油酸在促進動物乳腺發(fā)育方面的應用的制作方法

本發(fā)明屬于動物繁殖發(fā)育技術領域，具體涉及一種長鏈單不飽和脂肪酸—油酸促進動物乳腺上皮細胞增殖、乳腺發(fā)育及其在動物乳腺發(fā)育中的應用。

背景技術：

乳腺器官具有分泌乳汁的功能，可為子代新生兒的生長、發(fā)育和健康提供充足的營養(yǎng)物質。在生產中，母豬過肥，乳房內發(fā)生脂肪浸潤，從而影響乳腺發(fā)育，對其后期泌乳功能也會造成不良影響，同時母豬產奶量不足會導致仔豬生長緩慢，甚至引起死亡。研究發(fā)現(xiàn)，母豬在哺乳期補充膳食脂質具有改善乳脂分泌的作用，但是對乳腺發(fā)育結構和功能的研究較少。因此，研究乳腺發(fā)育及其調控對于提高動物泌乳性能及其后代生長發(fā)育具有重要意義。

出生后動物乳腺的發(fā)育包括青春期（初情期）、妊娠期、哺乳期和退化期等不同的階段，初情期是乳腺導管和終末乳芽（terminalendbuds,teb）發(fā)育的重要時期，teb在妊娠期發(fā)育成腺泡是評價乳腺發(fā)育的重要指標。乳腺發(fā)育受到生長激素、雌激素和類胰島素增長因子-1（insulin-likegrowthfactorgene1,igf-1）等多種激素的調節(jié)，而營養(yǎng)也可通過影響激素水平進而調控乳腺發(fā)育。如高脂日糧抑制初情期小鼠乳腺發(fā)育，但其內在機制尚不清楚。此外，目前有關單一脂肪酸對小鼠初情期乳腺發(fā)育的影響的報道也很少。

油酸（oleicacid,oa）是18碳-9-烯酸的長鏈單不飽和脂肪酸，是橄欖油的主要脂肪酸（約占70～80%），其被認為是營養(yǎng)價值較高的脂肪酸。研究報道表明油酸對免疫調節(jié)、治療和預防不同類型的疾病，如心血管或自身免疫性疾病、代謝紊亂、皮膚損傷和乳腺癌有積極的作用。研究報道，母豬妊娠后2個月（妊娠早期）的日糧中添加橄欖油，母豬妊娠56d時橄欖油組母豬血漿中油酸（oa）和花生四烯酸（arachidonicacid,aa）的比例升高，同時母豬的初乳以及第3d、第21d的乳汁和血漿中的二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid,dha）含量升高。綜合看來，目前的研究均顯示，油酸對于養(yǎng)豬業(yè)中存在的豬乳成分的改善這一問題具有很好的積極意義。

但是，目前有關油酸對乳腺發(fā)育的結構和功能問題，特別是乳腺初情期的發(fā)育方面的研究尚屬空白，無相關技術報道，影響了油酸的進一步推廣應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有動物乳腺發(fā)育結構和功能的研究不足以及油酸的應用不足，提供油酸在促進動物乳腺發(fā)育中的應用，拓寬油酸的應用范圍的同時，使動物乳腺的發(fā)育性能顯著提高，為油酸在促進乳腺發(fā)育方面的應用提供有力的技術理論基礎。

本發(fā)明的第二個目的是提供油酸在作為或制備促進動物乳腺發(fā)育的飼料添加劑，或在制備促進動物乳腺發(fā)育的飼料方面的應用。

辦發(fā)明的第三個目的是提供一種促進動物乳腺發(fā)育的制品。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了油酸在促進動物乳腺發(fā)育方面的應用。

本發(fā)明還提供了油酸在作為或制備促進動物乳腺發(fā)育的飼料添加劑，或在制備促進動物乳腺發(fā)育的飼料方面的應用。

優(yōu)選地，所述應用為將油酸作為促進乳腺發(fā)育的活性成分添加于動物飼料、食品或藥品中，所述動物飼料、食品或藥品中油酸的添加量為質量比0.5%～5.0%。

本發(fā)明利用細胞mtt測試、edu熒光檢測表明油酸顯著促進動物乳腺上皮細胞增殖，檢測p21以及cyclind1表達量，表明油酸能夠通過調控增殖相關蛋白表達促進乳腺上皮細胞的增殖；通過westernblot方法檢測油酸對乳腺上皮細胞信號通路pi3k/akt以及相關周期蛋白的調控作用，并通過wholemount染色分析油酸對初情期小鼠乳腺發(fā)育的影響，初步探討油酸對動物乳腺上皮細胞增殖與乳腺發(fā)育的調控機理。本發(fā)明為油酸在促進乳腺發(fā)育方面的應用提供了技術理論基礎，為提高動物的繁殖性能提供參考。

優(yōu)選地，所述促進動物乳腺發(fā)育是指促進乳腺上皮細胞增殖、提高乳腺導管分支和/或提高乳腺終末乳芽數(shù)量。

優(yōu)選地，將所述油酸應用于促進動物乳腺上皮細胞增殖和/或促進p-pi3k、p-akt、cyclind1蛋白表達、抑制p21蛋白表達方面。

優(yōu)選地，應用對象為雌鼠、母豬或奶牛。

本發(fā)明還提供了一種促進動物乳腺發(fā)育的制品，所述制品中含有油酸。

優(yōu)選地，所述制品為飼料、食品或藥品。

優(yōu)選地，所述油酸的質量百分含量為0.5%～5.0%。

更優(yōu)選地，所述油酸的質量百分含量為2.0%。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過動物飼養(yǎng)試驗證明，在動物飼料中添加少量的油酸能顯著提高初情期小鼠乳腺導管分支和終末乳芽的數(shù)量，另通過細胞培養(yǎng)試驗證明，適當濃度的油酸能顯著促進動物乳腺上皮細胞增殖，顯著提高hc11細胞處于細胞分裂期中的s期的比例，極顯著提高p-pi3k、p-akt、cyclind1蛋白的表達，抑制p21蛋白的表達，使動物乳腺的發(fā)育性能顯著提高。

本發(fā)明明確了不同濃度的油酸對乳腺發(fā)育的影響，提示油酸通過激活pi3k/akt信號通路促進增殖相關蛋白的表達，最終促進乳腺發(fā)育，為油酸在促進乳腺發(fā)育方面的應用提供有力的技術理論基礎，為提高動物的育種工作提供參考。

本發(fā)明所述的油酸作為營養(yǎng)調控物質，添加量少，可以直接加入動物飼料、食品或藥品中，發(fā)揮的生理活性高，安全、有效、不會引起毒副作用，在促進動物乳腺發(fā)育方面具有良好的推廣應用前景。

附圖說明

圖1是不同濃度油酸對豬原代乳腺上皮細胞增殖表型的影響。

圖2是不同濃度油酸對小鼠乳腺上皮細胞hc11增殖表型的影響；其中，圖b和圖c是edu檢測100μm油酸對hc11細胞增殖的影響。

圖3是100μm油酸對hc11細胞增殖相關蛋白表達量的影響。

圖4是100μm油酸對hc11細胞內pi3k/akt信號通路的影響。

圖5是日糧中添加2%油酸對初情期小鼠乳腺導管分支和teb數(shù)量的影響。

具體實施方式

以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

實施例1油酸促進豬原代乳腺上皮細胞增殖

1、為研究油酸（oa）對乳腺上皮細胞增殖的影響，試驗首先以豬原代乳腺上皮細胞為研究對象：

（1）采用含有10%胎牛血清的dmem-f12培養(yǎng)基培養(yǎng)豬原代乳腺上皮細胞；

（2）分別用油酸（5、10、20、50、100μm）處理豬原代乳腺上皮細胞；其中，不同濃度油酸的溶劑為無水乙醇。

（3）收集細胞，利用mtt檢測細胞增殖表型。

2、結果如附圖1所示。結果表明，5～100μm的油酸均可顯著（p<0.05）促進豬乳腺上皮細胞的增殖。

實施例2油酸促進小鼠乳腺上皮細胞增殖

1、為進一步研究油酸（oa）對乳腺上皮細胞增殖的影響，試驗以乳腺上皮細胞hc11為研究對象，采用含有10%胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)hc11細胞。用不同濃度的油酸（12.5、25、50、100、200μm），處理上述hc11細胞。

（1）采用mtt檢測方法，測定油酸對乳腺上皮細胞增殖的影響。

結果如附圖2a所示。結果表明油酸以劑量依賴性促進hc11細胞增殖，在100μm和200μm時促進細胞增殖的效果最佳。

（2）使用100μm油酸處理hc11細胞4天，利用edu檢測hc11細胞在s期的細胞的比例。

結果如附圖2b、2c所示。結果表明100μm油酸極顯著促進hc11細胞處于細胞分裂期中的s期的比例，最終促進乳腺上皮細胞增殖。

2、為研究油酸（oa）對乳腺上皮細胞hc11增殖相關蛋白表達的影響，hc11細胞被接種在1塊經多聚賴氨酸包被過的6孔板中，分為2個組（對照組和1個處理組），經100μm油酸對hc11細胞進行處理4天。測定100μm油酸對乳腺上皮細胞cyclind1及p21蛋白表達量的影響。

（1）結果如附圖3所示。結果表明100μm油酸處理hc11細胞4天，可極顯著（p<0.01）促進hc11細胞cyclind1蛋白的熒光強度及極顯著（p<0.01）抑制p21蛋白的熒光強度，說明100μm油酸能夠通過調控增殖相關蛋白表達來促進乳腺上皮細胞的增殖。

3、為研究油酸對乳腺上皮細胞hc11信號通路pi3k/akt的影響，將細胞接種于六孔板，分為4組，分別為對照組、100μm油酸處理組、100nmwortmannin（wt，pi3k阻斷劑）組、100μm油酸和100nmwt共處理組，處理hc11細胞4天。westernblot檢測四個不同組別中100μm油酸對小鼠乳腺上皮細胞p-pi3k、p-akt、cyclind1及p21蛋白表達量的影響。

（1）結果如附圖4a所示。結果表明100nmwt逆轉了100μm油酸促進hc11細胞增殖的作用。

（2）結果如附圖4b、4c所示。結果表明100μm油酸極顯著（p<0.01）促進p-pi3k、p-akt、cyclind1蛋白的表達，且極顯著（p<0.01）抑制p21蛋白的表達；100nmwt逆轉了100μm油酸對信號通路蛋白和增殖相關蛋白表達的作用。

實施例3日糧中添加2%油酸對初情期小鼠乳腺發(fā)育的影響

1、實驗方法

（1）動物飼養(yǎng)條件：1只/箱，單養(yǎng)；飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40～70%；采用12h:12h晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗結果的可靠性。自由進食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供；檢疫：對購入spf級c57bl/6j小鼠預飼7d。期間每日檢查動物一次。

（2）動物分組及處理：將4周齡大的小鼠隨機分為正常對照組、油酸組、每組10只，共2組。正常對照組小鼠飼喂正常日糧，油酸組小鼠飼喂普通日糧添加2%的油酸日糧，小鼠飼喂5周后采樣。

（3）組織樣品的采集：試驗結束當天，頸椎脫臼處死小鼠，摘取5只小鼠乳腺左側組織平鋪于載玻片上，以便進行下一步的wholemount染色，分析油酸對小鼠乳腺發(fā)育的影響。

2、結果如附圖5所示。日糧中添加2%油酸可以極顯著（p<0.01）促進乳腺導管分支和teb的數(shù)量。結果提示，油酸可通過增加乳腺導管分支和teb數(shù)量，促進乳腺發(fā)育。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。