一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，所述方法包括：1）種細胞的制備，2）生物反應(yīng)器的準備，3）PK-15細胞懸浮培養(yǎng)，4）PK-15細胞懸浮培養(yǎng)病毒，5）細胞懸浮病毒培養(yǎng)及連續(xù)收獲，6）病毒液培養(yǎng)周期及收獲量。本發(fā)明逾越了轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝存在的多種技術(shù)瓶頸，提供了一種利用片狀載體懸浮培養(yǎng)PK15細胞，獲得高效、可持續(xù)性、大規(guī)模生產(chǎn)高滴度圓環(huán)病毒2型（PCV2）病毒液的工藝。
【專利說明】一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]圓環(huán)病毒病感染是近年來發(fā)現(xiàn)的一種比較難控制的傳染病。該疾病主要侵害哺乳仔豬和育肥豬，及懷孕母豬。其特征性臨床癥狀為患豬體質(zhì)不良，皮膚蒼白。引起的疫病包括豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，增生性壞死性肺炎(PNP)、豬皮炎與腎病綜合征(TONS)、豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性震顫及腸炎等。同時PCV-2感染產(chǎn)生的免疫抑制極易引發(fā)其它病原混合感染或繼發(fā)感染。2006、2007年，豬圓環(huán)病毒在中國豬“無名高熱癥”發(fā)生中起著重要的誘因作用。目前，圓環(huán)病毒病在我國已普遍發(fā)生，表現(xiàn)為流行范圍廣、陽性率高、混合感染嚴重、種豬感染率高等特點，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。由于本病的危害日益嚴重，已引起人們的密切關(guān)注，養(yǎng)豬行業(yè)人士更將其列為當前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號疫病。疫苗免疫是預(yù)防該病發(fā)生的最有效方法之一。
[0003]使用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)細胞，獲得高病毒含量抗原，是當前生物制品生產(chǎn)和疫苗行業(yè)發(fā)展的主流模式和 必然趨勢。使用生物反應(yīng)器比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝具有不可比擬的優(yōu)勢，比如:利于對污染和內(nèi)毒素的控制，大幅度提高細胞密度和毒液抗原含量，抗原批間次差異小，培養(yǎng)基血清含量低，疫苗質(zhì)量均一，疫苗注射反應(yīng)小、免疫抗體水平高、整齊、免疫持續(xù)期長，減少對廠房面積的需求，減少對人力的依賴，可以實現(xiàn)遠程監(jiān)視與控制等常規(guī)細胞培養(yǎng)所不具備的多種技術(shù)優(yōu)勢。
[0004]目前，國內(nèi)常規(guī)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)工藝主要是轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)培養(yǎng)，產(chǎn)出的PCV2的病毒滴度均在105_°左右，利用生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)工藝，可提高PCV2病毒產(chǎn)量和滴度，可以產(chǎn)出滴度高達106_5TCID5tZml以上的病毒液，病毒產(chǎn)量是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝的100倍左右。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，本發(fā)明逾越了轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝存在的多種技術(shù)瓶頸，提供了一種利用片狀載體懸浮培養(yǎng)PK15細胞，獲得高效、可持續(xù)性、大規(guī)模生產(chǎn)高滴度圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒液的工藝。
[0006]一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，包括以下步驟:
[0007]I)使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)制備密度為2~3X IO5個/mL的PK-15細胞液；
[0008]2)于生物反應(yīng)器內(nèi)接種所述細胞液，加入片狀微載體，補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養(yǎng)基，進行細胞懸浮培養(yǎng)，其中:每接種IL的所述細胞液，加入所述片狀微載體250g，然后補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養(yǎng)基至4~5L ;
[0009]3)接種細胞24小時后進行灌注培養(yǎng)，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為85~100轉(zhuǎn)/分，溶氧為
40~50%，pH 為 7 ~7.2，溫度為 36.8 ~37.3°C ；
[0010]4)所述PK-15細胞懸浮培養(yǎng)至72小時接入豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，病毒接種量為生物反應(yīng)器培養(yǎng)基8% (V/V)，并同時加入終濃度為2mmol/L的D-氨基葡萄糖，所述生物反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置為90~100轉(zhuǎn)/分，溶氧為50~55%，pH為7.2~7.4，溫度為36.4~36.8 0C ； [0011]5)所述豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒接種24小時后至240小時采用灌注工藝培養(yǎng)，使用體積百分比為1%的牛血清培養(yǎng)基進行灌注，生物反應(yīng)器參數(shù)與步驟4)相同，其中:所述步驟2)中每接種IL的所述細胞液，此步驟中灌注量為平均每天15L ；
[0012]6)所述豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒接種后240~360小時停止培養(yǎng)，將灌注培養(yǎng)工藝收集的病毒液與生物反應(yīng)器內(nèi)的病毒液混合，反復(fù)凍融兩次，凍融過程中不斷搖晃，即得豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒液。
[0013]以5L工作體積為例，本發(fā)明一個PK-15細胞懸浮培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)周期為13天,共收獲病毒液量約150L左右。
[0014]其中，所述生物反應(yīng)器可選用美國NBS公司生產(chǎn)的7.5L生物反應(yīng)器，所述片狀載體可選用美國NBS的Fibra-Cel Disks。
[0015]優(yōu)選的，所述的步驟3)中培養(yǎng)條件為:攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧為50%，pH為
7.2，溫度為37。。。
[0016]優(yōu)選的，所述的步驟4)中的培養(yǎng)條件為:攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧為50%，pH為
7.4，溫度為 36.50C ο
[0017]優(yōu)選的，所述的步驟5)中的培養(yǎng)基中牛血清的質(zhì)量百分含量為1%。
[0018]更優(yōu)選的，所述的步驟6)中病毒培養(yǎng)收獲時間為病毒接種后240小時。
[0019]與現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝相比，本研究是通過新型的生物反應(yīng)器及片狀載體進行高效地培養(yǎng)高密度細胞以及高滴度的PCV2病毒液，從而為生產(chǎn)高質(zhì)量的PCV2疫苗奠定基礎(chǔ)。
[0020]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0021]1.有效降低勞動強度:以7.5L生物反應(yīng)器為例，該生物反應(yīng)器的工作體積為5L，載體裝量為250g，載體表面所提供的細胞貼壁的面積與80個15L轉(zhuǎn)瓶相當，從而可有效減少常規(guī)生產(chǎn)工藝中轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)所需要的勞動強度。
[0022]2.操作簡便、培養(yǎng)參數(shù)可控制:本發(fā)明所涉及的生產(chǎn)工藝僅需I個人就可以完成，可實現(xiàn)病毒繁殖的機械化、自動化、精確化培養(yǎng)，每批次病毒滴度穩(wěn)定，批間次各項技術(shù)指標差異小，更易實現(xiàn)病毒生產(chǎn)的標準化管理。而傳統(tǒng)工藝則需要80個15L的轉(zhuǎn)瓶或至少5人才能完成，基本手工操作完成，人為及不確定因素影響較大即生產(chǎn)的病毒液質(zhì)量隨PK-15細胞生長狀況不同，出現(xiàn)較大差異。
[0023]3.提高病毒產(chǎn)量與滴度:與傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝相比，該方法可以很大程度上擴大生產(chǎn)規(guī)模，以5L工作體積為例,本發(fā)明一個培養(yǎng)周期可以生產(chǎn)150L的病毒液,而傳統(tǒng)工藝僅能生產(chǎn)約50L。傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝產(chǎn)出的PCV2的滴度僅為105_°TCID5Q/ml左右，而本發(fā)明使用的生物反應(yīng)器及片狀載體生產(chǎn)工藝可以產(chǎn)出滴度高達106_ 5TCID5ciAil的病毒液，即PK-15細胞懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)病毒，一個培養(yǎng)周期病毒產(chǎn)量是傳統(tǒng)工藝的100左右。[0024]4.生產(chǎn)成本降低:傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝中所使用的培養(yǎng)基中血清的濃度均較高，細胞擴繁需10%血清，病毒繁殖擴增需2%血清，而本發(fā)明中細胞吸附于片狀載體及擴繁需5%血清，接毒后所維持液中血清含量僅為1%，與傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝相比大大降低生產(chǎn)成本。
[0025]5.生產(chǎn)空間小、密閉、不易造成生產(chǎn)和環(huán)境的雙重污染:同等病毒抗原產(chǎn)量，懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)線空間是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)線的1/5 ;細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)病毒是在密閉容器中進行，不易引發(fā)外界環(huán)境或人為操作不當造成的產(chǎn)品污染及對環(huán)境的生物安全隱患。
【具體實施方式】
[0026]以下為對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0027]實施例1
[0028]一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，PK-15細胞培養(yǎng)圓環(huán)病毒生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝研究該方法具體有以下步驟組成:
[0029]1 材料
[0030]1.1細胞PK-15細胞(無PCV-1污染)由揚州優(yōu)邦生物制藥有限公司擴繁并保存。
[0031]1.2毒種PCV-2 (YZ株)F15代由揚州優(yōu)邦生物制藥有限公司擴繁并保存。
[0032]1.3培養(yǎng)基及試劑DMEM購自Sigma公司；胎牛血清購自Hyclone公司；D_氨基葡萄糖購自BBI公司；PCV-2陽性血清購自VMRD公司；羊抗豬熒光二抗購自SouthernBiotech公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。
[0033]1.4儀器7.5L生物反應(yīng)器及配套片狀載體購自NBS公司；倒置熒光顯微鏡購自Nikon公司；細胞轉(zhuǎn)瓶機購自蘭飛公司。
[0034]2 方法
[0035]2.1生物反應(yīng)器的準備
[0036]7.5升反應(yīng)器的工作體積為5升，載體使用量為250g/罐/次，載體表面積為1200cm2/g，相當于80個15升轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)面積。校正各電極，高壓滅菌并進行無菌試驗，無菌試驗合格后即可進行細胞懸浮培養(yǎng)。
[0037]2.2種細胞的準備
[0038]將生長良好的單層PK-15細胞用0.25%胰酶-EDTA消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至1.5 X IO5個/mL，接入1.5升轉(zhuǎn)瓶中，每瓶800mL，置37°C溫室培養(yǎng)48小時，挑選形態(tài)良好，折光率高，已形成良好單層的細胞作為接種反應(yīng)器的種細胞。
[0039]2.3PK-15細胞懸浮培養(yǎng)
[0040]將IL含有2X IO5個/ml左右的PK-15細胞接入到反應(yīng)器中，補充含5%牛血清的DMEM培養(yǎng)基至5L，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，pH7.2，溫度37°C，進行細胞懸浮培養(yǎng)。24小時后開啟進液泵和出液泵進行流加培養(yǎng)至72小時。每天定時取樣檢測葡萄糖的消耗量并記錄堿液(l%NaOH)的消耗量。
[0041]2.4PK-15細胞灌注式懸浮培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) YZ株
[0042]反應(yīng)器培養(yǎng)PK-15細胞至72小時，接入8%生物反應(yīng)器培養(yǎng)基量的圓環(huán)病毒(YZ株)種毒(即400mL)，病毒維持液中含D-氨基葡萄糖濃度為2mmol/L。設(shè)定反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧50%，PH7.4，溫度36.5°C，培養(yǎng)至24小時開始收獲毒液并同時補充含1%血清的維持液，每日取樣檢測葡萄糖含量同時記錄堿液(l%NaOH)的消耗量。
[0043]2.5病毒液收獲及毒價測定
[0044]接毒后240小時停止培養(yǎng)，將灌注培養(yǎng)工藝收集的病毒液與生物反應(yīng)器內(nèi)的病毒液混合，反復(fù)凍融兩次，凍融過程中不斷搖晃，即得豬圓環(huán)病毒液。一個PK-15細胞懸浮培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)周期為13天，平均每天收獲病毒15L，共收獲病毒液量約150L左右。收獲病毒液10倍遞增稀釋，取10_6、10_7、10_8三個稀釋度，用間接免疫熒光法檢測TCID50,病毒液毒價平均值 為106.72TCID50/ml。
[0045]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施方式，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，包括以下步驟: O使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)制備密度為2~3X IO5個/mL的PK-15細胞液； 2)于生物反應(yīng)器內(nèi)接種所述細胞液，加入片狀微載體，補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養(yǎng)基，進行細胞懸浮培養(yǎng)，其中:每接種IL的所述細胞液，加入所述片狀微載體250g，然后補充體積百分比為5%的牛血清的DMEM培養(yǎng)基至4~5L ; 3)接種細胞24小時后進行灌注培養(yǎng)，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為85~100轉(zhuǎn)/分，溶氧為40~50%, pH 為 7 ~7.2，溫度為 36.8 ~37.3°C ; 4)所述PK-15細胞懸浮培養(yǎng)至72小時接入豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，病毒接種量為生物反應(yīng)器培養(yǎng)基8% (V/V)，并同時加入終濃度為2mmol/L的D-氨基葡萄糖，所述生物反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置為90~100轉(zhuǎn)/分，溶氧為50~55%，pH為7.2~7.4，溫度為36.4~36.8V ； 5)所述豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒接種24小時后至240小時采用灌注工藝培養(yǎng)，使用體積百分比為1%的牛血清培養(yǎng)基進行灌注，生物反應(yīng)器參數(shù)與步驟4)相同，其中:所述步驟2)中每接種IL的所述細胞液，每天加流灌注量為15L ； 6)所述豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒接種后240~360小時停止培養(yǎng)，將灌注培養(yǎng)工藝收集的病毒液與生物反應(yīng)器內(nèi)的病毒液混合，反復(fù)凍融兩次，凍融過程中不斷搖晃，即得豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，其特征在于:所述的 步驟3)中培養(yǎng)條件為:攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧為50%，pH為7.2，溫度為37。。。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，其特征在于:所述的步驟4)中的培養(yǎng)條件為:攪拌轉(zhuǎn)速為90轉(zhuǎn)/分，溶氧為50%，PH 為 7.4，溫度為 36.50C ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，其特征在于:所述的步驟5)中的培養(yǎng)基中牛血清的質(zhì)量百分含量為1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的一種應(yīng)用生物反應(yīng)器及片狀載體大規(guī)模擴增豬圓環(huán)病毒2型的方法，其特征在于:所述的步驟6)中病毒培養(yǎng)收獲時間為病毒接種后240小時。
【文檔編號】C12R1/93GK103614344SQ201310616032
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】錢鐘, 潘杰, 宋慶慶, 李群, 徐萍 申請人:揚州優(yōu)邦生物制藥有限公司