專利名稱：葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動子的分離方法及在抗病育種中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩個來源于葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動子的分離方法，重組表達(dá)載體構(gòu)建 及在轉(zhuǎn)基因葡萄中的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
啟動子是調(diào)控基因表達(dá)過程中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的重要DNA序列，它與轉(zhuǎn)錄因子一起 決定下游基因表達(dá)的時間、類型、水平和組織器官特異性等?；蚬こ讨邪雌渥饔梅绞郊肮?能，啟動子通常被分為三類組織特異型啟動子、組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組織特異性啟動子，這類啟動子僅在特定器官或組織中啟動轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在定向 改變組織器官性狀的研究中，本類啟動子應(yīng)用比組成型啟動子更有效。組成型啟動子，這類啟動子能在所有組織細(xì)胞、任何時空啟動基因表達(dá)。組成型啟 動子盡管能夠不受時空及環(huán)境影響啟動外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中高效表達(dá)，Kohli等在《植 物雜志》1999年17 =591-601 “轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化質(zhì)粒重組的分子鑒定揭示煙草花葉病毒35S 啟動子中熱點(diǎn)重組”中報道，正常環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)組成型表達(dá)抗逆蛋白不僅是一種能量浪費(fèi)， 還會導(dǎo)致植物的正常代謝受阻，致轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育異常或造成其它負(fù)面影響。由于它的強(qiáng) 轉(zhuǎn)錄活性，能夠組成型高效啟動外源轉(zhuǎn)基因表達(dá)，目前基因工程中廣泛應(yīng)用的煙草花葉病 毒35S啟動子仍占總數(shù)的80%。誘導(dǎo)型啟動子，誘導(dǎo)型啟動子平時不啟動基因表達(dá)或啟動強(qiáng)度很低。在一定誘因 下，啟動活性增強(qiáng)。Behnam等在《植物細(xì)胞報告》2007年沈1275-1282 “擬南芥rd29A啟 動子整合DREBlA基因提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯抗冷性”中報道，rd29A誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動擬南芥 DRREBl在馬鈴薯中表達(dá)后，攝氏4度條件下，前半小時轉(zhuǎn)基因馬鈴薯與野生型DREBl的表達(dá) 都未檢測到，半小時后，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中DREBl開始表達(dá)，而野生型依然沒有檢測到，rd29A 通過在低溫條件下啟動DREBl表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的抗寒性。其它干旱、鹽堿、極端溫度 等脅迫誘導(dǎo)型啟動子近兩年也開始被逐漸重視并用于植物抗逆基因工程。歐洲葡萄以其優(yōu)良品質(zhì)成為生產(chǎn)中的主載種，然而其本身并沒有顯著抗病性。傳 統(tǒng)育種通過對雜交后代表現(xiàn)型進(jìn)行篩選相當(dāng)耗財費(fèi)時，基因工程技術(shù)已成為加快定向培 育抗病葡萄品種的新趨勢。病程相關(guān)蛋白基因是一類能有效提高葡萄抗病性的基因，被 廣泛應(yīng)用于葡萄抗病基因工程育種中。然而，F(xiàn)erreira等在《生物技術(shù)趨勢》2004年22 168-173 “不改變葡萄酒品質(zhì)的情況下提高轉(zhuǎn)基因葡萄抗病性”中指出，葡萄果實(shí)過多積累 病程相關(guān)蛋白導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)嚴(yán)重下降，因此組成型啟動子啟動病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)的 轉(zhuǎn)基因葡萄果實(shí)可能將導(dǎo)致酒品質(zhì)下降。截止到目前，還沒有鑒定分離出有效的葡萄病原 菌誘導(dǎo)型啟動子并應(yīng)用于基因工程研究。因此，獲得葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動子對于葡萄抗 病基因工程建立一個高效、實(shí)用的表達(dá)系統(tǒng)是非常重要的。
發(fā)明內(nèi)容
為克服組成型啟動子給轉(zhuǎn)基因抗病葡萄帶來的負(fù)面影響，并避免染色體步移等方 法克隆啟動子的繁瑣，本發(fā)明公開了一種啟動子快速克隆法，以克隆獲得兩個葡萄病原菌 誘導(dǎo)型啟動子(GenBank登陸號分別為⑶565705及HQ174899)構(gòu)建啟動子報告基因融 合載體，兩個啟動子啟動報告基因在葡萄葉片中的表達(dá)受白粉菌誘導(dǎo)，為葡萄抗病基因工 程提供病原菌誘導(dǎo)型啟動子的克隆方法并成功應(yīng)用于葡萄抗病育種中。本發(fā)明是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的中國野生華東葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’葡萄抗病轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl 和VpWRKY2為白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)型基因，其啟動子具有受病原菌誘導(dǎo)啟動基因上調(diào)表達(dá)的活 性，采用GenBank葡萄基因組序列及白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2 序列設(shè)計引物，從中國野生華東葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’基因組DNA中進(jìn)行啟動子 片段的克隆，獲得了病原菌誘導(dǎo)型啟動子PvpWRKYl全長序列694bp與病原菌誘導(dǎo)型啟動子 PvpffRKY2全長序列643bp，通過構(gòu)建重組表達(dá)載體PvpWRKYl GUS和PvpWRKY2 ⑶S，并用 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法導(dǎo)入葡萄葉片，瞬時表達(dá)所克隆啟動子啟動的GUS報告基因，通 過對接種葡萄白粉菌前后瞬時表達(dá)葉片的GUS染色觀察，及對接種葡萄白粉菌前后瞬時表 達(dá)葉片的GUS活性定量檢測，驗(yàn)證了 PvpWRKYl和PvpWRKY2受葡萄白粉菌誘導(dǎo)啟動報告基 因活性上調(diào)。本發(fā)明克隆的誘導(dǎo)型啟動子是以GenBank數(shù)據(jù)庫與轉(zhuǎn)錄因子基因序列為基礎(chǔ)設(shè) 計引物直接克隆所得，避免了染色體步移等方法克隆啟動子的繁瑣，具有簡便、快速等特 點(diǎn)，此方法也完全適用于克隆其它啟動子。⑶S且未 接種白粉菌的葉片淺度著色，接種后葉片染色程度加深，陰性對照葉片接種前后均未著色， 陽性對照即轉(zhuǎn)化35: :GUS載體的葉片深度著色，而轉(zhuǎn)化無啟動子的GUS載體葉片染色后僅 微弱變藍(lán)。接種白粉菌前后轉(zhuǎn)化葉片的GUS活性定量檢測結(jié)果表明PvpWRKYl和PvpWRKY2 啟動的GUS本底活性相對較弱，但兩啟動子活性受白粉菌誘導(dǎo)后上升，PvpffRKYl啟動的GUS 在接種白粉菌后的活性是接種前3. 21倍，而PvpWRKY2啟動的GUS在接種白粉菌后的活性 是接種前1. 63倍，即本發(fā)明克隆的兩個誘導(dǎo)型啟動子均能在病原菌侵染時以精準(zhǔn)方式調(diào) 控轉(zhuǎn)入外源基因，使轉(zhuǎn)入基因僅在受病原菌誘導(dǎo)的條件下被啟動表達(dá)。在葡萄抗病育種中， 僅需把重組載體中啟動子所啟動的報告基因換成任何感興趣的抗病基因，即可轉(zhuǎn)化葡萄獲 得病原菌誘導(dǎo)表達(dá)外源抗病基因的轉(zhuǎn)化植株，從而減少抗病基因工程育種中組成型啟動子 對轉(zhuǎn)基因葡萄造成的負(fù)面影響，最大限度發(fā)揮轉(zhuǎn)基因優(yōu)勢。
附圖1為本發(fā)明VpWRKYl和VpWRKY2表達(dá)模式圖。圖示VpWRKYl和VpWRKY2在葡萄葉片接種白粉菌前后不同時間表達(dá)模式的半定量 分析結(jié)果；VpWRKYl和VpWRKY2被白粉菌誘導(dǎo)先上調(diào)表達(dá)到最高，再逐漸下降至初始水平。附圖2為本發(fā)明重組載體構(gòu)建示意圖。載體pCAMBIA1301的組成型35S啟動子分別被置換成目標(biāo)啟動子或直接去掉，從 而構(gòu)建成新的重組載體。附圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)化葉片⑶S染色結(jié)果圖。
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w/o35S GUS、PvpffRKYl GUS、PvpffRKY2 GUS 禾口 35S GUS 分別為無啟動子、 PvpffRKYU PvpWRKY2、35S啟動⑶S表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液侵染過的葉片，上排為葡萄白粉 菌懸浮液接種12小時后各載體轉(zhuǎn)化葉片的GUS染色結(jié)果，下排為水對照處理相同時間的染 色結(jié)果，WT為對照，即僅空農(nóng)桿菌LBA4404侵染。附圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)化葉片⑶S活性定量圖。不同啟動子啟動的GUS活性在葡萄葉片接種白粉菌前后的定量比較?；疑椭?黑色分別表示同一載體轉(zhuǎn)化葉片接種前、后的GUS活性。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述實(shí)施例一葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因啟動子的分離方法a.葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因半定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測取樣首先對葡萄葉片進(jìn)行白粉菌接種處理，當(dāng)新梢長至25-30cm長，新葉長至5-6cm寬 時，在每新梢上選取3片幼葉，壓片前預(yù)先噴霧無菌水使葉片上有微小液滴，但無明顯露點(diǎn) 出現(xiàn)，從田間發(fā)病葡萄上采摘白粉病發(fā)病癥狀一致的葉片對選取的葉進(jìn)行壓片接種，壓片 時間超過&，壓片后即套袋M小時保濕以利白粉菌孢子萌發(fā)，在接種后0、6、12、24、48、72、 96,120小時采集葉片在田間用液氮凍存，去離子水處理的葉片做為對照；b. RNA分離采用SDS/酚法，cDNA第一鏈合成參照Promega公司M-MMLV反轉(zhuǎn)錄酶 使用說明進(jìn)行；c.引物設(shè)計及反轉(zhuǎn)錄PCR檢測選擇VpGAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)目的基因及內(nèi)參基因序列設(shè)計引物如下VpffRKYl 上游引物GCGTCCTCGTCGGAGGGGATVpffRKYl 下游引物ATCTGGACCTGTTTGGTTGCVpffRKY2 上游引物CAGAGAAGGCTGAACCGAACVpffRKY2 下游弓丨物AGCCTTTGGAAATGGTGATGVpGAPDH 上游弓丨物ATCCACGGGAGCAGCAAA
VpGAPDH 下游弓丨物AGAACGCGAAAATTAGAACAGG反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)采用天根公司預(yù)混上樣緩沖液的2 X PCR mix反應(yīng)試劑盒，反應(yīng)程 序94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒條件下擴(kuò)增25 循環(huán)，最后72 °C延伸5分鐘，中國野生華東葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2 被葡萄白粉菌誘導(dǎo)12小時后先上調(diào)表達(dá)到最高，后隨時間延長逐漸下降至初始水平，表 明這兩個基因啟動子為病原菌誘導(dǎo)型啟動子，以‘白河-35-1’基因組DNA為模板，根據(jù) VpffRKYl和VpWRKY2基因序列設(shè)計啟動子下游引物，根據(jù)NCBI歐洲葡萄基因組同源序列設(shè) 計啟動子上游引物，PCR先直接快速擴(kuò)增出包含與基因重疊區(qū)域啟動子片段，回收PCR產(chǎn)物 克隆、測序；d. PCR擴(kuò)增啟動子片段PvpffRKYl 上游引物CTATTAGGAGGAGTTGGTTGPvpffRKYl 下游引物CTCATGGTGGCGTCTGTG
PvpffRKY2 上游引物ATGGTCTCCGTTCCGTCTT
PvpffRKY2 下游引物ACTCGGGGTTCGGCTCAG ；
e.葡萄基因組按小量提取法進(jìn)行
e.1采摘Icrn2左右葉片放入離心管中，
e.2加0.細(xì)1提取緩沖液，提取緩沖液配制200mM Tris PH 7. 5, 250mMNaCl, 25mMEDTA PH8..0,0. 5% SDS,
e.3用與離心管配套的小塑料研棒按順、逆時針交替旋轉(zhuǎn)法將樣品在緩沖液中磨碎，
e.4在12000rpm，離心5分鐘，
e.5上清液轉(zhuǎn)移至新管，
e.6加入0.細(xì)1酚氯仿異戊醇溶液，其體積比為25 24 1，PH值為6. 5，
e.7加0.細(xì)1異丙醇，混勻，
e.8放置5分鐘，
e.9全速離心5分鐘，
e.10棄上清，管底剩下DNA，
e.11加Iml 70%乙醇上下輕柔顛倒至白色片狀物懸浮，室溫放置2分鐘，
e.12在12000rpm，離心1分鐘，棄上清，
e.13開放空間干燥10分鐘以上，至乙醇揮發(fā)干凈，
e.14 加 50ul 滅菌 ddH20,
e.15稀釋5倍直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
f.目地片段的TA連接測序方法按Promega載體使用說明進(jìn)行。
實(shí)施例二 啟動子重組載體的構(gòu)建和應(yīng)用
a.重組載體構(gòu)建，為構(gòu)建⑶S報告重組載體，重新設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)^CbaI和
Nco I的引物僅擴(kuò)增不包含與基因重疊區(qū)域啟動子片段部分，分別命名為PvpWRKYl和 PvpWRKY2，用目的啟動子替換pCAMBIA1301的35S，使⑶S處于所克隆啟動子控制下，構(gòu)建成 promoter: GUS重組表達(dá)載體，此外，用BamHI和BglII酶切pCAMBIA1301的35S啟動子，利 用同尾酶互補(bǔ)將載體重新連接成沒有35S的⑶S載體，命名為w/o35S:⑶S，pCAMBIA1301 做為陽性對照，即35組成型啟動GUS表達(dá)；PvpffRKYl ⑶S 上游引物gggtctagaCTATTAGGAGGAGTTGGTTGPvpffRKYl ⑶S 下游引物gggccatggACTCACCAAGTGAAGATCAAPvpffRKY2 ⑶S 上游引物gggtctagaTGGTCTCCGTTCCGTCTTTC
PvpffRKY2⑶S 下游引物gggccatggGGCCGATTCGGAGAGAAG以TA連接好的載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR回收產(chǎn)物與pCAMBIA1301空載體 分別進(jìn)行)(bal和NcoI雙酶切后，PCR與載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后送測序保證重組載 體中啟動子插入位置正確無誤；b.電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備b. 1將LBA4404菌株接種于20ml含有40mg/L鏈霉素和50mg/L利福平終濃度的 LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)M小時，b. 2將培養(yǎng)好的菌液加入IOOml新鮮LB中至OD值0. 2，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至OD 值 0.6，
b. 3從搖床中取出菌液，冰浴15分鐘，b. 4菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管，4°C 5000rpm離心15分鐘，棄上清，b. 5用冰浴的滅菌ddH20 35ml重懸細(xì)胞，離心，棄上清，重復(fù)用ddH20洗一次，b. 6用冰浴的滅菌10%甘油25ml輕柔重懸浮細(xì)胞，離心，沉淀會很松散，棄上清， 重復(fù)用10%甘油洗一次，b. 7用2ml冰浴后的10%甘油重懸細(xì)胞即成感受態(tài)細(xì)胞，b. 8將感受態(tài)細(xì)胞按100 μ 1分裝到1. 5ml離心管，立即置于冰上準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)化；c.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，c. 1 將測序正確的 promoter: :GUS 菌液及陰性對照 w/0;35S: :GUS 和 pCAMBIA1301 提取質(zhì)粒后，用50ul無菌ddH20溶解備用，c. 2將電轉(zhuǎn)化用的電極杯及蓋子用ddH20洗凈后，80%乙醇侵泡5分鐘，用紫外交 聯(lián)儀紫外線照射30分鐘以除去殘留DNA，并將溫度設(shè)置為30°C烘干電極杯，c. 3將電極杯蓋好與感受態(tài)細(xì)胞一起分別置于冰上預(yù)冷20分鐘，c. 4加入ddH20溶解的質(zhì)粒0. 2ul于感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吸打混勻繼續(xù)冰浴30分 鐘，c. 5將混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使均勻進(jìn)入電極杯底部 且內(nèi)部不產(chǎn)生氣泡，c. 6打開電穿孔儀，選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化模式，調(diào)節(jié)電壓至1. 8KV,c. 7將電極杯側(cè)面用吸水紙完全拭干后按狹縫向前方向放入卡槽中，c. 8將卡槽推入電轉(zhuǎn)化儀，按start鍵，聽到兩聲輕微蜂鳴后，取出電極杯置于冰 上，待最后一個樣品電擊完畢，在超凈臺內(nèi)向每個電極杯中加200 μ 1液體LB將細(xì)胞洗出并 移入1. 5ml離心管中，至于培養(yǎng)1. 5小時后涂布于篩選平板上，c. 9對篩選出的菌落進(jìn)行PCR鑒定，并對陽性菌進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得工程菌；d.工程菌轉(zhuǎn)化葡萄葉片，誘導(dǎo)啟動轉(zhuǎn)基因表達(dá)，用真空滲透法將工程菌轉(zhuǎn)化入葡 萄葉片，并在接種前后染色，獲得報告基因的瞬時表達(dá)，d. 1將含有目地質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液接種到20ml含有40mg/L鏈霉素和50mg/L利福 平終濃度的LB液體培養(yǎng)基，28°C,200rpm振蕩培養(yǎng)36小時，d. 2將5ml培養(yǎng)液加入200ml新鮮含有相同抗生素的LB在、200rpm振蕩培養(yǎng) 16小時，d. 3在5000rpm離心10分鐘，棄上清，用20ml重懸液重懸菌體至OD值0. 6，重懸 液配制10mM MES pH 5. 6, IOmM MgCL2, 2% (ff/V)蔗糖，150 μ M乙酰丁香酮，將配好的重懸 液高壓滅菌15分鐘，冷卻備用，d. 4將大小薄厚一致的葡萄葉片均勻加入培養(yǎng)好的菌液中，菌液深度不超過 1. 5cm，在真空泵壓力0. 085-0. 09MPa下抽真空45分鐘，d. 5擦去葉片表面菌液，正面朝上將葉柄固定于濕潤的脫脂棉內(nèi)，放于托盤中，覆 蓋帶孔保鮮膜，于27°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)16小時，再在弱光下培養(yǎng)至3天，期間噴霧保濕，d. 6每處理取出半數(shù)葉片，用去離子水沖洗，基中兩片用于蛋白測定，其余放入 ⑶S染色液中再抽真空10分鐘，37°C染色，d. 7對另半數(shù)葉片用壓片法接種葡萄白粉菌，壓片前預(yù)先噴霧無菌水使葉片上有微小液滴，但無明顯露點(diǎn)出現(xiàn)，從田間采摘發(fā)病嚴(yán)重且一致的葉片對轉(zhuǎn)化葉片進(jìn)行壓片接 種，壓片時間5秒，壓片后繼續(xù)覆蓋帶孔保鮮膜保濕，12小時后取兩片用于蛋白測定，其余 放入GUS染色液中染色；e.轉(zhuǎn)基因葡萄葉片病原誘導(dǎo)GUS活性的定量檢測⑶S活性檢測方法按Jefferson經(jīng)典方案，以4_甲基傘形酮酰-β -D-葡萄糖酸苷 (4-MUG)為底物，GUS催化使之水解為4-甲基傘形酮G-MU)與β-D-葡萄糖醛酸，4-MU分 子中的羥基解離后被365nm的光激發(fā)，產(chǎn)生455nm的熒光，熒光值由熒光分光光度計測定。
權(quán)利要求
1.葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動子的分離方法，中國野生華東葡萄抗白粉病株系‘白 河-35-1’葡萄抗病轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2為白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)型基因，其啟動 子具有受病原菌誘導(dǎo)啟動基因上調(diào)表達(dá)的活性，采用GenBank葡萄基因組序列及白粉菌誘 導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2序列設(shè)計引物，從中國野生華東葡萄抗白粉 病株系‘白河-35-1’基因組DNA中進(jìn)行啟動子片段的克隆，獲得了病原菌誘導(dǎo)型啟動子 PvpffRKYl全長序列694bp與病原菌誘導(dǎo)型啟動子PvpWRKY2全長序列64;3bp，其特征在于 通過構(gòu)建重組表達(dá)載體PvpWRKYl:⑶S和PvpWRKY2:⑶S，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法 導(dǎo)入葡萄葉片，瞬時表達(dá)所克隆啟動子啟動的GUS報告基因，通過對接種葡萄白粉菌前后 瞬時表達(dá)葉片的GUS染色觀察，及對接種葡萄白粉菌前后瞬時表達(dá)葉片的GUS活性定量檢 測，驗(yàn)證了 PvpWRKYl和PvpWRKY2受葡萄白粉菌誘導(dǎo)啟動報告基因活性上調(diào)。
2.如權(quán)利要求1所述的葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動子的分離方法，其特征在于2. a葡萄VpWRKYl和VpWRKY2基因半定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測取樣，首先對葡萄葉片進(jìn)行白 粉菌接種處理，當(dāng)新梢長至25-30cm長，新葉長至5-6cm寬時，在每新梢上選取3片幼葉，壓 片前預(yù)先噴霧無菌水使葉片上有微小液滴，但無明顯露點(diǎn)出現(xiàn)，從田間發(fā)病葡萄上采摘白 粉病發(fā)病癥狀一致的葉片對選取的葉進(jìn)行壓片接種，壓片時間超過^，壓片后即套袋M小 時保濕以利白粉菌孢子萌發(fā)，在接種后0、6、12、24、48、72、96、120小時采集葉片在田間用 液氮凍存，去離子水處理的葉片做為對照；2. b RNA分離采用SDS/酚法，cDNA第一鏈合成參照Promega公司M-MMLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明進(jìn)行；2. c引物設(shè)計及反轉(zhuǎn)錄PCR檢測選擇VpGAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)目的基因及內(nèi)參基因序列設(shè)計引物如下VpffRKYl 上游引物GCGTCCTCGTCGGAGGGGATVpffRKYl 下游引物ATCTGGACCTGTTTGGTTGCVpffRKY2 上游引物CAGAGAAGGCTGAACCGAACVpffRKY2 下游引物AGCCTTTGGAAATGGTGATGVpGAPDH 上游引物ATCCACGGGAGCAGCAAAVpGAPDH 下游引物AGAACGCGAAAATTAGAACAGG反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)采用天根公司預(yù)混上樣緩沖液的2XPCR mix反應(yīng)試劑盒，反應(yīng)程序 94°C預(yù)變性3分鐘，然后94°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒條件下擴(kuò)增25循 環(huán)，最后72°C延伸5分鐘，中國野生華東葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’轉(zhuǎn)錄因子基因VpWRKYl和VpWRKY2被葡 萄白粉菌誘導(dǎo)12小時后先上調(diào)表達(dá)到最高，后隨時間延長逐漸下降至初始水平，表明這兩 個基因啟動子為病原菌誘導(dǎo)型啟動子，以‘白河-35-1’基因組DNA為模板，根據(jù)VpWRKYl和 VpffRKY2基因序列設(shè)計啟動子下游引物，根據(jù)NCBI歐洲葡萄基因組同源序列設(shè)計啟動子上 游引物，PCR先直接快速擴(kuò)增出包含與基因重疊區(qū)域啟動子片段，回收PCR產(chǎn)物克隆、測序； 2.d PCR擴(kuò)增啟動子片段 PvpffRKYl 上游引物CTATTAGGAGGAGTTGGTTG PvpffRKYl 下游引物CTCATGGTGGCGTCTGTG PvpffRKY2 上游引物ATGGTCTCCGTTCCGTCTTPvpffRKY2 下游引物ACTCGGGGTTCGGCTCAG ；2. e葡萄基因組按小量提取法進(jìn)行 2. e. 1采摘Icm2左右葉片放入離心管中，2. e. 2 加 0. 4ml 提取緩沖液，提取緩沖液配制200mM Tris PH 7. 5,250mM NaCl, 25mM EDTA PH :8. 0,0. 5% SDS,2. e. 3用與離心管配套的小塑料研棒按順、逆時針交替旋轉(zhuǎn)法將樣品在緩沖液中磨碎， 2. e. 4 在 12000rpm，離心 5 分鐘， 2. e. 5上清液轉(zhuǎn)移至新管，2. e. 6加入0.細(xì)1酚氯仿異戊醇溶液，其體積比為25 24 1，PH值為6. 5，2. e. 7加0. 4ml異丙醇，混勻，2. e. 8放置5分鐘，2. e. 9全速離心5分鐘，2. e. 10棄上清，管底剩下DNA，2. e. 11加Iml 70%乙醇上下輕柔顛倒至白色片狀物懸浮，室溫放置2分鐘，2. e. 12在12000rpm，離心1分鐘，棄上清，2. e. 13開放空間干燥10分鐘以上，至乙醇揮發(fā)干凈，2. e. 14 加 50ul 滅菌 ddH20,2. e. 15稀釋5倍直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2.f.目地片段的TA連接測序方法按Promega載體使用說明進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求1所述的葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動子在抗病育種中的應(yīng)用，其特征在于 3. a重組載體構(gòu)建，為構(gòu)建⑶S報告重組載體，重新設(shè)計帶有酶切位點(diǎn))(ba I和Nco I的引物僅擴(kuò)增不包含與基因重疊區(qū)域啟動子片段部分，分別命名為PvpWRKYl和PvpWRKY2， 用目的啟動子替換PCAMBIA1301的35S，使GUS處于克隆所克隆啟動子控制下，構(gòu)建成 promoter: :GUS重組表達(dá)載體，此外，用BamHI和BglII酶切pCAMBIA1301的35S啟動子，利 用同尾酶互補(bǔ)將載體重新連接成沒有35S的⑶S載體，命名為w/o35S:⑶S，pCAMBIA1301 做為陽性對照，即35組成型啟動GUS表達(dá)；PvpffRKYl: GUS 上游引物gggtctagaCTATTAGGAGGAGTTGGTTG PvpffRKYl: GUS 下游引物gggccatggACTCACCAAGTGAAGATCAA PvpffRKY2 :GUS 上游引物gggtctagaTGGTCTCCGTTCCGTCTTTC PvpffRKY2 :GUS 下游引物gggccatggGGCCGATTCGGAGAGAAG以TA連接好的載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR回收產(chǎn)物與PCAMBIA1301空載體分別 進(jìn)行^CbaI和NcoI雙酶切后，PCR與載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后送測序保證重組載體中 啟動子插入位置正確無誤；3. b電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備3. b. 1將LBA4404菌株接種于20ml含有40mg/L鏈霉素和50mg/L利福平終濃度的LB 液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)M小時，3. b. 2將培養(yǎng)好的菌液加入IOOml新鮮LB中至OD值0. 2，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至OD值0. 6，3. b. 3從搖床中取出菌液，冰浴15分鐘，· 3. b. 4菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管，4°C 5000rpm離心15分鐘，棄上清， 3. b. 5用冰浴的滅菌ddH20 35ml重懸細(xì)胞，離心，棄上清，重復(fù)用ddH20洗一次， 3. b. 6用冰浴的滅菌10%甘油25ml輕柔重懸浮細(xì)胞，離心，沉淀會很松散，棄上清，重 復(fù)用10%甘油洗一次，·3. b. 7用2ml冰浴后的10%甘油重懸細(xì)胞即成感受態(tài)細(xì)胞，·3. b. 8將感受態(tài)細(xì)胞按100 μ 1分裝到1. 5ml離心管，立即置于冰上準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)化；·3. c農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，·3. c. 1將測序正確的promoter: :GUS菌液及陰性對照w/0;35S: :GUS和pCAMBIA1301提 取質(zhì)粒后，用50ul無菌ddH20溶解備用，·3. c. 2將電轉(zhuǎn)化用的電極杯及蓋子用ddH20洗凈后，80%乙醇侵泡5分鐘，用紫外交聯(lián) 儀紫外線照射30分鐘以除去殘留DNA，并將溫度設(shè)置為30°C烘干電極杯， 3. c. 3將電極杯蓋好與感受態(tài)細(xì)胞一起分別置于冰上預(yù)冷20分鐘， 3. c. 4加入ddH20溶解的質(zhì)粒0. 2ul于感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吸打混勻繼續(xù)冰浴30分鐘， 3. c. 5將混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使均勻進(jìn)入電極杯底部且 內(nèi)部不產(chǎn)生氣泡，·3. c. 6打開電穿孔儀，選擇細(xì)菌轉(zhuǎn)化模式，調(diào)節(jié)電壓至1. 8KV， 3. c. 7將電極杯側(cè)面用吸水紙完全拭干后按狹縫向前方向放入卡槽中， 3. c. 8將卡槽推入電轉(zhuǎn)化儀，按start鍵，聽到兩聲輕微蜂鳴后，取出電極杯置于冰上， 待最后一個樣品電擊完畢，在超凈臺內(nèi)向每個電極杯中加200 μ 1液體LB將細(xì)胞洗出并移 入1. 5ml離心管中，至于培養(yǎng)1. 5小時后涂布于篩選平板上，·3. c. 9對篩選出的菌落進(jìn)行PCR鑒定，并對陽性菌進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得工程菌； 3. d工程菌轉(zhuǎn)化葡萄葉片，誘導(dǎo)啟動轉(zhuǎn)基因表達(dá)，用真空滲透法將工程菌轉(zhuǎn)化入葡萄葉 片，并在接種前后染色，獲得報告基因的瞬時表達(dá)，·3. d. 1將含有目地質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液接種到20ml含有40mg/L鏈霉素和50mg/L利福平 終濃度的LB液體培養(yǎng)基，28°C,200rpm振蕩培養(yǎng)36小時，·3. d. 2將5ml培養(yǎng)液加入200ml新鮮含有相同抗生素的LB在^°C、200rpm振蕩培養(yǎng) 16小時，·3. d. 3在5000rpm離心10分鐘，棄上清，用20ml重懸液重懸菌體至OD值0. 6，重懸液 配制10mM MES pH 5. 6, IOmM MgCL2, 2% (ff/V)蔗糖，150 μ M乙酰丁香酮，將配好的重懸液 高壓滅菌15分鐘，冷卻備用，·3. d. 4將大小薄厚一致的葡萄葉片均勻加入培養(yǎng)好的菌液中，菌液深度不超過1. 5cm, 在真空泵壓力0. 085-0. 09MPa下抽真空45分鐘，·3. d. 5擦去葉片表面菌液，正面朝上將葉柄固定于濕潤的脫脂棉內(nèi)，放于托盤中，覆蓋 帶孔保鮮膜，于27°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)16小時，再在弱光下培養(yǎng)至3天，期間噴霧保濕，·3. d. 6每處理取出半數(shù)葉片，用去離子水沖洗，基中兩片用于蛋白測定，其余放入GUS 染色液中再抽真空10分鐘，37°C染色，·3. d. 7對另半數(shù)葉片用壓片法接種葡萄白粉菌，壓片前預(yù)先噴霧無菌水使葉片上有微 小液滴，但無明顯露點(diǎn)出現(xiàn)，從田間采摘發(fā)病嚴(yán)重且一致的葉片對轉(zhuǎn)化葉片進(jìn)行壓片接種， 壓片時間5秒，壓片后繼續(xù)覆蓋帶孔保鮮膜保濕，12小時后取兩片用于蛋白測定，其余放入GUS染色液中染色；3. e轉(zhuǎn)基因葡萄葉片病原誘導(dǎo)GUS活性的定量檢測⑶S活性檢測方法按Jefferson經(jīng)典方案，以4_甲基傘形酮酰-β -D-葡萄糖酸苷 (4-MUG)為底物，GUS催化使之水解為4-甲基傘形酮G-MU)與β-D-葡萄糖醛酸，4-MU分 子中的羥基解離后被365nm的光激發(fā)，產(chǎn)生455nm的熒光，熒光值由熒光分光光度計測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種啟動子快速克隆法，以克隆獲得兩個葡萄病原菌誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)建啟動子::報告基因融合載體，兩個啟動子啟動報告基因在葡萄葉片中的表達(dá)受白粉菌誘導(dǎo)，為葡萄抗病基因工程提供病原菌誘導(dǎo)型啟動子的克隆方法并成功應(yīng)用于葡萄抗病育種中?？寺〉膬蓚€誘導(dǎo)型啟動子均能在病原菌侵染時以精準(zhǔn)方式調(diào)控轉(zhuǎn)入外源基因，使轉(zhuǎn)入基因僅在受病原菌誘導(dǎo)的條件下被啟動表達(dá)，在葡萄抗病育種中，僅需把重組載體中啟動子所啟動的報告基因換成任何抗病基因，即可轉(zhuǎn)化葡萄獲得病原菌誘導(dǎo)表達(dá)外源抗病基因的轉(zhuǎn)化植株，減少抗病基因工程育種中組成型啟動子對轉(zhuǎn)基因葡萄造成的負(fù)面影響，最大限度發(fā)揮轉(zhuǎn)基因優(yōu)勢。
文檔編號C12N15/113GK102121004SQ20101058255
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者周起, 朱自果, 李慧娥, 王躍進(jìn), 謝小青 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)