一種利用膜循環(huán)生物反應(yīng)器分階段制備L?鳥氨酸和丁二酸的方法與流程

本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種利用膜循環(huán)生物反應(yīng)器分階段制備l-鳥氨酸和丁二酸的方法。

背景技術(shù)：

l-鳥氨酸屬于堿性氨基酸，是活細(xì)胞中重要的代謝物，主要參與生物體內(nèi)的尿素循環(huán)，用于生物體內(nèi)瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、多胺的生物合成，具有保肝解毒和抗疲勞的功效。近年l-鳥氨酸在醫(yī)藥、保健領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，具有良好的市場前景。

微生物直接發(fā)酵法是生產(chǎn)l-鳥氨酸的重要來源，菌種主要為谷氨酸棒桿菌的精氨酸缺陷型菌株。專利zl201010286236.8公布了一種有氧發(fā)酵制備l-鳥氨酸的方法，以葡萄糖為碳源，l-鳥氨酸產(chǎn)量可達(dá)35～45g/l。專利zl201510024099.3公布了一種利用纖維床反應(yīng)器有氧發(fā)酵制備l-鳥氨酸的方法，可連續(xù)發(fā)酵多批，提高了發(fā)酵過程效率。發(fā)酵結(jié)束后衰老的谷氨酸棒桿菌均被作為固體廢渣處理，常被用于生產(chǎn)菌體蛋白飼料等附加值較低的產(chǎn)品，但是近年來的研究表明，谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下可將大量葡萄糖轉(zhuǎn)化為丁二酸，這一發(fā)現(xiàn)使谷氨酸棒桿菌的應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)一步擴(kuò)大，因此通過有氧-厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)l-鳥氨酸和丁二酸已被證明可行。目前一般采用離心或過濾的方式收集有氧發(fā)酵后的菌體，重新補(bǔ)充培養(yǎng)基后厭氧發(fā)酵制備丁二酸，但是這些處理方式對無菌潔凈環(huán)境的要求較高，在工業(yè)生產(chǎn)中極易感染雜菌和噬菌體，威脅生產(chǎn)。由此可見開發(fā)一種工藝簡單的l-鳥氨酸和丁二酸聯(lián)產(chǎn)的方法對將該技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用膜循環(huán)生物反應(yīng)器分階段制備l-鳥氨酸和丁二酸的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的效率低下，溶液感染等問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

所述的膜循環(huán)生物反應(yīng)器包括發(fā)酵罐、中空纖維膜組件和培養(yǎng)基儲罐；其中，發(fā)酵罐和中空纖維膜組件的進(jìn)料口連通，中空纖維膜組件的透過液出口通過透過液出口支路與培養(yǎng)基儲罐相連，中空纖維膜組件濃縮液出口通過管道與發(fā)酵罐連通；各相連管道上均設(shè)有閥門；

所述的方法它包括如下步驟：

(1)將培養(yǎng)后的谷氨酸棒桿菌種子液接入發(fā)酵罐中的有氧發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行有氧發(fā)酵制備l-鳥氨酸；

(2)在步驟(1)中的有氧發(fā)酵完成后，將所得有氧發(fā)酵液經(jīng)中空纖維膜組件的進(jìn)料口泵入中空纖維膜組件中進(jìn)行循環(huán)分離，透過液經(jīng)中空纖維膜組件的透過液出口流出并收集，用于l-鳥氨酸的提??；濃縮液經(jīng)中空纖維膜組件的濃縮液出口回流至發(fā)酵罐中；持續(xù)循環(huán)分離，直至發(fā)酵罐內(nèi)的有氧發(fā)酵液體積低于中空纖維膜組件膜分離的體積要求；

(3)將厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基通過透過液出口支路泵入中空纖維膜組件中，經(jīng)濃縮液出口進(jìn)入發(fā)酵罐中，再通過透過液出口支路泵入去離子水將中空纖維膜組件內(nèi)殘留的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基和菌體壓入發(fā)酵罐中；厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基和水都泵入完成后，在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵制備丁二酸；厭氧發(fā)酵完成后，將所得厭氧發(fā)酵液經(jīng)中空纖維膜組件的進(jìn)料口泵入中空纖維膜組件中，透過液從中空纖維膜組件的透過液出口流出并收集，用于丁二酸的提??；濃縮液由中空纖維膜組件的濃縮液出口回流至發(fā)酵罐中；持續(xù)循環(huán)分離，直至發(fā)酵罐內(nèi)的厭氧發(fā)酵液體積低于中空纖維膜組件膜分離的體積要求；

(4)完成步驟(3)中操作后，分別對發(fā)酵罐和膜組件進(jìn)行蒸汽和化學(xué)消毒處理，為下一批次的分階段發(fā)酵做準(zhǔn)備。

在有氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵完成前，所有連接管道上的閥門都處于關(guān)閉狀態(tài)。

步驟(1)中，所述的培養(yǎng)后的谷氨酸棒桿菌種子液由谷氨酸棒桿菌接種于種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到；

其中，

培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/l，k2hpo4·3h2o1.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.4g/l，feso4·7h2o20mg/l，mnso4·h2o20mg/l，尿素2.5g/l，生物素100μg/l，精氨酸200mg/l，維生素b1200μg/l，ph7.0；110℃下滅菌10min；

培養(yǎng)條件為：搖瓶裝液量10％，接種量2％，30℃下200rpm震蕩培養(yǎng)10h。

其中，所述的谷氨酸棒桿菌已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為cgmccno.3991。該菌株已經(jīng)在專利“一種高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌”(申請?zhí)枺?01010578530.6)中公開。

步驟(1)中，接入培養(yǎng)后的種子液前，先對發(fā)酵罐和有氧發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行蒸汽滅菌；蒸汽滅菌的條件為110℃，20min。

步驟(1)中，所述的有氧發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖60～90g/l，k2hpo4·3h2o1.0g/l，kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.25g/l，feso4·7h2o20mg/l，mnso4·h2o20mg/l，(nh4)2so440g/l，zncl21mg/l，cuso40.2mg/l，生物素100μg/l，精氨酸200mg/l，維生素b1200μg/l，ph7.0。

步驟(1)中，所述的有氧發(fā)酵的條件為：接種量為3～5％，發(fā)酵溫度為29～32℃，攪拌速度為300～500rpm；發(fā)酵過程中用氨水控制ph為6.7～7.0，并通入無菌空氣，通氣量為0.5～1.5vvm；發(fā)酵至殘留葡萄糖低于1g/l時，終止發(fā)酵。

步驟(2)中，在有氧發(fā)酵完畢前2小時，對中空纖維膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒，具體操作如下：

用無菌水配制的4g/lnaoh經(jīng)透過液出口支路泵入中空纖維膜，循環(huán)清洗20min，清洗廢水經(jīng)進(jìn)料口支路和濃縮液出口支路排出，膜組件隨后用無菌水經(jīng)透過液出口支路泵入將其洗至出水為ph9以下；接著再將無菌水配制的5g/l檸檬酸經(jīng)透過液出口支路泵入中空纖維膜，循環(huán)清洗20min，隨后用無菌水將其洗至出水為ph6以上，即完成中空纖維膜的化學(xué)消毒。

步驟(2)中，所述的中空纖維膜組件中，中空纖維膜為微濾膜，膜孔徑為0.1～0.22μm。

步驟(3)中，所述的厭氧發(fā)酵基的配方為：葡萄糖40～80g/l，k2hpo4·3h2o0.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，feso4·7h2o6mg/l，mnso4·h2o6mg/l，生物素200μg/l，維生素b1200μg/l，ph7.0。

步驟(3)中，所述的厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵溫度為29～32℃，攪拌速度為150～200rpm；發(fā)酵過程中用20％的na2co3控制ph為6.5～6.8，并通入無菌co2氣體發(fā)酵，通氣量為0.1～0.2vvm；發(fā)酵至殘留葡萄糖低于1g/l時，終止發(fā)酵。

步驟(3)中，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐時，會經(jīng)過中空纖維膜過濾除菌，因此只需要泵入未消毒的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基即可。

步驟(3)中，當(dāng)厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐后，繼續(xù)泵入少量去離子水將膜組件內(nèi)少量殘留的培養(yǎng)基壓入發(fā)酵罐中。

步驟(2)和(3)中，中空纖維膜組件分離發(fā)酵液時，每小時的循環(huán)體積流速為2～3.0vvh。

步驟(4)中，對發(fā)酵罐進(jìn)行蒸汽滅菌處理和對中空纖維膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒的操作與步驟(1)和(2)中相同。

有益效果：

與現(xiàn)有l(wèi)-鳥氨酸發(fā)酵后通過離心回收菌體細(xì)胞用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸相比，本發(fā)明可避免菌體細(xì)胞暴露在外界空氣中，不但大幅降低了染菌幾率，還同時完成了對發(fā)酵液的除菌預(yù)處理，便于后期提取產(chǎn)品；通過膜組件對厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行過濾除菌可替代傳統(tǒng)的蒸汽殺菌，減少了能耗。可見，本發(fā)明可降低同一菌株分階段制備l-鳥氨酸與丁二酸的操作難度，縮短了操作周期，適合規(guī)模化生產(chǎn)控制。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所用膜循環(huán)生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為膜循環(huán)生物反應(yīng)器化學(xué)消毒清洗中空纖維膜組件的示意圖；

圖3為膜循環(huán)生物反應(yīng)器分離發(fā)酵液的示意圖；

圖4為膜循環(huán)生物反應(yīng)器補(bǔ)充厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基的示意圖。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

以下實施例采用的是5l發(fā)酵罐，蠕動泵泵入速度1vvh＝5l/h，通氣速度1vvm＝5l/min。

實施例1

本發(fā)明及其它實施例中所述的膜循環(huán)生物反應(yīng)器如圖1所示，它包括反應(yīng)罐1、中空纖維膜組件2和培養(yǎng)基儲罐3；反應(yīng)罐1和中空纖維膜組件2的進(jìn)料口4以及濃縮液出口8相連；中空纖維膜組件2下方設(shè)有透過液出口6，并通過透過液出口支路7和培養(yǎng)基儲罐3相連；其中，濃縮液出口8處和進(jìn)料口4處分別設(shè)有濃縮液出口支路9和進(jìn)料口支路5，用于排出廢水。所有進(jìn)出口處和支路上均設(shè)有閥門。

如圖2所示，此時膜循環(huán)生物反應(yīng)器中正對中空纖維膜組件2進(jìn)行化學(xué)清洗消毒。此時，除進(jìn)料口支路5和濃縮液出口支路9上的閥門外，所有閥門均關(guān)閉。

如圖3所示，此時膜循環(huán)生物反應(yīng)器正在分離發(fā)酵液。此時，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液從進(jìn)料口進(jìn)入中空纖維膜組件中，分離得到的透過液通過透過液出口流出，分離得到的濃縮液通過濃縮液出口回流至發(fā)酵罐中。此時，進(jìn)料口支路、濃縮液出口支路和透過液出口支路上的閥門關(guān)閉。

如圖4所示，此時膜循環(huán)生物反應(yīng)器中正在為發(fā)酵罐中補(bǔ)充厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基。此時，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基從發(fā)酵培養(yǎng)基儲罐中由透過液出口支路經(jīng)透過液出口泵入中空纖維膜組件中，再經(jīng)濃縮液出口進(jìn)入發(fā)酵罐中。

實施例2

將5l發(fā)酵罐與孔徑為0.1μm的中空纖維膜組件串聯(lián)形成膜循環(huán)生物反應(yīng)器。將培養(yǎng)好的種子液接入已經(jīng)經(jīng)過蒸汽滅菌處理的發(fā)酵罐(裝液量為3l)中進(jìn)行有氧發(fā)酵，有氧發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為60g/l，接種量為3％，發(fā)酵溫度29℃，發(fā)酵過程中控制ph為6.7，無菌空氣的通氣量為0.5vvm，攪拌速度300rpm，發(fā)酵至40h，殘留葡萄糖低于1g/l時，終止發(fā)酵。發(fā)酵液中產(chǎn)l-鳥氨酸18.8g/l。打開發(fā)酵罐與膜組件相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過蠕動泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，循環(huán)流速體積流速為2vvh，分離出2.9l發(fā)酵液用于l-鳥氨酸的提取，細(xì)胞截留率為99％。

將通入的無菌空氣切換為無菌co2氣體，體積為3l的葡萄糖濃度為40g/l的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基由膜組件的濾出液出口泵入膜組件，同時打開由膜組件返回發(fā)酵罐的閥門，泵入時的體積流速為3vvh，經(jīng)過中空纖維膜過濾的厭氧培養(yǎng)基將被攔截在膜組件內(nèi)的細(xì)胞反沖入發(fā)酵罐中，當(dāng)培養(yǎng)基輸送完畢后，繼續(xù)泵入200ml去離子水將膜組件內(nèi)少量殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞壓入發(fā)酵罐中，隨后關(guān)閉膜組件與發(fā)酵罐相連的所有閥門，并對膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒清洗。厭氧發(fā)酵溫度29℃，發(fā)酵過程中控制ph為6.5，無菌co2氣體的通氣量為0.1vvm，攪拌速度150rpm，發(fā)酵28h至殘留葡萄糖低于1g/l時，丁二酸產(chǎn)量為28.4g/l，再次打開相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過蠕動泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，泵入時的體積流速為3vvh，分離出3.1l發(fā)酵液用于丁二酸的提取，細(xì)胞截留率為99％。

實施例3

將5l發(fā)酵罐與孔徑為0.22μm的中空纖維膜組件串聯(lián)形成膜循環(huán)生物反應(yīng)器。將培養(yǎng)好的種子液接入已經(jīng)經(jīng)過蒸汽滅菌處理的發(fā)酵罐(裝液量為3l)中進(jìn)行有氧發(fā)酵，有氧發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為80g/l，接種量為5％，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵過程中控制ph為6.8，無菌空氣的通氣量為1.0vvm，攪拌速度500rpm，發(fā)酵至48h，殘留葡萄糖低于1g/l時，終止發(fā)酵。發(fā)酵液中產(chǎn)l-鳥氨酸26.8g/l。打開發(fā)酵罐與膜組件相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過蠕動泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，循環(huán)流速體積流速為2.5vvh，分離出2.85l發(fā)酵液用于l-鳥氨酸的提取，細(xì)胞截留率為98％。

將通入的無菌空氣切換為無菌co2氣體，體積為2.5l的葡萄糖濃度為60g/l的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基由膜組件的濾出液出口泵入膜組件，同時打開由膜組件返回發(fā)酵罐的閥門，泵入時的體積流速為2vvh，經(jīng)過中空纖維膜過濾的厭氧培養(yǎng)基將被攔截在膜組件內(nèi)的細(xì)胞反沖入發(fā)酵罐中，當(dāng)培養(yǎng)基輸送完畢后，繼續(xù)泵入300ml去離子水將膜組件內(nèi)少量殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞壓入發(fā)酵罐中，隨后關(guān)閉膜組件與發(fā)酵罐相連的所有閥門，并對膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒清洗。厭氧發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵過程中控制ph為6.8，無菌co2氣體的通氣量為0.2vvm，攪拌速度200rpm，發(fā)酵36h至殘留葡萄糖低于1g/l時，丁二酸產(chǎn)量為42.1g/l，再次打開相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過蠕動泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，泵入時的體積流速為3vvh，分離出2.7l發(fā)酵液用于丁二酸的提取，細(xì)胞截留率為98％。

實施例4

將5l發(fā)酵罐與孔徑為0.15μm的中空纖維膜組件串聯(lián)形成膜循環(huán)生物反應(yīng)器。將培養(yǎng)好的種子液接入已經(jīng)經(jīng)過蒸汽滅菌處理的發(fā)酵罐(裝液量為3l)中進(jìn)行有氧發(fā)酵，有氧發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為90g/l，接種量為4％，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵過程中控制ph為7.0，無菌空氣的通氣量為1.5vvm，攪拌速度300rpm，發(fā)酵至58h，殘留葡萄糖低于1g/l時，終止發(fā)酵。發(fā)酵液中產(chǎn)l-鳥氨酸34.5g/l。打開發(fā)酵罐與膜組件相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過蠕動泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，循環(huán)流速體積流速為3vvh，分離出2.9l發(fā)酵液用于l-鳥氨酸的提取，細(xì)胞截留率為99％。將通入的無菌空氣切換為無菌co2氣體，體積為2.0l的葡萄糖濃度為80g/l的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基由膜組件的濾出液出口泵入膜組件，同時打開由膜組件返回發(fā)酵罐的閥門，泵入時的體積流速為3vvh，經(jīng)過中空纖維膜過濾的厭氧培養(yǎng)基將被攔截在膜組件內(nèi)的細(xì)胞反沖入發(fā)酵罐中，當(dāng)培養(yǎng)基輸送完畢后，繼續(xù)泵入200ml去離子水將膜組件內(nèi)少量殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞壓入發(fā)酵罐中，隨后關(guān)閉膜組件與發(fā)酵罐相連的所有閥門，并對膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒清洗。厭氧發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵過程中控制ph為7.0，無菌co2氣體的通氣量為0.1vvm，攪拌速度150rpm，發(fā)酵48h至殘留葡萄糖低于1g/l時，丁二酸產(chǎn)量為53.3g/l，再次打開相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過蠕動泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，泵入時的體積流速為2vvh，分離出2.2l發(fā)酵液用于丁二酸的提取，細(xì)胞截留率為99％。