一株解淀粉芽胞桿菌植物亞種及其在馬尾藻生物降解中的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了一種解淀粉芽胞桿菌植物亞種HB12274及其在馬尾藻生物降解中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

馬尾藻是一類常見的大型褐藻，屬于褐藻門(Phaephyta)、馬尾藻科(Sargassaceae)、馬尾藻屬(Sargassum)，大多數(shù)為暖水性種類，廣泛分布于暖水和溫水海域。馬尾藻具有很高的經(jīng)濟價值，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)等方面都極具開發(fā)潛力，是重要的肥料、飼料和工業(yè)原料。馬尾藻細(xì)胞壁主要由纖維素和褐藻膠構(gòu)成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，較難被破壞。降解馬尾藻細(xì)胞壁中的纖維素和褐藻膠是高效降解并利用馬尾藻的關(guān)鍵。工業(yè)上常采用機械粉碎和化學(xué)降解法對馬尾藻進行降解，但存在著耗能高和廢棄物污染環(huán)境等缺點。生物降解法是利用微生物所產(chǎn)生的纖維素酶和褐藻膠裂解酶來降解藻體中的纖維素和褐藻膠，從而達到降解藻體的目的，因其高效環(huán)保而備受關(guān)注。

芽胞桿菌是一類需氧或兼性厭氧細(xì)菌，能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子，是常用微生態(tài)制劑之一。芽胞桿菌能產(chǎn)生多種胞外酶，如褐藻膠裂解酶、纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，可分解褐藻膠、纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉等多種有機物，從而得到廣泛應(yīng)用。本發(fā)明采用的解淀粉芽胞桿菌植物亞種HB12274，分離自海南省東寨港紅樹林底泥，具有高效降解褐藻膠、淀粉和纖維素活性，能有效降解馬尾藻藻體，在馬尾藻加工利用方面具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有降解褐藻膠、纖維素和淀粉的解淀粉芽胞桿菌植物亞種，該菌株能夠有效降解褐藻膠、纖維素和淀粉，可以作為一種新的用于馬尾藻生物降解的微生物資源。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所提供的具有降解褐藻膠、淀粉和纖維素活性的解淀粉芽胞桿菌植物亞種HB12274，已于2016年5月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號為CGMCC No.12455。保存地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學(xué)院微生物研究所。所述芽胞桿菌HB12274屬于 細(xì)菌域、厚壁菌門、芽胞桿菌綱、芽胞桿菌目、芽胞桿菌科、芽胞桿菌屬。

本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌植物亞種HB12274獲得過程為：從海南省東寨港紅樹林采集底泥樣品，樣品經(jīng)梯度稀釋后采用80℃水浴處理20min以殺死非芽胞細(xì)菌，其后途布于細(xì)菌分離培養(yǎng)基平板。再對分離獲得的芽胞桿菌進行產(chǎn)褐藻膠裂解酶、淀粉酶與纖維素酶活力測定，最終篩選出同時具備三種酶活性的芽胞桿菌植物亞種HB12274。

所述的芽胞桿菌HB12274具有以下生物學(xué)特性：菌株在麥芽汁營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3d后，菌落呈圓形、邊緣不規(guī)則、表面無光澤、不平整、乳白色、不透明；菌體長桿狀，產(chǎn)芽胞。革蘭氏染色、VP測定、接觸酶實驗陽性，MR實驗陰性，可還原硝酸鹽，可水解淀粉、褐藻膠與纖維素，能使明膠液化。

芽胞桿菌HB12274的16S rDNA序列在GenBank的登錄號為KU529689。經(jīng)多相分類鑒定為Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum(解淀粉芽胞桿菌植物亞種)。該菌株易于生長，具有降解褐藻膠、淀粉與纖維素的能力，能有效降解馬尾藻藻體，可開發(fā)成一種新型應(yīng)用于馬尾藻生物降解的微生物菌劑。

芽胞桿菌HB12274在馬尾藻生物降解中的應(yīng)用，包括如下步驟：

(1)菌株活化：將所述的解淀粉芽孢桿菌植物亞種HB12274接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24～48h。培養(yǎng)基：蛋白胨8～10g/L，牛肉浸粉2～3g/L，瓊脂粉18～20g/L，氯化鈉5～35g/L，pH6.5～7.5。

(2)液體培養(yǎng)：將活化的菌株接入液體種子培養(yǎng)基中，于30～37℃、120～200r/min振蕩培養(yǎng)12～24h，制成種子液。培養(yǎng)基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化鈉5～35g/L，pH6.5～7.5。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按體積比2～10％接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30～37℃、150～200r/min振蕩培養(yǎng)48～96h，即制得解淀粉芽孢桿菌植物亞種HB12274的液體菌劑。培養(yǎng)基：牛肉膏1～3g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化鈉5～35g/L，pH6.5～7.5。

(4)將液體菌劑以5％～10％的接種量接種于裝有馬尾藻粉發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于30～37℃、150～200r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)10～15d。培養(yǎng)基：馬尾藻粉25～50g/L，蛋白胨5～10g/L，氯化鈉5～35g/L，pH6.5～7.5。

實驗表明，添加芽胞桿菌HB12274 CGMCC No.12455能有效降解馬尾藻藻體，培養(yǎng)10d后，固形物失重率為50.02％，液體中還原糖增量為65.6μg/mL。由此可見，本發(fā)明的芽胞桿菌HB12274 CGMCC No.12455可應(yīng)用于馬尾藻藻體生物降解。

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述菌株HB12274的形態(tài)特征照片，×1000。

圖2為本發(fā)明所述菌株HB12274的基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明：

實施例1：芽胞桿菌HB12274 CGMCC No.12455的分離

采用5點取樣法，從海南省東寨港紅樹林采集底泥樣品。取10g樣品溶于90ml無菌水中，置于37℃、200r/min的恒溫?fù)u床中振蕩30min，靜置5min后，配制成10^-2～10^-4的系列土壤懸液。采用80℃水浴處理20min的方法以殺死非芽胞細(xì)菌，吸取系列懸液0.1ml，涂布于細(xì)菌分離培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。待菌落長出時，根據(jù)菌落形狀、顏色、邊緣狀態(tài)、透明度、表面干濕狀態(tài)等表型特征，挑取單菌落劃線純化2～3次，直至獲得純培養(yǎng)。經(jīng)初步排重后，編號，保存。

實施例2 芽胞桿菌HB12274 CGMCC No.12455的種屬鑒定

(1)形態(tài)與培養(yǎng)特性

將菌株在麥芽汁營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，菌株生長迅速，菌落直徑3～5mm，圓形，邊緣不規(guī)則，表面無光澤，不平整，乳白色，不透明；菌體長桿狀，革蘭氏染色結(jié)果為陽性，產(chǎn)芽胞，一端膨大(圖1)。

(2)生理生化特征

菌株HB12274可利用葡萄糖、山梨醇、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、半乳糖、甘露醇、果糖、乳糖和阿拉伯糖。革蘭氏染色、VP測定、接觸酶實驗陽性，MR實驗陰性，可還原硝酸鹽，能使明膠液化。

(3)16S rDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過PCR擴增、測序獲得HB12274的16S rDNA序列1450bp，核苷酸序列在Genbank的登錄號為KU529689。將該序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)菌株HB12274與與Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum序列相似性最高，達到99.5％，與Bacillus siamensis和Bacillus methylotrophicus序列相似性分別為99.4％和99.3％。選擇同源性高的相關(guān)菌株在MEGA5.0中利用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，可看出，HB12274與Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum FZB42^T處于同一分支上，二者親緣關(guān)系較近。比較二者形態(tài)特征、生理生化特征，發(fā)現(xiàn)形態(tài)特征相似，生理生化特征一致。

綜合以上結(jié)果，本發(fā)明涉及的菌株HB12274(CGMCC No.12455)，被鑒定為Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum(解淀粉芽胞桿菌植物亞種)，已于2016年5月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號為CGMCC No.12455。保存地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學(xué)院微生物研究所。

實施例3：菌株HB12274 CGMCC No.12455液體菌劑的制備

(1)菌株活化：將所述的解淀粉芽胞桿菌植物亞種HB12274接種于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉3.0g，瓊脂粉18.0g，氯化鈉16.0g，1000mL，pH7.5，121℃滅菌20min。

(2)液體培養(yǎng)：將活化的菌株接入營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h，制成種子液。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按體積比3％接種于營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)72h，即制得解淀粉芽胞桿菌植物亞種HB12274的液體菌劑。

按以上步驟即制得解淀粉芽胞桿菌植物亞種HB12274的液體菌劑。

實施例4：菌株HB12274 CGMCC No.12455降解褐藻膠、纖維素、淀粉活性測定

采用透明圈法測定菌株HB12274對褐藻膠、纖維素、淀粉的降解活性，結(jié)果見表1。

產(chǎn)褐藻膠裂解酶測定：取單菌落，點接到褐藻酸鈉培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成：褐藻酸鈉5.0g，(NH₄)₂SO₄5.0g，K₂HPO₄2.0g，NaCl 16.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，pH7.5)，于37℃倒置培養(yǎng)3d后，加適量95％酒精，靜置，若菌株產(chǎn)生褐藻膠裂解酶，則菌落周圍會有水解圈，水解圈直徑/菌落直徑的比值(Hc值)反應(yīng)了褐藻膠裂解酶的相對大小。結(jié)果顯示，菌株HB12274具有較強的降解褐藻酸鈉活性，Hc值為6.25。

產(chǎn)淀粉酶測定：取單菌落，點接到淀粉水解培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成：蛋白陳10.0g，可溶性淀粉2.0g，牛肉膏5.0g，氯化鈉16.0g，瓊脂20.0g，水1000ml，pH7.0)，37℃倒置培養(yǎng)3d后，向平板中加盧戈氏碘液。由于淀粉遇碘變藍，若菌株產(chǎn)淀粉酶，則菌落周圍會顯示無色透明圈，透明圈直徑/菌落直徑的比值(Hc值)反應(yīng)了淀粉酶活性的相對大小。結(jié)果顯示，菌株HB12274具有較強的降解淀粉活性，Hc值為3.20。

產(chǎn)纖維素酶測定：取單菌落，點接到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(羧甲基纖維素鈉10.0g，NH₄NO₃1.0g，(NH₄)₂SO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 16.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000mL，自然pH)，37℃倒置培養(yǎng)3d，用1％剛果紅染色30min，用1mol/L氯化鈉脫色20min(2次)， 若菌株產(chǎn)纖維素酶，則菌落周圍會有無色透明圈，水解圈直徑/菌落直徑的比值(Hc值)反應(yīng)了纖維素酶活性的相對大小。結(jié)果顯示，菌株HB12274具有較強的降解纖維素活性，Hc值為4.80。

表1菌株HB12274的產(chǎn)酶活性及相對酶活力

實施例5：菌株HB12274 CGMCC No.12455降解馬尾藻藻體效果

芽胞桿菌HB12274 CGMCC No.12455按實施例3的方法制備。將液體菌劑以5％的接種量接種于裝有100ml馬尾藻粉發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成：馬尾藻粉50g/L，蛋白胨5g/L，氯化鈉16g/L，pH 7.5左右)的250mL錐形瓶中，于37℃、200r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)10d。

實驗表明，添加芽胞桿菌HB12274CGMCC No.12455能有效降解馬尾藻藻體，培養(yǎng)10天后，固形物失重率為50.02％，液體中還原糖增量為65.6μg/mL。

序列表

序列表(1450bp)。