專利名稱：血流感染的病原菌快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及微生物分子生物學(xué)檢測(cè)方法，具體涉及運(yùn)用高分辨率熔解曲線法對(duì)血流感染的細(xì)菌快速鑒定。
背景技術(shù)：
血流感染是一種嚴(yán)重的感染性疾病，包括敗血癥和菌血癥。發(fā)病率高、病死率高， 在美國(guó)每年有75萬人發(fā)病，其中約21. 5萬人死亡。是十大死亡原因之一，占所有死亡原因的6%。今年來由于糖尿病、腫瘤病人增多，侵入性操作的廣泛使用，激素、化療、藥物的使用選擇，及多重耐藥菌的流行，血流感染發(fā)病率逐年升高，已成為一全球性的問題。傳統(tǒng)的血流感染的診斷從標(biāo)本的采集到病原菌鑒定至少需要三天的時(shí)間。甚至需要6-7天才能拿到鑒定及藥敏的結(jié)果，而延遲診斷和干預(yù)往往導(dǎo)致嚴(yán)重的結(jié)果，如器官功能障礙和死亡。建立一種血流感染病原菌快速鑒定方法是當(dāng)前臨床迫切需要。近年已經(jīng)有多種分子診斷技術(shù)被應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定，比如新近發(fā)展起來的DNA芯片檢測(cè)技術(shù)，借助微電子芯片技術(shù)的集約化和平行處理原理，可以快速、高效地獲取或處理大量的生命信息(包括基因的識(shí)別、基因突變檢測(cè)、基因表達(dá)譜檢測(cè)和對(duì)外來分子的識(shí)別等)；也有種屬特異性(16S、16S間隔區(qū)等)核酸片段測(cè)序。但是測(cè)序、芯片技術(shù)等均需要昂貴的特殊儀器，價(jià)格高昂，不利于推廣普及。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種鑒定血流感染病原菌方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)引起血流感染常見致病細(xì)菌的快速鑒定。本發(fā)明提供了一種血流感染病原菌的鑒定方法擴(kuò)增血流感染病原菌的16S rRNA 基因的種屬保守區(qū)，運(yùn)用高分辨率熔解曲線法鑒定引起血流感染病原菌。與標(biāo)準(zhǔn)菌株的熔解曲線圖比較，鑒定細(xì)菌至種。所述的擴(kuò)增可以是采用PCR，根據(jù)血流感染病原菌的16S rRNA基因的種屬保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。所述的血流感染病原菌包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、 產(chǎn)酸克雷伯桿菌，洛菲不動(dòng)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌或者洋蔥伯克霍爾德菌。具體而言，該方法包括如下步驟對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行涂片、革蘭染色；用PCR 的方法擴(kuò)增16S基因片段；高分辨率熔解曲線分析。其中，革蘭染色是對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的細(xì)菌涂片上依次加上龍膽紫液染色、碘溶液、脫色液、沙黃溶液。本發(fā)明針對(duì)引起血流感染的最常見的16種細(xì)菌，陽(yáng)性球菌四種、陰性桿菌12 種，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。檢測(cè)陽(yáng)性球菌時(shí)，所述引物為16SAF :ATGTTGGGTTAAGTCCCG和16SAR CCGCCTTCCTCCAGTTT。檢測(cè)陰性桿菌時(shí)，所述引物為 16SBF :CAACGCGAAGAACCTTAC和 16SBR CTCACGACACGAGCTGAC。對(duì)第一次分析不能區(qū)分的菌株進(jìn)行第二次分析正向引物為16SAF ATGTTGGGTTAAGTCCCG (SEQ ID NO 1)；反向引物為 16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT (SEQ ID NO 2)。該方法可用于測(cè)定血液樣本的病原菌污染狀況。能覆蓋到95%以上的陰性桿菌和 90%以上的陽(yáng)性球菌?？梢蚤]管、一步直接鑒定至種。本發(fā)明首先對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性的培養(yǎng)瓶進(jìn)行涂片、革蘭染色，區(qū)分陰性菌與陽(yáng)性菌，然后針對(duì)陰性菌和陽(yáng)性菌選擇擴(kuò)增16S不同片段，同時(shí)高分辨率熔解曲線方法分析。本發(fā)明針對(duì)血流感染常見的病原菌，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯桿菌，洛菲不動(dòng)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌。本法能夠快速、高效的測(cè)定血流感染的常見病原菌，為后續(xù)的治療提供有力的依據(jù)，爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。
圖1是表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和金黃色葡萄球菌的熔解曲線圖(引物 16SAF,16SAR)。圖2是陰性桿菌鑒定的熔解曲線圖(引物16SBF，16SBR)。圖3是產(chǎn)酸克雷伯桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌的熔解曲線圖(引物16SAF，16SAR)。圖4是產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌的熔解曲線圖(引物16SAF， 16SAR)。圖5是粘質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌的熔解曲線圖(引物 16SAF,16SAR)。
具體實(shí)施例方式操作方法
1.對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行涂片革蘭染色①涂片經(jīng)火焰固定，加龍膽紫液染色10秒鐘，水洗，甩干。②加碘溶液染色10秒鐘，水洗，甩干。③加脫色液脫色，不時(shí)搖動(dòng)約10 — 20秒，水洗，甩干。④加沙黃溶液復(fù)染10秒，水洗。⑤以濾紙吸干或在空氣中干后，鏡檢。 革蘭陽(yáng)性的細(xì)菌染成深紫色，革蘭陰性細(xì)菌染成淺紅色。2.用PCR的方法擴(kuò)增16S基因片段。(1)陽(yáng)性球菌正向引物為 16SAF :ATGTTGGGTTAAGTCCCG (SEQ ID NO 1)；反向引物為 16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT (SEQ ID NO 2) ;16S 基因擴(kuò)增體系為，去離子水 15. 8 μ 1, IOXbuffer 2. 5 μ l,dNTP 4 μ ，引物各 1 μ LriTaq DNA 聚合酶 0. 2 μ 1 (TaKaRa), SYT09染料1 μ 1，模板1 μ 1，擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5分鐘，95°C 30秒，55°C 30秒分鐘， 72 0C 30秒分鐘，共40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸1分鐘。(2)陰性桿菌正向引物為 16SBF :CAACGCGAAGAACCTTAC (SEQ ID NO 3)；反向引物為 16SBR: CTCACGACACGAGCTGAC (SEQ ID NO 4) ;16S 基因擴(kuò)增體系為，去離子水 15. 8 μ 1, IOXbuffer 2. 5 μ l,dNTP 4 μ ，引物各 1 μ LriTaq DNA 聚合酶 0. 2 μ 1 (TaKaRa), SYT09染料1 μ 1，模板1 μ 1，擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5分鐘，95°C 30秒，55°C 30秒分鐘， 72°C30秒分鐘，共40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸1分鐘。對(duì)第一次分析不能區(qū)分的菌株進(jìn)行第二次分析正向引物為 16SAF :ATGTTGGGTTAAGTCCCG (SEQ ID NO 1)；反向引物為 16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT (SEQ ID NO 2); 16S基因擴(kuò)增體系為，去離子水 15. 8 μ 1, IOXbuffer 2.5 μ l,dNTP 4 μ ，引物各 1 μ LriTaq DNA 聚合酶 0. 2 μ 1 (iTaKafci), SYT09 染料 1 μ 1， 模板ι μ 1，擴(kuò)增條件為95°c預(yù)變性5分鐘，95°C 30秒，55°C 30秒分鐘，72°C 30秒分鐘，共 40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸1分鐘。3.高分辨率熔解曲線分析
采用Corbett熒光定量PCR儀檢測(cè)熔解曲線，條件為預(yù)溫94°C lmin, 60°C lmin，然后 70°C -85°C每0. 1°C 2秒HRM分析，然后并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
實(shí)施例一陽(yáng)性球菌的鑒定 涂片革蘭染色為陽(yáng)性球菌； 用16SBF和16SBR引物擴(kuò)增16S基因片段； 高分辨率熔解曲線分析直接鑒定至種。對(duì)20例血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，其中，7、11、16、18為陽(yáng)性球菌。高分辨率熔解曲線分析確定為2例金黃色葡萄球菌、1例表皮葡萄球菌和1例糞腸球菌感染。
實(shí)施例二陰性桿菌的鑒定 涂片革蘭染色陰性桿菌； 用16SAF和16SBF引物擴(kuò)增16S基因片段。12種細(xì)菌常見陰性桿菌可分為6組，第1組為大腸埃希菌，第2組為銅綠假單胞菌、粘質(zhì)沙雷菌、嗜麥芽窄食單胞菌，第3組為產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、陰溝腸桿菌， 第4組為產(chǎn)酸克雷伯桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌，第5組為洛菲不動(dòng)桿菌，第6組為鮑曼不動(dòng)桿菌。對(duì)30例血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，與后續(xù)傳統(tǒng)方法獲得的結(jié)果完全一致。證實(shí)本發(fā)明血流感染的病原菌快速鑒定，從血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)性，PCR擴(kuò)增，高分辨率熔解曲線分析僅需 3小時(shí)的時(shí)間，可大大縮短疾病的診斷時(shí)間，為血流感染疾病患者的救治贏得寶貴時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種血流感染病原菌的鑒定方法，其特征在于，擴(kuò)增血流感染病原菌的16S rRNA基因的種屬保守區(qū)，運(yùn)用高分辨率熔解曲線法鑒定引起血流感染病原菌。
2.如權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增是采用PCR，根據(jù)血流感染病原菌的16S rRNA基因的種屬保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。
3.如權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述的血流感染病原菌包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、 銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯桿菌，洛菲不動(dòng)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌或者洋蔥伯克霍爾德菌。
4.如權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行涂片染色；用PCR的方法擴(kuò)增16S基因片段； 高分辨率熔解曲線分析。
5.如權(quán)利要求4所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(1)中染色是對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的細(xì)菌涂片上加上龍膽紫液染色、碘溶液、脫色液、沙黃溶液。
6.如權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為16SAF ATGTTGGGTTAAGTCCCG和16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT ；所述的血流感染病原菌是陽(yáng)性球菌。
7.如權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為16SBF CAACGCGAAGAACCTTAC 和 16SBR CTCACGACACGAGCTGAC ； 16SAF ATGTTGGGTTAAGTCCCG 禾口 16SA R CCGCCTTCCTCCAGTTT ；所述的血流感染病原菌是陰性桿菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及運(yùn)用高分辨率熔解曲線法對(duì)血流感染的細(xì)菌快速鑒定。本發(fā)明首先對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性的培養(yǎng)瓶進(jìn)行涂片、革蘭染色，區(qū)分陰性菌與陽(yáng)性菌，然后針對(duì)陰性菌和陽(yáng)性菌選擇擴(kuò)增16S不同片段，同時(shí)高分辨率熔解曲線方法分析。本發(fā)明針對(duì)血流感染常見的病原菌，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯桿菌，洛菲不動(dòng)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌。本法能夠快速、高效、準(zhǔn)確的測(cè)定血流感染的常見病原菌，為后續(xù)的治療提供有力的依據(jù)，爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102453752SQ20101051994
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者李剛, 杜欣, 王艷艷, 蔣曉飛, 陳楠, 魏取好 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院, 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院