥的步驟為熱風(fēng)干燥、冷凍干燥或噴霧干燥。
【文檔編號(hào)】C12R1/785GK103911420SQ201410136658
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】王立峰, 謝慧慧, 王玉梅, 張晶, 熊維濤, 鞠興榮 申請(qǐng)人:南京財(cái)經(jīng)大學(xué), 南京興東峰生物科技有限公司