一種提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法及應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

為了應(yīng)對日益嚴(yán)重的能源危機，作為生物燃料的乙醇成為替代石油燃料的選擇之一。由于異養(yǎng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)生乙醇需要糧食農(nóng)作物作為燃料，乙醇需求的增加會加劇糧食短缺問題。而利用可以進行光合作用的藍藻作為生物反應(yīng)器將CO₂轉(zhuǎn)化成乙醇，是解決此問題的重要方案之一。集胞藻PCC6803易于進行轉(zhuǎn)基因操作，是進行該研究良好的基因工程菌。例如將Zymomonas mobilis中的丙酮酸脫羧酶(pdc)基因和乙醇脫氫酶II(adh)基因?qū)爰錚CC6803中，并以psbAII啟動子驅(qū)動這兩個基因表達，可以使集胞藻PCC6803產(chǎn)生低濃度的乙醇。

但是目前轉(zhuǎn)基因集胞藻PCC6803產(chǎn)生的乙醇含量還不能滿足乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的要求，其中的一個關(guān)鍵因素就是集胞藻PCC6803對乙醇的耐受能力差。在含有1.5％(v/v)乙醇的培養(yǎng)基中，集胞藻PCC6803細胞會發(fā)生聚集，生長速率降低50％以上。因此，研究提高集胞藻PCC6803耐受乙醇能力的方法對于利用光合作用工業(yè)化生產(chǎn)乙醇具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法。應(yīng)用該方法得到了對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，該藻株可用于構(gòu)建生產(chǎn)燃料乙醇的基因工程菌。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法，包括如下步驟：

(1)以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到sll0687基因上游序列sigI-up，如序列表中SEQ ID NO：7所示；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到sll0687基因下游序列sigI-down，如SEQ ID NO：8所示；以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6為上、下游引物，以pET-30b質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增得到包含卡那霉素基因及其上下游部分序列Km^r，如SEQ ID NO：9所示；

(2)以限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI處理pUC118載體和步驟(1)得到的sigI-up片段，將sigI-up插入到pUC118上得到pUC118-up質(zhì)粒；以限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII處理pUC118-up和步驟(1)得到的sigI-down片段，將sigI-down插入到pUC118-up上得到pUC118-up-down質(zhì)粒；以限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI處理pUC118-up-down和步驟(1)得到的Km^r片段，將Km^r插入到pUC118-up-down上得到pUC118-up-down-Km^r同源雙交換質(zhì)粒；

(3)將pUC118-up-down-Km^r質(zhì)粒以自然轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入集胞藻PCC6803中，得到的轉(zhuǎn)化子以不同濃度的卡那霉素進行篩選，并在DNA水平上進行鑒定，最終得到sll0687基因完全敲除的單克隆藻株，即對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名為IK2。

一種對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，通過上述方法得到。

通過上述方法構(gòu)建的集胞藻PCC6803藻株IK2對乙醇的耐受能力顯著提高，其在含1.5％(v/v)乙醇的BG11培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型藻株。

所述的對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株可用于構(gòu)建生產(chǎn)燃料乙醇的基因工程菌。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：

本發(fā)明的方法是通過同源重組將集胞藻PCC6803中的sll0687基因進行敲除，應(yīng)用此方法得到的集胞藻PCC6803藻株IK2對乙醇的耐受能力顯著提高。在1.5％(v/v)的乙醇脅迫下，該藻株的生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型藻株。本發(fā)明得到的乙醇耐受性藻株對構(gòu)建生產(chǎn)燃料乙醇的基因工程菌具有重要的理論和實際意義，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是pUC118-up-down-Km^r質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3為引物對IK2藻株進行PCR鑒定的瓊脂糖電泳圖；圖中泳道1是以野生型基因組為模板，泳道2是以IK2基因組為模板，M為marker，箭頭指向的位置為2042bp。

圖3是集胞藻PCC6803野生型WT和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下 的生長曲線圖，圖中E代表乙醇。

圖4是集胞藻PCC6803野生型WT和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下的藻液的顏色，圖中藻為生長曲線中第4天的狀態(tài)。

圖5是集胞藻PCC6803野生型WT和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸收圖；A圖為野生型，B圖為IK2和野生型WT乙醇脅迫下全細胞吸收圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

本發(fā)明實施例中使用的集胞藻PCC6803野生型藻株從ATCC27184中分離純化得到，ATCC是美國菌種保藏中心的簡稱，27184是菌株編號。質(zhì)粒pUC118購自Takara公司，pET-30b購自Novagen公司。

實施例1

同源重組雙交換質(zhì)粒pUC118-up-down-Km^r的構(gòu)建：

(1)插入片段的擴增：

以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到sll0687基因上游序列sigI-up，如序列表中SEQ ID NO：7所示；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4為上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因組為模板，通過PCR擴增得到sll0687基因下游序列sigI-down，如SEQ ID NO：8所示；以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6為上、下游引物，以pET-30b質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增得到包含卡那霉素基因及其上下游部分序列Km^r，如SEQ ID NO：9所示。本發(fā)明中集胞藻PCC6803的基因組提取采用植物基因組DNA快速提取試劑盒(廣州東勝生物科技有限公司，貨號N1191)，質(zhì)粒提取采用高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒(廣州東勝生物科技有限公司，貨號N1011)。

PCR反應(yīng)采用20μL體系：模板1μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2μL，dNTP Mixture(各2.5mM)1.6μL，上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，rTaq酶0.2μL，ddH₂O 13.2μL。向PCR管中加入各反應(yīng)組分，短暫離心后，置于PCR儀上進行擴增反應(yīng)。擴增程序為：預(yù)變性，94℃，3min；變性，98℃，10s；退火，溫度一般比引物Tm值低5～10℃，時間為15s；延伸， 72℃，每擴增1kb DNA需1min；循環(huán)，變性-退火-延伸的循環(huán)38個；72℃，5min；16℃，10min。

PCR產(chǎn)物大小經(jīng)瓊脂糖電泳驗證，與理論長度一致。在進行后續(xù)實驗前，各PCR產(chǎn)物還需膠回收純化。

(2)插入片段與質(zhì)粒的酶切連接

以限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI對步驟(1)得到的sigI-up片段和pUC118載體進行雙酶切。插入片段的雙酶切采用30μL體系：DNA 10μL，10×Buffer 3μL，兩種快速酶切酶各1μL，ddH₂O 15μL。質(zhì)粒的雙酶切采用20μL體系：DNA10μL，10×Buffer 2μL，兩種快速酶切酶各1μL，ddH₂O 6μL。酶切反應(yīng)溫度為37℃，時間為1h。反應(yīng)結(jié)束后，80℃溫浴5min，滅活酶。酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，以T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)采用20μL體系：插入片段DNA 12μL，質(zhì)粒DNA 5μL，10×Buffer 2μL，酶1μL。連接反應(yīng)溫度為16℃，反應(yīng)8h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。對長出的轉(zhuǎn)化子進行鑒定是否連接成功，連接成功的質(zhì)粒經(jīng)Sanger測序確認，從而得到質(zhì)粒pUC118-up。以相同的酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)條件，將sigI-down片段和pUC118-up質(zhì)粒連接，酶切位點為BamHI和HindIII。對連接成功的質(zhì)粒進行驗證，從而得到pUC118-up-down質(zhì)粒。最后，將Km^r片段和pUC118-up-down質(zhì)粒連接，酶切位點為BamHI和KpnI，最終得到同源重組雙交換質(zhì)粒pUC118-up-down-Km^r。

得到同源重組雙交換質(zhì)粒pUC118-up-down-Km^r中sigI-up、sigI-down和Km^r的連接順序如圖1所示。

實施例2

對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株的獲得：

(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

將pUC118-up-down-Km^r質(zhì)粒用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后，裝入2mL無菌離心管中。向其中加入一定量BG11培養(yǎng)基(已加入HEPES緩沖液)，使質(zhì)粒終濃度約為10ng/μL。取30mL處于對數(shù)期的野生型PCC6803，6000rpm離心7min，去上清。用20mL新鮮BG11培養(yǎng)基重懸藻泥，6000rpm離心7min，去上清。用含質(zhì)粒的培養(yǎng)基把藻泥重懸。將重懸的藻液在29℃，150rpm，1400Lux連續(xù)光照培養(yǎng)6h。將藻液涂于鋪有混合纖維濾膜的固體培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)1天(正置培養(yǎng))后，將膜轉(zhuǎn)移至含有10μg/mL卡那霉素的固體培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)數(shù)天至膜表面長出單藻落。最后，將長出的藻落轉(zhuǎn)移至含有相同濃度卡那 霉素的20mL BG11小瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待長至對數(shù)期后轉(zhuǎn)接。

(2)藻株篩選

將(1)中得到的藻液進行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為29℃，150rpm，1400Lux連續(xù)光照。轉(zhuǎn)接時，將BG11培養(yǎng)基中抗生素濃度提高到20μg/mL。待長至對數(shù)期再進行轉(zhuǎn)接，以后每次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基中抗生素的濃度提高10μg/mL。當(dāng)培養(yǎng)基中的抗生素濃度達到50μg/mL時，將藻液平板劃線。待平板上長出單藻落后，挑取單藻落至含有相應(yīng)抗生素濃度的BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)藻長至對數(shù)期后，提取該藻的基因組。以此基因組為模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3為引物進行PCR，同時以野生型基因組作為對照。本發(fā)明中PCR反應(yīng)體系和程序與實施例1中相同。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，鑒定該藻基因組中的sll0687基因是否完全被Km^r替換掉。以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3為引物，在野生型中擴增得到的片段是sll0687基因及其上下游序列，長度為2042bp；在目標(biāo)藻株中，擴增得到的片段是Km^r基因及sll0687基因的上下游序列，長度為3059bp。若完全替換，藻株篩選完成。否則，繼續(xù)提高抗生素濃度進行篩選鑒定。篩選得到的sll0687基因完全被Km^r替換掉的藻株即為對乙醇耐受性顯著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名為IK2。

圖2是以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3為引物對IK2藻株進行PCR鑒定的瓊脂糖電泳圖，圖中泳道1是以野生型基因組為模板，泳道2是以IK2基因組為模板。從圖中可以看出，野生型的片段在2000bp左右，與理論計算的2042bp長度接近；IK2的擴增片段長度比野生型的大，位置與理論計算的3059bp的位置接近，同時在2042bp處沒有條帶。除此之外，野生型和IK2的PCR產(chǎn)物的序列均已Sanger測序驗證，與理論一致。這說明，IK2中的sll0687基因已被Km^r替換掉。

本發(fā)明中所用BG11培養(yǎng)基配方：1L培養(yǎng)基中含有NaNO₃ 1.5g，K₂HPO₄0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.075g，EDTA 0.001g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，檸檬酸0.006g，檸檬酸鐵銨0.006g，Na₂CO₃ 0.02g，H₃BO₃ 0.00286g，MnCl₂·4H₂O 0.00181g，ZnSO₄·7H₂O 0.000222g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.00039g，CuSO₄·5H₂O 0.000079g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0000494g。使用時，每50mL培養(yǎng)基中加入1mL 1mol/L的HEPES緩沖液(pH＝7.5)。配制固體培養(yǎng)基時，再加入2％的瓊脂。

實施例3

IK2藻株在乙醇脅迫下的生長狀態(tài)分析：

測定集胞藻PCC6803野生型和實施例2中得到的IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下的生長曲線：將生長至對數(shù)期的藻作為種子液，接種至含有50mL BG11培養(yǎng)基中，每瓶藻的起始OD₇₃₀＝0.1。連續(xù)培養(yǎng)4天，每天取樣測OD₇₃₀值，繪制生長曲線。培養(yǎng)條件為29℃，150rpm，1400Lux連續(xù)光照。開始培養(yǎng)時，在野生型和IK2實驗組的培養(yǎng)基中加入乙醇至終濃度為1.5％(v/v)。實驗組和對照組各三個平行。

集胞藻PCC6803野生型和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸收光譜測定：取2mL生長曲線測定中培養(yǎng)至第4天的藻液，用UV-2300紫外分光光度計進行波長掃描，掃描范圍為400～800nm，掃描速度為400nm/min。測量前，先用BG11培養(yǎng)基進行基線校正。以波長為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)作圖繪制全細胞吸收光譜圖。各樣品的全細胞吸收光譜圖以730nm處的OD值進行歸一化處理。

圖3為集胞藻PCC6803野生型和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下的生長曲線圖，圖中WT代表野生型，E代表乙醇。從圖中可以看出，在乙醇脅迫下IK2的生長曲線明顯高于野生型。

圖4為集胞藻PCC6803野生型和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下的藻液的顏色，圖中藻為生長曲線中第4天的狀態(tài)。從圖中可以看出，乙醇脅迫的野生型顏色與正常培養(yǎng)的野生型顏色差別較大，乙醇脅迫的野生型的藻的顏色發(fā)黃，顏色淡。而乙醇脅迫的IK2的藻顏色與沒有乙醇處理的IK2藻的顏色接近，無明顯差別。

圖5為集胞藻PCC6803野生型和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇脅迫下的全細胞吸收圖，A圖為野生型，B圖為IK2，B圖中的點狀虛線為乙醇脅迫下的野生型。從A圖中可以看出，在乙醇脅迫下，野生型的葉綠素峰和藻藍蛋白峰顯著降低。在B圖中，乙醇脅迫的IK2的葉綠素峰和藻藍蛋白峰與正常藻相比也有所降低，但比乙醇脅迫的野生型的峰高，說明乙醇對IK2光合作用的影響比野生型小。

綜合圖3、圖4和圖5的數(shù)據(jù)可以說明，IK2對乙醇脅迫的耐受性明顯優(yōu)于野生型。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。