一種表達(dá)胸腺素β4的基因工程菌的制備及應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)胸腺素β4的基因工程菌的制備及應(yīng)用方法，包含：步驟1.合成能夠在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)的胸腺素β4基因序列；步驟2.將步驟1所得的基因重組進(jìn)經(jīng)SapI酶切的pTWIN1質(zhì)粒載體，得到pTWIN-Tβ4融合載體；步驟3.以所得的pTWIN-Tβ4為模板，PCR擴(kuò)增該載體上的內(nèi)含肽序列以及Tβ4序列；步驟4.將所得的基因序列重組進(jìn)經(jīng)NcoI、XhoI酶切的質(zhì)粒pET-28a中，得到pET-Tβ4表達(dá)載體；步驟5.將所得的載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞BL21中，得到pET-Tβ4工程菌；步驟6.在所得菌液的OD600值為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)Tβ4表達(dá)。本發(fā)明還公開(kāi)了該表達(dá)胸腺素β4的基因工程菌的應(yīng)用方法。本發(fā)明提供的表達(dá)胸腺素β4的基因工程菌的制備及應(yīng)用方法，為低成本又環(huán)保地生產(chǎn)胸腺素β4奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種表達(dá)胸腺素β4的基因工程菌的制備及應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因工程菌的制備及應(yīng)用方法，具體地，涉及一種表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的制備及應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胸腺素β 4 (Thymosin beta 4，T β 4)是由43個(gè)氨基酸組成的酸性多肽，N端第一個(gè)氨基酸Ser的氨基被乙?；揎?，無(wú)二硫鍵。其氨基酸序列如下=Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-AIa-GIu-1Ie-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-1Ie-Glu-GIn-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。胸腺素 β4 分子量為 4964Da，等電點(diǎn)為 5.1。
[0003]胸腺素β 4是一種多功能因子，能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合、解聚，在促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合、角膜損傷修復(fù)、神經(jīng)損傷修復(fù)、抗炎癥、促進(jìn)組織再生、血管生成及抗細(xì)胞凋亡等方面起到重要作用。目前臨床應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷愈合、眼角膜損傷修復(fù)、干眼癥治療、心肌損傷修復(fù)、神經(jīng)損傷修復(fù)以及化妝品領(lǐng)域(使皮膚年輕化、恢復(fù)皮膚的彈性、消除老年斑等)等。
[0004]目前有關(guān)胸腺素β4的產(chǎn)品還沒(méi)上市，臨床和研究用胸腺素β 4主要來(lái)源于固相合成，這種化學(xué)合成方法需要大量的有機(jī)試劑，造成的嚴(yán)重環(huán)境污染。隨著環(huán)境的日益污染，政府環(huán)評(píng)的逐年提高，化學(xué)合成方法將被逐步淘汰。此外，固相合成胸腺素β4成本也較高，雜質(zhì)種類較多。因此，利用基因工程方法生產(chǎn)胸腺素β 4勢(shì)在必行。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于制備和使用能夠表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的方法，通過(guò)基因工程方法制備多肽，特別是胸腺素β 4，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，為今后低成本又環(huán)保地生產(chǎn)胸腺素β4奠定基礎(chǔ)。
`[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種表達(dá)胸腺素β4的基因工程菌的制備方法，其中，所述的制備方法包含:步驟1，合成能夠在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)的胸腺素β4(Τβ 4)基因序列；步驟2，將步驟I所得的基因重組進(jìn)經(jīng)蝦堿性磷酸酶I (Sap I)酶切的pTWIN I質(zhì)粒載體，得到pTWIN-T β 4融合載體；步驟3，以步驟2所得的pTWIN_T β 4為模板，PCR擴(kuò)增該載體上的內(nèi)含肽序列以及T β 4序列；步驟4，將步驟3所得的基因序列重組進(jìn)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nco 1、Xho I酶切的質(zhì)粒pET-28a中，得到ρΕΤ_Τ β 4表達(dá)載體；步驟5，將步驟4所得的ρΕΤ-Τ β 4轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞BL21中，得到ρΕΤ_Τ β 4工程菌；步驟6，在ρΕΤ-Τ β 4工程菌菌液的0D_值為0.4-0.6時(shí)，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)Τβ 4表達(dá)。
[0007]本發(fā)明還提供了一種上述方法制備的表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的應(yīng)用方法，其中，所述的應(yīng)用方法包含以下步驟:步驟a，將制得的表達(dá)T β 4的基因工程菌的菌液進(jìn)行離心，收集菌體并經(jīng)超聲波破碎，再離心收集上清；步驟b，將所得的上清過(guò)鎳柱純化，得到T β 4-內(nèi)含肽的融合蛋白；步驟C，將純化后的T β 4-內(nèi)含肽進(jìn)行誘導(dǎo)切割，使其釋放T β 4，再通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)鑒定分子量。
[0008]本發(fā)明提供的表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的制備及應(yīng)用方法具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、成本低而且環(huán)保。由于胸腺素β 4有43個(gè)氨基酸，用固相合成成本會(huì)比較高，而且環(huán)境污染嚴(yán)重。而大腸桿菌表達(dá)，氨基酸數(shù)量越多，根據(jù)化學(xué)計(jì)量法，質(zhì)量也越大，產(chǎn)量就會(huì)越高，根據(jù)我們生產(chǎn)胸腺素α I的成本核算，發(fā)酵法生產(chǎn)胸腺素β 4的成本比化學(xué)合成的低。
[0009]2、純化工藝簡(jiǎn)單，只需一步親和純化，就可得到高純度產(chǎn)物。
[0010]3、真正實(shí)現(xiàn)大腸桿菌表達(dá)N端乙?；男叵偎卅?4。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為pTWIN-T β 4工程菌菌落PCR鑒定結(jié)果示意圖。
[0012]圖2為ρΕΤ-Τ β 4工程菌菌落PCR鑒定結(jié)果示意圖。
[0013]圖3為SDS-PAGE鑒定結(jié)果示意圖。
[0014]圖4為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步地說(shuō)明。
[0016]本發(fā)明提供的表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的制備方法，包含以下步驟:步驟1，合成能夠在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)的胸腺素β4 (Τβ4)基因序列；步驟2，將步驟I所得的基因重組進(jìn)經(jīng)蝦堿性磷酸酶I (Sap I)酶切的pTWIN I質(zhì)粒載體，得到pTWIN-T β 4融合載體；步驟3，以步驟2所得的pTWIN-T β 4`為模板，PCR擴(kuò)增該載體上的內(nèi)含肽序列以及T β 4序列；步驟4，將步驟3所得的基因序列重組進(jìn)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nco 1、Xho I酶切的質(zhì)粒pET-28a中，得到ρΕΤ-Τ β 4表達(dá)載體；步驟5，將步驟4所得的ρΕΤ_Τ β 4轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞BL21中，得到ρΕΤ-Τ β 4工程菌；步驟6，在ρΕΤ_Τ β 4工程菌菌液的0D_值為
0.4-0.6時(shí)，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)T β 4表達(dá)。
[0017]本發(fā)明還提供了該表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的應(yīng)用方法，包含以下步驟:步驟a，將制得的表達(dá)T β 4的基因工程菌的菌液進(jìn)行離心，收集菌體并經(jīng)超聲波破碎，再離心收集上清；步驟b，將所得的上清過(guò)鎳柱純化，得到T β 4-內(nèi)含肽的融合蛋白；步驟C，將純化后的T β 4-內(nèi)含肽進(jìn)行誘導(dǎo)切割，使其釋放T β 4，再通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定分子量。
[0018]實(shí)施例一:
1、胸腺素β 4基因的獲得。
[0019]根據(jù)NCBI (ΝΜ_021109.3 )公布的序列及大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，設(shè)計(jì)能在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)的胸腺素β 4基因序列，由基因合成公司合成以下兩條單鏈。
[0020]單鏈1:
TCTGACAAACCCGATATGGCTGAGATCGAGAAATTCGATAAGTCGAAACTGAAGAAGACAGAGACGCAAGAGA
AAAATCCACTGCCTTCCAAAGAAACGATTGAACAGGAGAAGCAAGCAGGCGAATCG。
[0021]單鏈2:
CGATTCGCCTGCTTGCTTCTCCTGTTCAATCGTTTCTTTGGAAGGCAGTGGATTTTTCTCTTGCGTCTCTGTC
TTCTTCAGTTTCGACTTATCGAATTTCTCGATCTCAGCCATATCGGGTTTGTCAGAo[0022]合成后的兩條單鏈55°C退火30min，得到胸腺素β 4的全基因。
[0023]2、融合載體pTWIN-T β 4的構(gòu)建。
[0024]將pTWIN I質(zhì)粒用Sap I酶切，割膠回收。按如下體系將T β 4基因與pTWIN I質(zhì)粒連接，16°C連接過(guò)夜。連接體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的制備方法，其特征在于，該制備方法包含: 步驟1，合成能夠在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)的胸腺素β 4基因序列； 步驟2，將步驟I所得的基因重組進(jìn)經(jīng)蝦堿性磷酸酶I酶切的pTWIN I質(zhì)粒載體，得到pTWIN-胸腺素β 4融合載體； 步驟3，以步驟2所得的pTWIN-胸腺素β 4為模板，PCR擴(kuò)增該載體上的內(nèi)含肽序列以及胸腺素β 4序列； 步驟4，將步驟3所得的基因序列重組進(jìn)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nco 1.Xho I酶切的質(zhì)粒pET-28a中，得到pET-胸腺素β 4表達(dá)載體； 步驟5，將步驟4所得的pET-胸腺素β 4轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞BL21中，得到PET-胸腺素β 4工程菌； 步驟6，在pET-胸腺素β 4工程菌菌液的0D_值為0.4-0.6時(shí)，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)胸腺素β4表達(dá)。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備的表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的使用方法包含以下步驟: 步驟a，將制得的表達(dá)胸腺素β 4的基因工程菌的菌液進(jìn)行離心，收集菌體并經(jīng)超聲波破碎，再離心收集上 清； 步驟b，將所得的上清過(guò)鎳柱純化，得到胸腺素β4-內(nèi)含肽的融合蛋白； 步驟c，將純化后的胸腺素β 4-內(nèi)含肽進(jìn)行誘導(dǎo)切割，使其釋放胸腺素β 4，再通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定分子量。
【文檔編號(hào)】C07K14/575GK103614406SQ201310657618
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】李敏, 陳福鼎 申請(qǐng)人:上海育臣生物工程技術(shù)有限公司