專利名稱：基因工程菌、用其制備重組s-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應(yīng)用的制作方法
基因工程菌、用其制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及的是一種基因工程菌及其表達(dá)制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的生產(chǎn)方法，以及該酶酶學(xué)性質(zhì)的測定和在L-同型半胱氨酸檢測試劑盒中的應(yīng)用，具體為基因工程菌、用其制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
同型半胱氨酸(Hcy)即2-氨酸_4_巰基丁酸，也稱高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，參與甲硫氨酸的代謝過程，可被甲基化生產(chǎn)蛋氨酸，或被轉(zhuǎn)硫化作用生成半胱氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產(chǎn)物，并可釋放到血液中。它涉及亞甲基四氫葉酸還原酶、胱氨醚β合成酶和甲硫氨酸合成酶等多種代謝調(diào)節(jié)酶；也涉及調(diào)節(jié)酶的多種輔助因子如葉酸、維生素Β6和維生素Β12。當(dāng)上述酶基因突變或輔助因子缺乏，會導(dǎo)致甲硫氨酸的代謝產(chǎn)物Hcy的轉(zhuǎn)化受阻，使血漿中Hcy水平升高。目前研究認(rèn)為，Hcy水平的升高與心、腦血管及周圍血管動脈粥樣硬化病變有關(guān)，并與老年癡呆、腎功能衰竭、流產(chǎn)及糖尿病早亡有關(guān)，所以Hcy的體外檢測具有重要的臨床價值，可用于預(yù)測腦血管疾病發(fā)生的危險性。
目前檢測血漿中Hcy的方法很多，主要有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。HPLC法操作復(fù)雜、耗時且費(fèi)用較高；ELISA法操作方便、快捷、重復(fù)性好，但是大部分操作仍需手工操作，不適合臨床大批量標(biāo)本同時測定。目前循環(huán)酶法測定高半胱氨酸 (Hcy)容易自動化，測定時間短，可以在自動生化分析儀上進(jìn)行，測定靈敏度高。該方法利用的主要技術(shù)原理利用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)在三乙羧乙基膦(TECP) 作用下，氧化型同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為游離型Hcy，游離型Hcy與共價底物S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)催化反應(yīng)形成蛋氨酸和S腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)。AdoHcy被AdoHcyase水解成腺苷(Ado)和Hcy，生成物Ado立即水解為次黃嘌呤和氨，氨在谷氨酸脫氫酶的作用下，使 NADH轉(zhuǎn)化為NAD+，樣本中的Hcy的濃度與NADH的變化成正比。
AdoHcyase在Hcy的循環(huán)酶法檢測中具有重要的作用，然而目前現(xiàn)有的AdoHcyase 催化AdoHcy水解反應(yīng)的Km值偏高，生產(chǎn)方法繁瑣，導(dǎo)致在試劑盒配方中，所需酶量偏多，試劑盒成本偏高，一定程度上限制了循環(huán)酶法在Hcy檢測中的應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基因工程菌。
該基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為 CGMCCNo. 56M，保藏日期2011. 12.沈，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該工程菌是通過PCR技術(shù)從環(huán)境基因組文庫中篩選獲得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(AdoHcyase)基因，插入到含有T7強(qiáng)啟動子的PED8質(zhì)粒中，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，獲得高效表達(dá)AdoHcyase的基因工程菌。
上述的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ ID. No. 1所示核苷酸序列和由上述核苷酸序列編碼的如SEQ ID. No. 2所示的氨基酸序列。
該基因工程菌菌株的典型培養(yǎng)特征為形態(tài)特征菌落乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面和背面顏色一致。
生理生化特征具有大腸桿菌的生理生化特性，同時插入了 AdoHcyase基因，具有高效表達(dá)AdoHcyase特性。
本發(fā)明上述的基因工程菌是這樣獲得的
(1)用提取試劑盒從環(huán)境中直接提取總DNA，并克隆到載體PUC18上，構(gòu)建環(huán)境基因組文庫；
(2)根據(jù)AdoHcyase基因序列設(shè)計引物，兩條引物分別為
上游5，-TTCGTCAACCGGATACGTAAACGCTCTT-3，
下游5，-AACCTGAAGCCCAATCCGACCCGACAT-3，
(3)應(yīng)用如上所述引物，應(yīng)用PCR方法從環(huán)境基因組DNA文庫中大量篩選克隆，擴(kuò)增獲得1. 2kb的AdoHcyase基因片段，并通過測序，確定獲得的片段具有如SEQ ID. No. 1所示核苷酸序列和SEQ ID. No. 2所示氨基酸序列；通過BLAST比對，與報道的嗜酸熱硫化葉菌 (Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的 AdoHcyase 基因具有 98% 的同源性;
(4)步驟( 擴(kuò)增產(chǎn)物利用回收試劑盒純化回收，回收片段，經(jīng)amH I和Nco I雙酶切的PED8質(zhì)粒，形成粘性末端，并于同樣酶切的PED8質(zhì)粒，T4連接，將AdoHcyase基因片段插入到T7啟動子的下游，獲得含有AdoHcyase基因的質(zhì)粒PET28 ；
(5)將步驟(4)獲得的質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，涂布含有50 100mg/L卡拉霉素(Kana)抗性的LB平板上，篩選含有轉(zhuǎn)化子的陽性菌落；
(6)培養(yǎng)步驟(5)所得菌落，提取質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增，電泳分析，確定陽性菌落含有 AdoHcyase編碼基因的質(zhì)粒PET28 ；
(7)通過如上步驟，即獲得基因工程菌，該工程菌含有AdoHcyase編碼基因，能夠表達(dá)高活性的AdoHcyase。
本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種上述基因工程菌培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)純化獲得重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法，制備步驟包括
(1)將保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為CGMCC No. 56M，保藏日期:2011. 12. 26的基因工程菌接入到含有50 200mg/L卡拉霉素(Kana)的2YT或LB液體培養(yǎng)基中，10 37°C培養(yǎng)至0D_為0. 4 0. 8時，然后加入終濃度為0. 1 1. Ommol/L(終濃度即加入后在液體培養(yǎng)基中的濃度)IPTG(異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)，10 37°C繼續(xù)培養(yǎng)18 32h ；
或?qū)⒒蚬こ叹苯咏尤氲饺樘亲哉T導(dǎo)培養(yǎng)基中，乳糖含量為0. 1 10% (質(zhì)量體積濃度即0. 1 10g/100ml)，10 37°C培養(yǎng)24 72h ；
(2)將步驟(1)所得培養(yǎng)液于5000 IOOOOrpm離心20 40min，收集菌體，加入菌體體積1 20倍、pH6. 5 8. 0的磷酸緩沖液，破碎菌體；破碎后在10000 18000rpm 離心20 50min，收集上清液，過陽離子交換樹脂，用0 500mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫；或者過疏水層析，用0 400mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫，分部收集， 回收含有酶活的部分；
(3)在收集含有酶活溶液中加入終濃度為0. 1 5% (質(zhì)量體積濃度即0. 1 5g/100ml)的保護(hù)劑，然后置于_20°C預(yù)冷10 50h，再在-40 _60°C、30 1001 下冷凍干燥M 72h，得到酶制劑即含有重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的酶制劑。
本發(fā)明步驟(3)中的保護(hù)劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、甘油中的一種或兩種。
為了提高酶產(chǎn)量，簡化純化步驟，將該基因克隆到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，從而應(yīng)用于同型半胱氨酸檢測試劑盒，降低試劑盒的生產(chǎn)成本。
所獲的重組AdoHcyase的酶學(xué)性質(zhì)測定是通過以下方法實現(xiàn)的
在反應(yīng)體系中，加入0. Olmmol/L的水解反應(yīng)底物AdoHcy，加入一定量重組 AdoHcyase，測定酶催化底物水解生產(chǎn)腺苷(Ado)的量來確定酶活。一個酶活單位定義為在最適pH、37°C條件下，催化lymol AdoHcy水解生成腺苷(Ado)和L-同型半胱氨酸 (L-Hcy)。
腺苷的量是通過高效液相色譜法(HPLC)測定的，HPLC測定條件為柱子C18反相柱，洗脫液水甲醇=95 5(體積比)，含有l(wèi)mol/L醋酸鈉，pH為4.5，流速lml/min， 檢測波長260nm，以0. 01 0. lmmol/L的腺苷作為外標(biāo)，獲得反應(yīng)體系中生產(chǎn)腺苷的量。
最適溫度的測定為在pH 7. 2的120mmol/L磷酸鉀緩沖液中，加入2mM EDTA, 0. Olmmol/L AdoHcy，分別孵育至30、35、40、45、50、55、60、65°C，加入一定量的酶制劑，反應(yīng) lOmin，立即加入50 μ 1 5Ν HCLO4,終止反應(yīng)。取20 μ 1反應(yīng)液，HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物腺苷的量。得到最適溫度為55°C。
最適pH 值測定是在 pH 分別為 6. 0,6. 4,6. 8,7. 2,7. 6,8. 0,8. 4,8. 8 的 IOOmmol/L 磷酸鉀緩沖液加入2mM EDTA、0. Olmmol/L AdoHcy，孵育至37°C，加入一定量的酶制劑，37°C 反應(yīng)lOmin，立即加入50 μ 1 5Ν HCLO4,終止反應(yīng)。取20 μ 1反應(yīng)液，HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物腺苷的量。得到最適PH值為7. 2。
Km值測定是在IOOmmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7. 2)，加入2mM EDTA,然后分成十份， 每份 1ml，分別加入 0. 05,0. 04,0. 03,0. 02,0. 01,0. 005,0. 004,0. 003,0. 002,0. 001mmol/L AdoHcy，孵育至37°C，加入一定量的酶制劑，反應(yīng)lOmin，立即加入50 μ 15N HCLO4,終止反應(yīng)。取20 μ 1反應(yīng)液，HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物腺苷的量，測定反應(yīng)速度，利用origins. 0軟件耦合曲線。獲得 Km 值為 0. 009 士0. 0009mmol/L。
本發(fā)明通過PCR技術(shù)從環(huán)境中大量篩選獲得一 AdoHcyase基因片段，其中核苷酸編碼序列含有1248個堿基對，通過BlAST比對，發(fā)現(xiàn)它與報道的嗜酸熱硫化葉菌 (Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的 AdoHcyase 基因具有 98% 的同源性，只有 21 個堿基序列不同。編碼的氨基酸與前者有13處不同，其中25位Met —Lys，58位Val — Asp， 94 位 His — Arg, 156 位 Lys — His，281 位 Met — Thr, 309 位 Thr — Ser, 314 位 Gln — Asn, 332 位 Asp — Glu, 365 位 Lys — His, 375 位 Tyr — Trp, 378 位 Pro — Ser, 392 位 Ala — Gly, 395位Ile — Leu0氨基酸序列的不同導(dǎo)致該酶空間結(jié)構(gòu)和活性位點發(fā)生變化，促使該酶催化水解反應(yīng)具有不同的特性。
本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果
1.本發(fā)明的重組AdoHcyase催化S-AdoHcy水解反應(yīng)的Km值為 0. 009士0. 0009mmol/L,遠(yuǎn)低于其他方式如從菠菜葉中的提取的AdoHcyase相應(yīng)Km值為 0. 04ImM、黃花羽扇豆提取的AdoHcyase相應(yīng)Km值為0. OllmM獲得的AdoHcyase相應(yīng)Km，而且該重組AdoHcyase生產(chǎn)方法簡單，產(chǎn)量較高。
2.本發(fā)明獲得的重組AdoHcyase催化水解反應(yīng)活性強(qiáng)，特異性好，抗干擾能力強(qiáng)， 并且在大腸桿菌得到高效表達(dá)，純化方式簡單，可以大規(guī)模生產(chǎn)，可以減少在Hcy檢測試劑盒中的用量，縮短反應(yīng)時間，降低了試劑盒生產(chǎn)成本，有利于同型半胱氨酸酶法檢測的推
3.本發(fā)明將所獲基因插入到含有T7強(qiáng)啟動子的PET28的質(zhì)粒中，并導(dǎo)入到大腸桿菌中，構(gòu)建產(chǎn)AdoHcyase的大腸桿菌基因工程菌。所獲基因工程菌在IPTG或乳糖誘導(dǎo)下能夠高效的表達(dá)AdoHcyase，經(jīng)過疏水純化或陽離子交換樹脂純化，獲得純酶，并制備成酶干粉。所述的基因工程菌表達(dá)制備AdoHcyase的方法簡單，表達(dá)量穩(wěn)定，可以進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化擴(kuò)大，生產(chǎn)試劑盒所需的大量酶源，廣泛應(yīng)用于L-同型半胱氨酸檢測試劑盒中。
本發(fā)明上述的基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為 CGMCC No. 56M，保藏日期2011. 12.沈，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
具體實施方式
下面通過實施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例
實施例1
根據(jù)文獻(xiàn)中發(fā)表的AdoHcyase基因序列，設(shè)計引物序列
正向引物5，-TTCGTCAACCGGATACGTAAACGCTCTT-3，
反向引物5，-AACCTGAAGCCCAATCCGACCCGACAT-3，
應(yīng)用上述引物，利用PCR方法從環(huán)境基因組文庫中大量篩選克隆PCR反應(yīng)體系
10*擴(kuò)增緩沖液 ΙΟμΙ dNTP 混合物 20μιηο1 引物50pmol模板0.5 pgrTaqDNA 聚合酶 2.5U Mg2+0.15mmol/L
加雙蒸水至100 μ 1 ；
PCR 反應(yīng)條件-MV 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min, 30 個循環(huán)；72°C IOmin, 4 °C ；
取PCR產(chǎn)物10 μ 1，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)有1. 2kb的產(chǎn)物條帶，用DNA回收試劑盒回收該條帶，對該條帶進(jìn)行測序，并通過測序，確定獲得的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ ID. No. 1所示核苷酸序列和SEQ ID. No. 2所示氨基酸序列。通過BLAST比對，與報道的嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius DSM 639)的AdoHcyase基因具有98%的同源性。
實施例2 將實施例1中獲得的片段，與經(jīng)BamH I和Nco I雙酶切的PED8質(zhì)粒進(jìn)行連接，獲得帶有該片段的PED8質(zhì)粒。
酶切反應(yīng)體系為
2 X buffer 10 μ 1、
質(zhì)粒2μ1、
BamHI 1 μ 1、
NcoI Ιμ 、
雙蒸水6 μ 1
酶切反應(yīng)條件37°C，14 Mh
連接反應(yīng)體系為
2 X buffer 10 μ 1、
質(zhì)粒Ιμ 、
回收片段Ιμ 、
Τ4 1 μ 1
雙蒸水7 μ 1
連接反應(yīng)條件37°C，14 24h。
將獲得的PED8質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21中；轉(zhuǎn)化條件為50 μ 1感受態(tài)細(xì)胞加入 2μ 1質(zhì)粒，冰浴30min，42°C熱擊90s，然后涂布含100mg/L Kana抗性LB平板，37 °C過夜培養(yǎng)，挑選陽性克隆，即獲得含有AdoHcyase基因的大腸桿菌基因工程菌(保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為 CGMCC No. 5654，保藏日期2011. 12. 26 的)。
實施例3 將實施例2得到的菌株從平板上接種到含有100mg/L Kana的2YT液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)8h，在細(xì)胞密度達(dá)到0D_為0. 6，加入終濃度為0. 6mmol/L的 IPTG，30°C培養(yǎng)20h后，停止培養(yǎng)；9000rpm離心20min收集菌體，pH7. 2的200mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗菌體1次，加5倍緩沖液破碎菌體，IOOOOrpm離心50min，收集上清液，過陽離子交換樹脂，先用50mmol/L NaCl濃度洗脫，然后分別用100、200、300mmol/L的NaCl濃度洗脫，收集濃度為200mmol/L濃度的NaCl洗脫部分，SDS凝膠電泳，鑒定為純酶。
實施例4 將實施例2得到的菌株從平板上接種到含有200mg/L Kana的LB液體培養(yǎng)基中，25°C振蕩培養(yǎng)10h，在細(xì)胞密度達(dá)到0D_為0. 8，加入終濃度為0. 3mmol/L的IPTG，培養(yǎng)32h后，停止培養(yǎng)；IOOOOrpm離心20min收集菌體，pH7. 8的200mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗菌體2次，加3倍緩沖液破碎細(xì)胞，12000rpm離心30min，收集上清液，過疏水層析柱，分別用400、300、200、100mmol/L NaCl濃度洗脫，收集200mmol/L濃度的NaCl洗脫部分， SDS凝膠電泳，鑒定為純酶。
實施例5 將實施例2得到的菌株從平板上接種到含有50mg/L Kana的乳糖自誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的組成為胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，葡萄糖、4%乳糖、0. 6% NaCl，37°C振蕩培養(yǎng)48h，停止培養(yǎng)，IOOOOrpm離心40min收集菌體，pH6. 0的 200mmol/L磷酸緩沖液清洗菌體2次，加20倍緩沖液破碎細(xì)胞，IOOOOrpm離心60min，去除沉淀，將上清液過疏水層析柱，分別用400、300、200、1 OOmmo 1 /L NaCl濃度洗脫，收集200mmol/L NaCl濃度的洗脫部分，SDS凝膠電泳，鑒定為純酶。
實施例6 將實施例3、4、5所得的純酶，加入終濃度為5 %聚乙二醇、1 %甘油，-20°C預(yù)冷50h;然后在冷阱溫度為-40°C，壓力為100 下冷凍干燥Mh，得到重組 AdoHcyase 酶制齊LU
實施例7 將實施例3、4、5所得的純酶，加入終濃度為2%海藻糖，_20°C預(yù)冷36h ； 然后在冷阱溫度為_50°C，壓力為301 下冷凍干燥50h，得到重組AdoHcyase酶制劑。
實施例8 將實施例6、7獲得的重組AdoHcyase酶制劑，測定最適反應(yīng)溫度，測定方法如下
在pH 7. 2 的 120mmol/L 磷酸鉀緩沖液中，加入 2mM EDTA、0. Olmmol/L AdoHcy，分別孵育至30、35、40、45、50、55、60、65°〇，加入一定量的酶制劑，反應(yīng)lOmin，立即加入50 μ 1 5Ν HCLO4,終止反應(yīng)。取20 μ 1反應(yīng)液，HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物腺苷的量。HPLC測定條件為柱子C18反相柱，洗脫液水甲醇=95 5，含有l(wèi)mol/L醋酸鈉，pH為4. 5，流速lml/min， 檢測波長260nm，以0. lmmol/L的腺苷作為外標(biāo)，測定反應(yīng)體系中生成腺苷的量。求出不同溫度條件下的反應(yīng)速度和相對酶活如表1
表1 不同溫度下，AdoHcyase催化AdoHcy水解反應(yīng)速度
權(quán)利要求
1.一種基因工程菌，其特征在于該基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏編號為CGMCC No. 56M，保藏日期:2011. 12. 26，保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心；是通過PCR技術(shù)從環(huán)境基因組文庫中篩選獲得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，插入到含有T7強(qiáng)啟動子的PED8質(zhì)粒中，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌 BL21中，獲得高效表達(dá)AdoHcyase的基因工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因具有SEQ ID. No. 1所示核苷酸序列和由上述核苷酸序列編碼的如SEQ ID.No.2所示的氨基酸序列。
3.一種利用權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法，其特征在于該水解酶的制備步驟包括(1)將保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)，保藏編號為CGMCC No. 56M，保藏日期:2011. 12. 26的基因工程菌接入到含有50 200mg/L卡拉霉素的2YT或LB液體培養(yǎng)基中，10 37°C培養(yǎng)至0D600為 0. 4 0. 8時，然后加入終濃度為0. 1 1. Ommol/L IPTG誘導(dǎo)，10 37°C繼續(xù)培養(yǎng)18 32h ；或?qū)⒒蚬こ叹苯咏尤氲饺樘亲哉T導(dǎo)培養(yǎng)基中，乳糖含量為0. 1 10%，10 37°C 培養(yǎng)24 72h ；(2)將步驟(1)所得培養(yǎng)液于5000 IOOOOrpm離心20 40min，收集菌體，加入菌體體積1 20倍、pH6. 5 8. 0的磷酸鹽緩沖液，破碎菌體；破碎后在10000 18000rpm離心20 50min，收集上清液，過陽離子交換樹脂，用0 500mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫；或者過疏水層析，用0 400mmol/L濃度不同梯度NaCl鹽溶液洗脫；分部收集，回收含有酶活的部分；(3)在收集含有酶活溶液中加入終濃度為0.1 5%的保護(hù)劑，然后置于-20°C預(yù)冷 10 50h，再在-40 -60°c、30 1001 下冷凍干燥M 72h，得到酶制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的制備方法，其特征在于 步驟(3)中所述的保護(hù)劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、甘油中的一種或兩種。
5.一種權(quán)利要求1所述的重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在L-同型半胱氨酸檢測試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
基因工程菌、用其制備重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及該酶的應(yīng)用.本發(fā)明公開一種基因工程菌，該基因工程菌命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)；是通過PCR技術(shù)從環(huán)境基因組文庫中篩選獲得一高活性的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，插入到含有T7強(qiáng)啟動子的PET28質(zhì)粒中，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，獲得高效表達(dá)AdoHcyase的基因工程菌。本發(fā)明還公開了利用上述基因工程菌制備水解酶的方法及水解酶的應(yīng)用。本發(fā)明的水解酶具有Km值為0.009±0.0009mmol/L，遠(yuǎn)低于其他方式獲得的AdoHcyase相應(yīng)Km，而且該重組AdoHcyase生產(chǎn)方法簡單，產(chǎn)量較高的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/19GK102559572SQ20121002792
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者章玉勝, 賈江花, 鄒炳德, 鄒繼華 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司