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一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法

文檔序號:531437閱讀:674來源:國知局
專利名稱:一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及微生物含量測定的方法,具體涉及一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法。
背景技術(shù)
芽孢桿菌制劑是一種無毒副作用、無藥物殘留的綠色產(chǎn)品,其產(chǎn)品中含有的活菌是以內(nèi)生孢子的形式存在,是畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的飼料添加劑和水質(zhì)改良劑。然而,缺少質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是芽孢桿菌制劑在開發(fā)研制中存在的主要問題之一,而導(dǎo)致質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏的最大的問題之一就是活菌數(shù)與標(biāo)簽不符,有些甚至難以檢測到活菌。因此,穩(wěn)定可靠的芽孢桿菌制劑的計(jì)數(shù)方法無疑對芽孢桿菌制劑正常生產(chǎn)及其質(zhì)量控制具有重要的意義。目前,顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法等芽孢桿菌制劑的傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法由于存在一些缺陷,使計(jì)數(shù)結(jié)果不穩(wěn)定。例如,顯微鏡直接計(jì)數(shù)法無法區(qū)分死菌體和活菌體,計(jì)數(shù)結(jié)果是死菌體和活菌體的總和;平板菌落計(jì)數(shù)法操作繁雜,而且計(jì)數(shù)結(jié)果易受多種因素的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法。本發(fā)明提供的一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法,包括如下步驟1)樣品的制備無菌操作隨機(jī)稱取復(fù)合芽孢桿菌粉lg,加入盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中,于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成1 10的稀釋母液,設(shè)3個(gè)平行樣;2)樣品的稀釋取3個(gè)平行樣,分別進(jìn)行如下處理無菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10的稀釋母液,加入盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中,混勻成 1 IO2的稀釋液,這樣依次稀釋,分別得到1 103、1 IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13稀釋度的稀釋液,每次稀釋時(shí)必須更換ImL玻璃移液管;3)培養(yǎng)將 1 10 的稀釋母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U 106、 1 IO7U IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 的稀釋液置于轉(zhuǎn)速為 200r/ min、溫度為35 37°C的溫控?fù)u床中,培養(yǎng)18_24h ;以盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照;4)測定以盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照,無菌操作用ImL 玻璃移液管吸取0. ImL培養(yǎng)18-24h變渾濁的各稀釋液采用khaeffer-Fulton氏染色法進(jìn)行芽孢染色,顯微鏡觀察有無綠色的芽孢;顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對應(yīng)的稀釋度的倒數(shù)即為復(fù)合芽孢桿菌粉的活菌含量(cfu/g)。本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確,直接觀察測定出復(fù)合芽孢桿菌粉的活菌含量。其原理是將待測樣品經(jīng)過適當(dāng)稀釋之后,其中的芽孢桿菌充分分散成單個(gè)細(xì)胞,然后在無菌營養(yǎng)肉湯中通過孵育培養(yǎng)而生長繁殖,從而形成肉眼可見的渾濁液,再進(jìn)一步通過芽孢染色確定最大稀釋度渾濁液中含有大量的芽孢,最后確定待測樣品的活菌總數(shù)。它與顯微鏡直接計(jì)數(shù)法相比因能夠區(qū)分死菌體和活菌體而使活菌總數(shù)的測定結(jié)果更準(zhǔn)確,與平板菌落計(jì)數(shù)法相比,操作更簡單,更簡易快速,更適合無很強(qiáng)專業(yè)技能的廣大芽孢桿菌制劑生產(chǎn)從業(yè)者采用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料復(fù)合芽孢桿菌粉BCM,通過平板計(jì)數(shù)法測定的活菌含量為SXlO^cfu/g,購于山西省衛(wèi)氏魚康實(shí)業(yè)有限公司;ImL玻璃移液管、無菌玻璃涂布棒、營養(yǎng)瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯、 50mL具塞離心管、載玻片、5%孔雀石綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ImL玻璃移液管、盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管,于121°C條件下滅菌20min;生化培養(yǎng)箱,購于日本三洋公司;漩渦振蕩儀,購于上海淇特分析儀器有限公司; 溫控?fù)u床,購于美國i^orma kientific公司。1.2樣品的制備無菌操作隨機(jī)稱取復(fù)合芽孢桿菌粉BCM 1 g,加入盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中,于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成樣品,即1 10的稀釋母液。實(shí)驗(yàn)共有3個(gè)平行樣。1.3樣品的稀釋取3個(gè)平行樣,分別進(jìn)行如下處理無菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10 的稀釋母液,加入盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中,混勻成1 IO2的稀釋液,這樣依次稀釋,分別得到 1 IO3U IO4U IO5U IO6U IO7U IO8U 109、 1 IO10U IO11U IO12U IO13等稀釋度的稀釋液,每次稀釋時(shí)必須更換ImL玻璃移液管。1.4 培養(yǎng)將1 10 的稀釋母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 等的稀釋液置于轉(zhuǎn)速為 200r/min、 溫度為35 37°C的溫控?fù)u床中,培養(yǎng)18 Mh。以盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照。1. 5 測定以盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照,無菌操作用ImL玻璃移液管吸取0. ImL培養(yǎng)18 24h變渾濁的各稀釋液采用Schaeffer-Fulton氏染色法進(jìn)行芽孢染色,顯微鏡觀察有無綠色的芽孢。顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對應(yīng)的稀釋度的倒數(shù)即為復(fù)合芽孢桿菌粉BCM的活菌含量(cfu/g)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,稀釋度為1 IO11的復(fù)合芽孢桿菌粉BCM在培養(yǎng) 18 24h后渾濁,而且芽孢染色后顯微鏡下可觀察到綠色的芽孢;而稀釋度分別為1 IO12 和1 IO13的復(fù)合芽孢桿菌粉BCM在培養(yǎng)18 24h后均未渾濁,而且芽孢染色后顯微鏡下也未觀察到綠色的芽孢。因此,復(fù)合芽孢桿菌粉BCM的活菌含量為IO11 1012cfu/g,與通過平板計(jì)數(shù)法測定的活菌含量相比,數(shù)量級相同,可作為復(fù)合芽孢桿菌粉BCM活菌總數(shù)快速定量的方法。表1復(fù)合芽孢桿菌粉BCM有效活菌總數(shù)的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法,其特征在于,包括如下步驟1)樣品的制備無菌操作隨機(jī)稱取復(fù)合芽孢桿菌粉lg,加入盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的 50mL具塞離心管中,于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成1 10的稀釋母液;2)樣品的稀釋無菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL1 10的稀釋母液,加入盛有 9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中,混勻成1 IO2的稀釋液,這樣依次稀釋,分別得到 1 IO3U IO4U IO5U IO6U IO7U IO8U IO9U IO10U IO11U 1012、 1 IO13稀釋度的稀釋液;3)培養(yǎng)將1 10 的稀釋母液以及 1 IO2U IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 的稀釋液置于轉(zhuǎn)速為 200r/min、溫度為35 37°C的溫控?fù)u床中,培養(yǎng)18-24h ;以盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照;4)測定以盛有9mL無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照,用ImL玻璃移液管無菌操作吸取0. ImL培養(yǎng)18-24h變渾濁的各稀釋液采用khaeffer-Fulton氏染色法進(jìn)行芽孢染色,顯微鏡觀察有無綠色的芽孢;顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對應(yīng)的稀釋度的倒數(shù)即為復(fù)合芽孢桿菌粉的活菌含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法,是將待測樣品經(jīng)過適當(dāng)稀釋之后,其中的芽孢桿菌充分分散成單個(gè)細(xì)胞,然后在無菌營養(yǎng)肉湯中通過孵育培養(yǎng)而生長繁殖,從而形成肉眼可見的渾濁液,再進(jìn)一步通過芽孢染色確定最大稀釋度渾濁液中含有大量的芽孢,最后確定待測樣品的活菌總數(shù)。本發(fā)明與顯微鏡直接計(jì)數(shù)法相比因能夠區(qū)分死菌體和活菌體而使活菌總數(shù)的測定結(jié)果更準(zhǔn)確,與平板菌落計(jì)數(shù)法相比,操作更簡單,更簡易快速,很適合廣大芽孢桿菌制劑生產(chǎn)從業(yè)者采用。
文檔編號C12Q1/06GK102392070SQ201110347608
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者何珊, 衛(wèi)若鵬, 曹海鵬 申請人:山西衛(wèi)氏魚康實(shí)業(yè)有限公司, 山西省生物獸藥飼料工程技術(shù)研究中心(有限公司)
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