肽的?；椒ê托迈；瘎┑闹谱鞣椒?

專利名稱：肽的?；椒ê托迈；瘎┑闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將一個(gè)或多個(gè)?；腚幕虻鞍踪|(zhì)中的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及將天然存在的GLP-1或其類似物中含有的賴氨酸殘基的ε-氨基酰化的改進(jìn)方法。而且，本發(fā)明還涉及在所述方法中用作?；瘎┑幕衔铩?br> 背景技術(shù)：
肽廣泛用在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，而且由于其可通過重組DNA技術(shù)制備，可以預(yù)計(jì)，在未來許多年肽的重要性仍會(huì)增加。當(dāng)天然肽或其類似物用于治療時(shí)，往往發(fā)現(xiàn)它們具有高廓清率(high clearance)。當(dāng)期望長時(shí)間保持高廓清率治療試劑的高血液濃度時(shí)，由于需要重復(fù)給藥，因此，使用高廓清率治療試劑是麻煩的。具有高廓清率的天然肽的實(shí)例是ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、血管緊張肽、降鈣素、exendin、exendin-3、exendin-4、胰島素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-2、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子-2、腸抑胃肽、生長激素釋放因子、垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽、促胰液素、促腸胃液素(enterogastrin)、促生長素抑制素、生長激素、促生長因子、甲狀旁腺激素、血小板生成素、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳激素、甲狀腺刺激激素、內(nèi)啡肽類、腦啡肽類、后葉加壓素、催產(chǎn)素、阿片樣物質(zhì)(opiods)和其類似物、超氧物歧化酶、干擾素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶。
相對于天然肽(或其未修飾的類似物)，將親脂性酰基導(dǎo)入天然存在的肽或其類似物中可得到作用時(shí)間延長了的?；?。該現(xiàn)象已在本申請人的下述在先申請中作了充分的描述和證明WO98/08871尤其公開了GLP-1和其類似物的酰化、WO98/08872尤其公開了GLP-2和其類似物的酰化和WO99/43708尤其公開了exendin和其類似物的?；?。而且認(rèn)為，在親脂性基團(tuán)的附近包含帶負(fù)電基團(tuán)，如包含羧酸基團(tuán)是有利的。
歐洲專利申請92107035.5(Kuraray Co.)描述了用于將長鏈羧酸導(dǎo)入蛋白質(zhì)的長鏈二羧酸的活性單酯。
尤其感興趣的是，可以通過單或二肽間隔基(spacers)將親脂性?；隚LP-1中，并已在WO98/08871中提出和例解。并提出了用天冬氨酸和谷氨酸作為合適間隔基。然而，上述單或二肽間隔基含有多余的羧酸基團(tuán)，因此，保護(hù)和隨后的脫保護(hù)步驟是必須的。在酸性條件下脫保護(hù)在一定程度上破壞了肽(GLP-1)。因此，期望有制備這些變體的替代方法。
所以，本發(fā)明目的是提供一種通過α-氨基-α，ω-二羧酸間接基將親脂基團(tuán)引入肽中的替代方法。本發(fā)明方法能在親脂基團(tuán)的附近引入可帶電的羧酸基團(tuán)并且不會(huì)直接影響親脂基團(tuán)，因而該方法方便了修飾肽的制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了酰化肽(或蛋白質(zhì))上的一個(gè)或多個(gè)氨基的方法，該方法包括(a)在堿性條件下，在非質(zhì)子傳遞極性溶劑和水的混合物中，將具有至少一個(gè)游離氨基的肽(或蛋白質(zhì))與通式I的酰化試劑反應(yīng)， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是親脂部分，例如，選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基；R3與和R3連接的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯；和R4選自氫、C1-12烷基和芐基；和(b)如果R4不是氫，在堿性條件下，皂化?；说碾牡孽セ?COOR4)；以得到N-酰化的肽(或N-?；牡鞍踪|(zhì))。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可以在堿性條件下皂化酰化了的肽酯(其中R4是烷基或芐基)，并且肽和間隔基的各個(gè)α-氨基酸片段僅有少量外消旋化或沒有外消旋化。本申請人已發(fā)現(xiàn)，就純度和抑制副產(chǎn)物，如，抑制降解產(chǎn)物而言，堿性皂化無疑優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)采用的酸性水解。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下使用游離酸(R4是氫)作為酰化劑進(jìn)行?；磻?yīng)，確實(shí)基本上直接生成所需產(chǎn)物?；?，同時(shí)沒有副產(chǎn)物形成并且無需脫保護(hù)步驟。
本發(fā)明還提供了在上述方法中用作?；瘎┑男禄衔铮鲂禄衔锞哂型ㄊ絀 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是親脂部分，例如，選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基；和R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯。
發(fā)明詳述肽和蛋白質(zhì)一般認(rèn)為本發(fā)明可用于將親脂酰基導(dǎo)入任何肽(或蛋白質(zhì))中，以降低其在體內(nèi)的廓清率。所述肽和蛋白質(zhì)的實(shí)例是ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、血管緊張肽、降鈣素、exendin和其類似物、胰島素和其類似物、胰高血糖素和其類似物、胰高血糖素樣肽-1和其類似物、胰高血糖素樣肽-2和其類似物、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子-2、腸抑胃肽、生長激素釋放因子、垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽、促胰液素、促腸胃液素(enterogastrin)、促生長素抑制素、生長激素、促生長因子、甲狀旁腺激素、血小板生成素、紅細(xì)胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳激素、甲狀腺刺激激素、內(nèi)啡肽類、腦啡肽類、后葉加壓素、催產(chǎn)素、阿片樣物質(zhì)(opiods)和其類似物、超氧物歧化酶、干擾素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶和核糖核酸酶。
當(dāng)然，肽(或蛋白質(zhì))應(yīng)當(dāng)含有至少一個(gè)游離氨基，所述氨基是N-末端氨基或側(cè)鏈氨基。特別值得考慮的是賴氨酸和鳥氨酸氨基酸殘基的氨基。本發(fā)明方法尤其涉及賴氨酸殘基的ε-氨基的N-酰化作用。應(yīng)當(dāng)說明的是，本發(fā)明所研究的肽或蛋白質(zhì)可含有兩個(gè)或多個(gè)可全部都被N-?；膫?cè)氨基。
目前認(rèn)為，本發(fā)明尤其適用于修飾GLP-1和其類似物。根據(jù)本發(fā)明，可被N-?；腉LP-1和其類似物的實(shí)例是GLP-1和其截短的類似物，例如，Arg26-GLP-1(7-37)；Arg34-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Arg34Lys35-GLP-1(7-37)；Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly6Arg Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1+(7-40)；Arg26，34Lys36GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(7-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(7-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(7-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(7-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(7-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(1-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(1-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(1-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(1-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(1-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(1-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(1-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(1-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(2-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(2-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(2-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(2-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(2-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(2-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(2-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(2-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(3-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(3-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(3-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(3-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(3-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(3-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(3-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(3-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(4-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(4-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(4-40)；Ar926，34Lys41GLP-1(4-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(4-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(4-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(4-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(4-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(5-38)；Arg36，34Lys39GLP-1(5-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(5-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(5-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(5-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(5-43)；Arg26，34Lys-GLP-1(5-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(5-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(6-38)；Arg36，34Lys39GLP-1(6-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(6-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(6-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(6-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(6-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(6-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(6-45)；Arg36Lys38GLP-1(1-38)；Arg34Lys38GLP-1(1-38)；Arg26，34Lys36，38GLP-1(1-38)；Arg26Lys38GLP-1(7-38)；Arg34Lys38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys36，38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)；Arg Lys39GLP-1(1-39)；Arg34Lys39GLP-1(1-39)；Arg26，34Lys36，39GLP-1(1-39)；Arg26Lys39GLP-1(7-39)；Arg34Lys39GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，39GLP-1(7-39)；Arg26-GLP-1(7-37)，Arg34-GLP-1(7-37)，Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26Lys38-GLP-1(7-37)，Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26-GLP-1(7-37)，Gly6Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)，Gly8Arg26Lys38-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)；Gly8，Arg26，34，Glu37，Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)和Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)。上述每個(gè)GLP-1類似物和其截短的類似物構(gòu)成了本發(fā)明可供選擇的實(shí)施方案。
目前認(rèn)為，本發(fā)明還特別適用于修飾GLP-2和其類似物。根據(jù)本發(fā)明，可被N-?；腉LP-2和其類似物的實(shí)例是GLP-2類似物和其截短的類似物，例如，Lys20GLP-2(1-33)；Lys20Arg30GLP-2(1-33)；Arg30Lys34GLP-2(1-34)；Arg30Lys35GLP-2(1-35)；Arg30，35Lys20GLP-2(1-35)；和Arg35GLP-2(1-35)。上述每個(gè)GLP-2類似物和其截短的類似物構(gòu)成了本發(fā)明可供選擇的目前認(rèn)為，本發(fā)明還特別適用于修飾exendin和其類似物。根據(jù)本發(fā)明，可被N-酰化的exendin和其類似物的實(shí)例是exendin類似物和其截短的類似物，例如，exendin-3和exendin-4。上述每個(gè)exendin類似物和其截短的類似物構(gòu)成了本發(fā)明可供選擇的實(shí)施方案。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，N-?；磻?yīng)發(fā)生在賴氨酸殘基的ε-氨基上。
在WO98/08871中充分公開了GLP-1和其類似物的效果。
在WO98/08872中充分公開了GLP-2和其類似物的效果。
在WO99/43708中充分公開了exendin和其類似物的效果。
?；噭┰诒景l(fā)明方法中，將具有至少一個(gè)游離氨基的肽(或蛋白質(zhì))與通式I的?；噭┓磻?yīng)， 在通式I中，整數(shù)n優(yōu)選0-8，例如，對于天冬氨酸和谷氨酸等，n特別優(yōu)選0-6。優(yōu)選n是0-4，例如，n＝0-2，例如，n是0(天冬氨酸)或1(谷氨酸)。上述各整數(shù)或整數(shù)范圍構(gòu)成了本發(fā)明的備擇實(shí)施方案。
通式I中的R1表示游離酸基(COOH)或酯基(COOR4)。當(dāng)R1是酯基時(shí)，R4選自可在堿性條件下通過水解(以相應(yīng)的醇的形式)除去的基團(tuán)。所述基團(tuán)的實(shí)例是C1-12烷基，例如，甲基、乙基、丙-1-基、丙-2-基、丁-1-基、丁-2-基、2-甲基丙-1-基、2-甲基-丙-2-基(叔丁基)和己-1-基等，和芐基。上述各基團(tuán)構(gòu)成了本發(fā)明的備選實(shí)施方案。
通式I中的R2表示被引入到肽或蛋白質(zhì)中的親脂部分。所述親脂部分-般選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。C3-39烷基的具體實(shí)例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。上述各親脂基團(tuán)構(gòu)成了本發(fā)明的備選實(shí)施方案。
親脂取代基或親脂部分的特征在于，在20℃水中的溶解度為約0.1mg/100ml水-250mg/100ml水，優(yōu)選為約0.3mg/100ml水-75mg/100ml水。例如，辛酸(C8)在20℃水中的溶解度為68mg/100ml水，癸酸(C10)在20℃水中的溶解度為15mg/100ml水，和十八烷酸(C18)在20℃水中的溶解度為0.3mg/100ml水。上述各親脂取代基構(gòu)成了本發(fā)明的備選實(shí)施方案。
術(shù)語“C3-39烷基”、“C3-39鏈烯基”和“C3-39鏈二烯基”分別包括C3-39直鏈和支鏈烴基，優(yōu)選為直鏈飽和、單不飽和二不飽和的C3-39烴基。C3-39烷基的具體實(shí)例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。
術(shù)語“甾族殘基”是指親脂基團(tuán)，其與和R2相連的羰基一起衍生于甾族羧酸，即，衍生于三-、四-和五環(huán)全飽和或部分不飽和C16-36烴，所述基團(tuán)R2-C(＝O)-的實(shí)例是石膽酸?；?lithocholoyl)、脫氧膽酸酰基(deoxycholoyl)和膽酸?；?choloyl)。
在上述親脂基團(tuán)中，特別合適的是C7-25烷基、C7-25鏈烯基、C7-25鏈二烯基和甾族殘基。特別值得考慮的實(shí)例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、石膽酸?；?lithocholoyl)、脫氧膽酸?；?deoxycholoyl)和膽酸?；?choloyl)。上述各親脂基構(gòu)成了本發(fā)明的備選實(shí)施方案。
通式I中的R3與和R3相連的羧基一起形成活性酯或活性的N-羥基亞氨酸酯。上述每種酯都構(gòu)成了本發(fā)明的備選實(shí)施方案。活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯是在有機(jī)化學(xué)(特別是肽化學(xué))領(lǐng)域中已知的用于氨基、硫基和羥基的?；饔玫墓倌軋F(tuán)。在本發(fā)明中，術(shù)語“活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯”是指適用于將胺，優(yōu)選將伯胺進(jìn)行?；孽ス倌芑问降聂人峄鶊F(tuán)。不用說，活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯對伯胺?；磻?yīng)的選擇優(yōu)于對羥基和硫基酰化反應(yīng)的選擇。特別優(yōu)選活性N-羥基亞氨酸酯。
活性酯的實(shí)例是1-羥基苯并三唑酯和其衍生物。許多用于形成上述羧酸活性酯的高效試劑是已知的，例如，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽。上述活性酯通常在堿存在下，例如，在諸如三烷基胺的有機(jī)堿存在下就地形成。
活性N-羥基亞氨酸酯的酰亞胺部分的實(shí)例是那些在歐洲專利申請92107035.5第13頁第3行-第17頁第10行中具體公開的酰亞胺(在本發(fā)明中引作參考)。其中，特別值得考慮的酰亞胺部分的實(shí)例是琥珀酰亞胺和鄰苯二甲酰亞胺等等。上述各種酰亞胺部分構(gòu)成了本發(fā)明的備擇實(shí)施方案。
通過相應(yīng)的酸(即，N-?；摩?羧基保護(hù)的二酸(R4不是氫))與等摩爾量(例如，0.95-1.05摩爾，優(yōu)選1.0摩爾)相應(yīng)酰亞胺的N-羥基酰亞胺縮合，可制得通式I的活性N-羥基亞氨酸酯。(另一方面，N-?；摩?羧基保護(hù)的二酸通?？捎上鄳?yīng)的α-羧基保護(hù)的α-氨基二酸和親脂部分的苯并三唑酯制備。按WO98/02460所描述的DCC偶合(實(shí)施例1-3)，例如，由酰氯和苯并三唑或由游離酸和苯并三唑可制得上述苯并三唑酯)。通常在脫水條件下，例如，在諸如碳化二亞胺偶聯(lián)劑(例如，二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC))的偶聯(lián)劑存在下進(jìn)行縮合。當(dāng)存在偶聯(lián)劑時(shí)，相對于酸，優(yōu)選加入等摩爾量的偶聯(lián)劑。反應(yīng)通常在諸如無水四氫呋喃(THF)、無水二甲基甲酰胺(DMF)、無水丙酮、無水二氯甲烷、無水二氧六環(huán)、無水二甲基乙酰胺或無水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的極性非質(zhì)子傳遞溶劑中進(jìn)行。通常在0-50℃，例如，在諸如室溫的5-30℃下進(jìn)行反應(yīng)1-96小時(shí)，例如，進(jìn)行反應(yīng)4-36小時(shí)。一組可能的反應(yīng)試劑和反應(yīng)條件如下將上述的N-羥基酰亞胺(例如，琥珀酰亞胺或鄰苯二甲酰亞胺)和酸以約1∶1的摩爾比溶解在無水THF或無水DMF(或其混合物)中，并向溶液中加入等摩爾量的DCC。在N-羥基酰亞胺和酸反應(yīng)完成后，通過諸如過濾(如果使用DCC偶聯(lián)劑，則過濾出二環(huán)己基脲(DCU)沉淀)、結(jié)晶、重結(jié)晶和色譜等常規(guī)方法分離和提純產(chǎn)物。一種可能的提純途徑包括通過過濾除去用過的沉淀偶聯(lián)劑，減壓蒸發(fā)溶劑，將產(chǎn)物再懸浮在，例如，丙酮中，過濾，加入非極性溶劑，例如，加入已烷進(jìn)行結(jié)晶，并任選進(jìn)行重結(jié)晶和/或洗滌。產(chǎn)物可直接在本發(fā)明方法中用作式I的?；噭?。
當(dāng)以游離α-羧酸的形式(R4是氫)使用通式I的?；噭r(shí)，將其中R4為可被選擇性除去的基團(tuán)的通式I的化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的R4是氫的化合物。羧酸保護(hù)基團(tuán)可以是能通過催化氫化除去的芐基或是能選擇性除去的烯丙基。室溫下，在極性非質(zhì)子傳遞溶劑，例如，丙酮中，使用鈀碳和氫，通過催化氫化可除去芐基保護(hù)基。反應(yīng)可以在密閉容器中和氫氣氣氛(一般為0.1-10atm)下劇烈攪拌進(jìn)行。根據(jù)鈀催化劑的重量，通常在0.5-12小時(shí)內(nèi)完成反應(yīng)。使用常規(guī)處理方法。
相信R4是氫的通式I的化合物是新化合物，這些化合物構(gòu)成了本發(fā)明的特征。因此，本發(fā)明還提供了通式I的新化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是親脂基團(tuán)，例如，選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基；和R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯。
反應(yīng)條件在堿性條件下，在極性非質(zhì)子傳遞溶劑與水的混合物中，進(jìn)行通式I的?；噭┡c肽或蛋白質(zhì)的反應(yīng)。
相對于待酰化的肽的氨基數(shù)量，通常使用稍稍過量的通式I的?；噭？紤]到肽中的氨基數(shù)量，上述比例通常為1∶1-1∶20，優(yōu)選為1∶1.2-1∶5，并且酰化試劑過量。
應(yīng)當(dāng)理解的是，根據(jù)使用的?；噭┑牧亢头磻?yīng)條件，可以將肽完全或部分N-?；?。優(yōu)選N-?；磻?yīng)基本上按化學(xué)計(jì)量進(jìn)行。
通常，極性非質(zhì)子傳遞溶劑選自無水四氫呋喃(THF)、無水二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、二氯甲烷、二甲亞砜(DMSO)、二氧六環(huán)、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮和其混合物。其中，優(yōu)選二甲基甲酰胺、二甲亞砜、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮，特別優(yōu)選N-甲基-2-吡咯烷酮。通常，極性非質(zhì)子傳遞溶劑與水(例如，N-甲基-2-吡咯烷酮與水)的比例為1∶10-10∶1，優(yōu)選為1∶5-5∶1，特別優(yōu)選為1∶1-3∶1。
反應(yīng)溫度一般保持在-10-50℃，優(yōu)選0-25℃。
為使反應(yīng)平穩(wěn)進(jìn)行，溶劑混合物的pH值為7-14，例如，9-13，優(yōu)選為9.5-12.5是重要的。當(dāng)溶劑混合物的pH值為10-12時(shí)，通常收率和純度最佳。通過加入諸如氫氧化鈉和氫氧化鉀的堿金屬氫氧化物和/或諸如三烷基胺(例如，三乙基胺、N，N-二異丙基乙基胺等)的有機(jī)堿，得到所需pH值。
進(jìn)行步驟(a)反應(yīng)的典型實(shí)例是使用1∶1-1∶5摩爾比的蛋白質(zhì)和通式I的?；噭?。通常在-10-30℃，例如，在0-25℃，預(yù)先將肽溶解在水中，用堿金屬氫氧化物(例如，氫氧化鈉或氫氧化鉀)調(diào)節(jié)溶液的pH值至所需值。使用酸，例如，乙酸和堿，例如，三烷基胺可進(jìn)一步調(diào)節(jié)pH值，但優(yōu)選將溫度保持在上述范圍內(nèi)。然后加入極性非質(zhì)子傳遞溶劑(或溶劑混合物)。隨后加入酰化試劑。在加入水和酸，例如，乙酸調(diào)節(jié)pH值至6.5-9.0之前，通常要使反應(yīng)完全進(jìn)行(用HPLC監(jiān)控)，反應(yīng)完全進(jìn)行所需時(shí)間通常為0.2-4小時(shí)，例如，0.2-1小時(shí)。產(chǎn)物通常用HPLC分離和提純，或通過等電pH值沉淀，或在提純之前進(jìn)行水解(步驟(b))。
當(dāng)使用R4是氫的?；噭r(shí)，直接得到帶有親脂部分和游離羧基的N-?；碾幕虻鞍踪|(zhì)。因此，R4是氫的各種?；噭┐砹吮景l(fā)明方法的另外，即，當(dāng)R4是C1-12烷基或芐基時(shí)，在堿性條件下將N-?；碾孽?或蛋白質(zhì)酯)皂化，以得到N-?；碾幕騈-?；牡鞍踪|(zhì)。皂化反應(yīng)通常在0.01-4.0M的諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀的堿金屬氫氧化物溶液中進(jìn)行。溶液pH一般為10-14。反應(yīng)通常在0-40℃，例如，在室溫下，進(jìn)行0.1-12小時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行0.5-4小時(shí)。反應(yīng)完成后，通過例如在等電pH值下沉淀和/或通過制備HPLC可提純產(chǎn)物。因此，R4是C1-12烷基或芐基的各種酰化試劑是本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案。
本發(fā)明還涉及下述方面1.一種酰化肽或蛋白質(zhì)的氨基的方法，該方法包括(a)在堿性條件下，在非質(zhì)子傳遞極性溶劑和水的混合物中，將具有至少一個(gè)游離氨基的肽與通式I的?；噭┓磻?yīng)， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是親脂部分；R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯；和R4選自氫、C1-12烷基和芐基；和(b)如果R4不是氫，在堿性條件下皂化?；说碾牡孽セ?COOR4)；以得到N-酰化的肽。
2.根據(jù)1的方法，其中R4是氫。
3.根據(jù)1的方法，其中R4選自C1-8的烷基和芐基。
4.根據(jù)1-3的任一方法，其中R3與和R3相連的羧基一起表示活性N-羥基亞氨酸酯。
5.根據(jù)1-4的任一方法，其中非質(zhì)子傳遞極性溶劑和水的混合物是1∶5-5∶1的N-甲基-2-吡咯烷酮和水的混合物。
6.根據(jù)1-5的任一方法，其中步驟(a)中反應(yīng)混合物的pH值為9-13。
7.根據(jù)1-6的任一方法，其中步驟(a)的反應(yīng)溫度為0-50℃。
8.根據(jù)3-7的任一方法，其中在pH值為10-14的條件下皂化?；碾孽?。
9.根據(jù)上述任一方法，其中R2選自C3-39烷基、C3-39C鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。
10.通式I的化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是親脂部分；R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯。
11.根據(jù)10的化合物，其中n為0或1，R3與和R3相連的羧基一起形成活性N-羥基亞氨酸酯。
12.根據(jù)10-11的任一化合物，其中R2選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。
實(shí)施例原料的制備實(shí)施例1N-十六烷?；劝彼幡?芐酯的制備在20-25℃下，將谷氨酸α-芐酯(4.75g，20.0mmol)懸浮于N-甲基-2-吡咯烷酮(100ml)中。加入三乙胺(2.53g，25.0mmol)，然后加入1-十六烷?；讲⑷?7.15g，20.0mmol)。在20-25℃下，攪拌反應(yīng)混合物22小時(shí)。向所得溶液中加入0.2M(250ml)鹽酸。將所得懸浮液冷卻至0℃下3小時(shí)。過濾分離產(chǎn)物，用水(50ml×4)洗滌，并在40℃下減壓干燥至恒重。
收率9.15g(96％)白色物質(zhì)，用示差掃描量熱法(DSC)測定熔點(diǎn)為90.0℃(峰值)。
實(shí)施例2
N-十六烷?；劝彼幡?甲酯的制備在類似于實(shí)施例1的反應(yīng)條件下，用8.06g(50.0mmol)谷氨酸α-甲酯制備N-十六烷?；劝彼幡?甲酯。
收率17.70g(88％)白色物質(zhì)，用DSC測定熔點(diǎn)為95.4℃(峰值)。
實(shí)施例3N-十六烷?；劝彼幡?芐酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯的制備在20-25℃下，將N-十六烷?；劝彼幡?芐酯(23.78g，50.0mmol)溶解于四氫呋喃(200ml)中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(5.75g，50.0mmol)，然后加入二環(huán)己基碳化二亞胺(10.32g，50.0mmol)。在20-25℃下攪拌反應(yīng)混合物20小時(shí)。過濾所得懸浮液，并減壓蒸發(fā)濾液至干。在40℃，將結(jié)晶殘余物溶解在丙酮(100ml)中，并通過過濾使其澄清。向所得濾液中加入正庚烷(300ml)。在20-25℃下攪拌所得懸浮液4小時(shí)，然后冷卻至0℃并保溫0.5小時(shí)。過濾分離產(chǎn)物，用正庚烷(50ml×3)洗滌，并在40℃減壓干燥至恒重。
收率23.75g(83％)白色物質(zhì)，用DSC測定熔點(diǎn)為98.6℃(峰值)。
實(shí)施例4N-十六烷?；劝彼幡?甲酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯的制備在類似于實(shí)施例3的反應(yīng)條件下，用8.00g(20.0mmol)N-十六烷?；劝彼幡?甲酯制備N-十六烷?；劝彼幡?甲酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯。
收率6.45g(65％)白色物質(zhì)，用DSC測定熔點(diǎn)為106.0℃(峰值)。
實(shí)施例5N-十六烷?；劝彼幡?N-羥基琥珀酰亞氨酸酯的制備在20-25℃下，將N-十六烷?；劝彼幡?芐酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯(5.73g，10.0mmol)溶解于丙酮(100ml)中。加入10％膏狀鈀碳(約0.25g干燥物)。在氫氣氣氛下攪拌懸浮液直至不再消耗氫氣(290ml氫氣，45分鐘)。濾除催化劑，在20-25℃下減壓蒸發(fā)濾液至干。在20-25℃下，將殘余物溶解于丙酮(25ml)中，并通過過濾使其澄清。向?yàn)V液中加入正庚烷(200ml)。在20-25℃下攪拌所得懸浮液1小時(shí)。過濾分離產(chǎn)物，用正庚烷(50ml×2)洗滌，并在40℃減壓干燥至恒重。
收率4.20g(87％)白色物質(zhì)，用DSC測定熔點(diǎn)為100.8℃(峰值)。
?；腉LP-1類似物的制備實(shí)施例6Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37的制備在0-5℃，將Arg34-GLP-17-37(同種沉淀的冷凍肽物料5.0g，約0.15mmol)溶解于水(25ml)中。加入1.0M氫氧化鈉溶液(2.25ml)將溶液的pH值調(diào)節(jié)至12.5。2分鐘后，加入N-甲基-2-吡咯烷酮(50ml)和1.0M乙酸(1.25ml)，并保持溫度為15℃。加入三乙胺(0.2ml)，然后加入N-十六烷?；劝彼幡?N-羥基琥珀酰亞氨酸酯(97.0mg，0.20mmol)。在15℃下放置30分鐘后，加入水(50ml)，并加入1.0M乙酸(1.70ml)將溶液的pH值調(diào)節(jié)至8.0。
收率通過分析RP-HPLC，表明反應(yīng)混合物含有77％(峰面積)Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷?；?)]-GLP-17-37。
通過柱色譜得到最終提純的產(chǎn)物。
實(shí)施例7Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-OMe(N-十六烷?；?)]-GLP-17-37的制備在類似于實(shí)施例6的反應(yīng)條件下，使用N-十六烷?；劝彼幡?甲酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯?；疉rg34-GLP-17-37。
收率通過分析RP-HPLC，表明反應(yīng)混合物含有64％(峰面積)Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-OMe(N-十六烷?；?)]-GLP-17-37。使用1M乙酸調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH值至6.0，從而分離出作為沉淀的產(chǎn)物。或者，反應(yīng)混合物可直接用于下述實(shí)施例8。
實(shí)施例8Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷?；?)]-GLP-17-37的制備用1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)實(shí)施例7得到的含有產(chǎn)物的反應(yīng)混合物的pH值至12-13，進(jìn)行堿性水解。將反應(yīng)混合物的溫度保持在8-18℃。2小時(shí)后完成反應(yīng)，加入1M乙酸調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH值至7.45。
收率通過分析RP-HPLC，表明反應(yīng)混合物含有65％(峰面積)Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷?；?)]-GLP-17-37。
通過柱色譜得到最終提純的產(chǎn)物。
實(shí)施例9
類似于實(shí)施例6的化合物制備下述化合物，并通過柱色譜得到最終提純的產(chǎn)物。
Arg26，34，Lys36-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷?；?))-GLP-17-36，Arg26，Lys34-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基)))-GLP-17-37，和Gly8，Arg26，34，Glu37，Lys38-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷?；?))-GLP-17-38。
權(quán)利要求
1.一種?；幕虻鞍踪|(zhì)的氨基的方法，該方法包括(a)在堿性條件下，在非質(zhì)子傳遞極性溶劑和水的混合物中，將具有至少一個(gè)游離氨基的肽與通式I的酰化試劑反應(yīng)， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是親脂部分；R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯；和R4選自氫、C1-12烷基和芐基；和(b)如果R4不是氫，在堿性條件下皂化?；说碾孽セ?COOR4)；以得到N-酰化的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R4是氫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R4選自C1-8烷基和芐基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中R3與和R3相連的羧基一起表示活性N-羥基亞氨酸酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中非質(zhì)子傳遞溶劑和水的混合物是1∶5-5∶1的N-甲基-2-吡咯烷酮和水的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)中反應(yīng)混合物的pH值為9-13。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)中反應(yīng)混合物的溫度為0-50℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的方法，其中在pH值為10-14的條件下皂化?；碾孽?。
9.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中R2選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。
10.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中R2選自C7-25烷基。
11.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中所述肽選自GLP-1(1-37)和其類似物、exendin和其類似物和GLP-2(1-34)和其類似物。
12.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的方法，其中所述肽選自exendin-3、exendin-4、Arg26-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Thr8GLP-1(7-37)、Met8GLP-1(7-37)、Gly8GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Thr8GLP-1(7-36)酰胺、Met8GLP-1(7-36)酰胺和Gly8GLP-1(7-36)酰胺。
13.通式I的化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是親脂部分；R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的化合物，其中n為0或1，R3與和R3相連的羧基一起表示活性N-羥基亞酸酯。
15.根據(jù)權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)的化合物，其中R2選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種酰化肽(或蛋白質(zhì)),例如,GLP－1的一個(gè)或多個(gè)氨基(通常為賴氨酸的氨基)的方法,該方法包括(a)在堿性條件下,在非質(zhì)子傳遞極性溶劑和水(例如,N－甲基－2－吡咯烷酮和水)的混合物中,將具有至少一個(gè)游離氨基的肽(或蛋白質(zhì))與通式I的?；噭┓磻?yīng),其中,n=0－8;R
文檔編號(hào)C07K1/08GK1344248SQ00805003
公開日2002年4月10日 申請日期2000年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月17日
發(fā)明者路易斯·B·漢森 申請人:諾沃挪第克公司