專利名稱：一株生防球孢鏈霉菌及在防治柑橘青霉病中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農業(yè)微生物技術領域，具體涉及一株球孢鏈霉菌，尤其是涉及一株可以產生抗真菌揮發(fā)性物質的球孢鏈霉菌的分離鑒定及其在防治柑橘青霉病中的應用。
背景技術：
柑橘是世界上主要的果樹之一，年產量已超過6500萬噸。柑橘果實在采收后貯藏 運輸期間很容易發(fā)生由真菌或細菌引起的霉爛變質，會直接造成柑橘產量的下降以及貯藏 品質的降低，從而造成很大的經濟損失。柑橘青霉是柑橘貯藏期最嚴重的病害之一，據報 道，在中國每年由柑橘青霉病所造成的柑橘產量損失為10-30%，嚴重時可達30-50%。目 前防治柑橘貯藏期病害的一般方法是使用抑霉哇、特克多等化學農藥，然而，長期使用化學 農藥會導致病原菌產生抗藥性而降低化學藥劑的防治效果，并且頻繁和高濃度的使用化學 農藥會造成農藥在果蔬中的殘留，不但污染了環(huán)境，而且嚴重威脅到人類的身體健康。隨著 人們生活水平的不斷提高，公眾對身體健康和環(huán)境條件的日益關注，我們必須探索出安全 有效、環(huán)境友好的防治柑橘貯藏期病害的方法，才能滿足當代社會的需要。揮發(fā)性物質是一類低分子量的非極性化合物(< 300Da)，前人報道過一些真菌、 細菌和放線菌可以產生揮發(fā)性物質，并且發(fā)現內生真菌Muscodor albus產生的揮發(fā)性物質 具有抗真菌活性，已被作為生物殺菌劑來防治灰霉、毛霉、青霉、炭疽、褐腐等果蔬的貯藏期 病害(Grimme et al. ,2007 ；Strobel et al.，2007)。放線菌產生的揮發(fā)性物質可以引起 曲霉病菌分生孢子的異常萎縮，鐮刀菌、青霉菌、綠色木霉菌等的薄壁液泡增大，并且使綠 色木霉菌絲分枝增多，畸形(Moore-Landecker et al.，1973)。近年來，有人報道普特拉鏈 霉菌產生的揮發(fā)性物質在密閉容器中對水稻紋枯病、油菜菌核病、草莓灰霉病具有較好的 防治效果(Wan et al.，2008)。迄今為止，還沒有鏈霉菌產生的揮發(fā)性物質防治柑橘貯藏期 病害的報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一株可產生抗真菌的揮發(fā)性物質的生防菌_球孢鏈霉菌，該 菌株可以產生揮發(fā)性物質并能有效抑制柑橘青霉病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)以及孢子的形 成，從而達到防治貯藏保鮮中的柑橘青霉病的目的。本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明的微生物是在湖北省武漢市華中農業(yè)大學湖北省作物病害檢測與安 全控制重點實驗室自然污染的PDA平皿上分離得到一株球孢鏈霉菌(Str印tomyces globisporus)，申請人將其命名為JK-1，該菌株已于2010年4月20日送交湖北省武漢市武 漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO :M2010093。球孢鏈霉菌(Sti^ptomycesglobisporus) JK-I 的菌學特征球孢鏈霉菌JK-I為革蘭氏陽性細菌，在PDA平板上的菌落呈圓形，初期白色，后為 灰色或黃綠色。孢子圓柱形或橢圓形，孢子鏈直或波曲，有二級分枝；頂端不形成螺旋結構，偶爾呈鉤狀。本發(fā)明制備的球孢鏈霉菌JK-I菌株的保藏將球孢鏈霉菌的菌體保存在25%的甘油中，-20°C冷凍保藏。申請人:供了一種球孢鏈霉菌JK-I菌劑的制備方法，其步驟如下所示(1)制備球孢鏈霉菌JK-I的一級種子液取甘油管保存的保藏號為CCTCC NO M2010093的球孢鏈霉菌JK-I菌種，劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基的上面，置于28°C下培養(yǎng)6 天后，加少量無菌水洗下菌落表面的孢子，稀釋成1 X IO6個/mL之后取100 μ L加入到含有 IOOmL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中(250mL)，置于28°C下，在轉速為150rpm搖床上震蕩培養(yǎng)6 天，得到球孢鏈霉菌的一級種子液，使球孢鏈霉菌為1 X IO8CfuAil(2)制備球孢鏈霉菌JK-I的二級種子液將步驟(1)的球孢鏈霉菌JK-I菌一級 種子液，按體積比ι 2%的比例接種到盛有PDB液體培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基成分按g/L計， 馬鈴薯200g葡萄糖20g補充蒸餾水至1000ml)的250ml的三角瓶中，置于28°C，在轉速為 150rpm搖床上震蕩培養(yǎng)6天，得到球孢鏈霉菌的二級種子液，使球孢鏈霉菌為1 X IO8Cfu/ ml ο(3)球孢鏈霉菌JK-I的發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(2)的球孢鏈霉菌JK-I的二級種子液 按體積質量比 2%接種到盛有滅菌小麥粒培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻后置于28°C下培 養(yǎng)14天，得到含球孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物。其中PDB液體培養(yǎng)基的配方是馬鈴薯200g葡萄糖20g補充蒸餾水至IOOOml。制作方法是將洗凈后去皮的馬鈴薯切碎，加水IOOOml煮沸約半個小時，用紗布 慮去馬鈴薯，然后加入葡萄糖20g，加水補足至1000ml，攪拌溶解后分裝滅菌。(4)將培養(yǎng)14d的球孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物(以空白麥粒培養(yǎng)基為對照)取 40g放入頂空微萃取瓶中，進行氣相色譜/質譜(GC/MS)分析，鑒別揮發(fā)性物質的成分。(5)在培養(yǎng)皿組成的空間為500mL的密閉容器中測定不同量(0g，1. 875g，3. 75g， 7. 5g，15g，30g)的球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物對柑橘青霉菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)以及孢 子形成的影響；在分離篩組成的空間為2L的密閉容器中測定不同量(0g，30g，60g，120g， 240g，480g)的球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物對柑橘青霉病的防治效果。(6)在分離篩組成的空間為2L的密閉容器中測定240g的球孢鏈霉菌JK-I麥粒培 養(yǎng)物產生的揮發(fā)性物質對柑橘自然發(fā)病的柑橘青霉病的防治效果。本發(fā)明的優(yōu)點是該球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物可以在密閉容器中不接觸水果 而通過氣體的作用來抑制柑橘青霉菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、孢子形成以及防治柑橘青霉病 等柑橘果實上主要的貯藏期病害，減少了球孢鏈霉菌本身對柑橘的影響以及對人類的毒害 作用。由于球孢鏈霉菌產生的揮發(fā)性物質本身易揮發(fā)，熏蒸處理后殘留在柑橘表皮的揮發(fā) 性物質在常溫下很容易揮發(fā)從而減少了對柑橘品質的影響和對人體健康的危害。另外，本 發(fā)明確定了對柑橘青霉有抑制作用和防治效果的鏈霉菌麥粒培養(yǎng)物的用量，具有很強的實 用性。
圖1為未接種孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)基產生揮發(fā)性物質的氣相色譜圖。
圖2為接種球孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物產生揮發(fā)性物質的氣相色譜圖。圖3為球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉病菌菌絲生長的影響的柱 狀圖。圖4為球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉菌孢子形成影響的柱狀圖。圖5為球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用的 柱狀圖。圖6為球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉病的防治效果圖。圖中·Λ, Og ；B，30g ；C，60g ；D, 120g ；E，240g ；F，480g 鏈霉菌麥粒培養(yǎng)物熏蒸。圖7為球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對自然發(fā)病的柑橘青霉病的防治效果圖。圖中A，240g球孢鏈霉菌麥粒培養(yǎng)物熏蒸處理；B未處理對照。
具體實施例方式實施例1 球孢鏈霉菌JK-I的分離篩選與發(fā)酵培養(yǎng)一、分離與篩選過程本發(fā)明的微生物是在湖北省武漢市華中農業(yè)大學湖北省作物病害檢測與安全控 制重點實驗室自然污染的PDA平皿上分離得到1株較強拮抗活性的鏈霉菌，分離純化為常 規(guī)方法，參照文獻方中達(1998)，方法是，從自然污染的PDA平皿上挑取鏈霉菌菌落，經 5ml無菌水稀釋后，用接種針沾取少量稀釋液在PDA平皿上畫線，挑選所需特征單菌落，經 過3次相同的劃線培養(yǎng)，最終得到純的鏈霉菌菌株。申請人將其命名為JK-1。參照鏈霉菌 鑒定手冊(中國科學院微生物研究所放線菌分類組，1975)對鏈霉菌JK-I進行形態(tài)學觀察 和生理生化試驗，將鏈霉菌JK-I鑒定為球孢鏈霉菌(Str印tomyces globisporus)。對球孢 鏈霉菌JK-I進行了初步的生防測試，發(fā)現該菌株具有抗真菌活的揮發(fā)性物質產生，對所產 生的抗真菌活的揮發(fā)性物質進行了進一步地跟蹤研究(見表1和表2)，確定該菌株對貯藏 中的柑橘青霉病菌具有明顯的拮抗作用(見實施例3、4、5、6所述)。該菌株已于2010年4 月20目送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏號 為 CCTCC NO :M2010093。二、球孢鏈霉菌JK-I的種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)(1)制備球孢鏈霉菌的一級種子液取甘油管保存的保藏號為M2010093的球孢鏈 霉菌JK-I菌種，劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基的上面，置于28°C下培養(yǎng)6天后，加少量無菌水 洗下菌落表面的孢子，稀釋成1 X IO6個/mL之后取100 μ L加入到含有IOOmLPDB培養(yǎng)基的 三角瓶中(250mL)，置于28°C下，轉速為150rpm搖床上震蕩培養(yǎng)6天，得到球孢鏈霉菌的一 級種子液，使得菌體濃度為IX IO8個/ml。(2)制備球孢鏈霉菌JK-I的二級種子液將步驟⑴球孢鏈霉菌JK-I菌一級種子 液，按體積比1 2 %的比例接種到盛有PDB液體培養(yǎng)基的的250ml的三角瓶中，置于28°C， 轉速為150rpm搖床上震蕩培養(yǎng)6天，得到球孢鏈霉菌的二級種子液，使菌體濃度為IXlO8 個/ml。(3)球孢鏈霉菌JK-I的發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(2)的球孢鏈霉菌JK-I的二級種子液 按體積質量比 2%接種到盛有滅菌小麥粒培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻后置于28°C下培 養(yǎng)14天。其間每隔2d搖勻一次麥粒培養(yǎng)基，以便鏈霉菌生長均勻。
PDB液體培養(yǎng)基的配方馬鈴薯200g葡萄糖20g蒸餾水1000ml。制備方法將洗凈后去皮的馬鈴薯切碎，加水IOOOml煮沸約半個小時，用紗布慮去馬鈴薯，然后加入葡萄糖，加水補足至IOOOml，攪拌溶解后分裝滅菌。實施例2 球孢鏈霉菌JK-I產生揮發(fā)性物質成分的初步鑒定將培養(yǎng)14d的球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物(不加球孢鏈霉菌JK-I，培養(yǎng)14d的滅 菌麥粒培養(yǎng)物為對照，下同)取40g放入頂空微萃取瓶中，再加入飽和的NaCl溶液50mL磁 力攪拌，在60°C下平衡40min后回收萃取頭，從萃取瓶中拔出萃取頭并立即插入氣相色譜 進樣孔，于280°C解吸5min進行氣相色譜/質譜(GC/MS)分析，氣相色譜圖如圖1、2所示。 將所得到的各氣體成分的質譜圖與NIST數據庫(Agilent7890A，美國Agilent公司)進行 比對，從而鑒別出揮發(fā)性物質的成份。從鏈霉菌麥粒培養(yǎng)物產生的物質成分中鑒定出35種 化合物，如表1所示。實施例3 球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉病菌菌絲生長以及孢子 形成的抑制作用在直徑150mm高30mm的大培養(yǎng)皿中放四個沒有蓋的直徑60mm高15mm的小培養(yǎng) 皿底；其中三個小培養(yǎng)皿盛5mL左右的PDA培養(yǎng)基(方中達，1998)并接種直徑5mm的柑橘 青霉菌菌絲塊，另外一個小培養(yǎng)皿放置球孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物，然后將大培養(yǎng)皿用 封口膜密封。分別設5個不同處理，球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物的量分別為0g，1. 875g， 3. 75g，7. 5g，15g，30g。在25°C的條件下培養(yǎng)5d后，觀察測量各小培養(yǎng)皿中菌落直徑的大小 以及各培養(yǎng)皿產生的孢子量的多少。結果如圖1、2所示。球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物產 生的揮發(fā)性物質對青霉菌菌絲生長和孢子的形成有明顯的抑制作用，菌落直徑隨著球孢鏈 霉菌的麥粒培養(yǎng)物量的增多而減小。在30g球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物存在的情況下，青 霉菌的菌絲生長完全被抑制，并且未見孢子的形成。實施例4 球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作 用在直徑150mm高30mm的大培養(yǎng)皿中放四個沒有蓋的直徑60mm高15mm的小培養(yǎng) 皿；其中三個小培養(yǎng)皿盛5mL左右的PDA培養(yǎng)基，并用50 μ L的柑橘青霉分生孢子的懸浮液 (濃度為IO4個/mL)涂皿。將制備好的球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物置于另外一個小培養(yǎng) 皿中，然后將大培養(yǎng)皿用封口膜密封，在25°C培養(yǎng)12h后測定孢子萌發(fā)情況。分別設5個不 同處理，球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物的量分別為0g，1. 875g，3. 75g，7. 5g，15g，30g。在25°C 培養(yǎng)12h后，空白對照柑橘青霉菌的孢子萌發(fā)率達95. 3% (圖3)，而在15g或30g球孢鏈 霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物存在的情況下，柑橘青霉菌的孢子萌發(fā)率分別為31. 3%和3. 4%。這 說明本發(fā)明的球孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物產生的揮發(fā)性物質對孢子萌發(fā)具有明顯的抑 制作用。實施例5 不同量的球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉病的防治效果 (應用實施例)選取顏色、大小一致的沙糖橘(一種寬皮柑橘類商品果品，在貯藏中很容易誘發(fā) 柑橘青霉病)，先用濃度為75 %的酒精對果實進行表面消毒lmin，再用無菌水清洗干凈，晾 干。在與果蒂相對的表皮中央用針刺傷果皮，點接20 μ L的柑橘青霉菌的孢子液(IO6個/ mL)并放在金屬分離篩(直徑25cm，高5cm)里面，不同量(0g，30g，60g，120g，240g，480g)的球孢鏈霉菌的麥粒培養(yǎng)物放在分離篩下面的篩底中；在金屬篩上面蓋上蓋子后用封口膜密 封，并置于25°C的條件下培養(yǎng)5d后觀察砂糖橘的柑橘青霉病的發(fā)病情況。結果發(fā)現在25°C 條件下培養(yǎng)5d后，未處理的沙糖橘的發(fā)病率為100%，而用60g，120g，240g和480g的球孢 鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物熏蒸處理沙糖橘的柑橘青霉的發(fā)病率與對照相比明顯降低(見表 2)。并且隨著球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物量的增加，發(fā)病率減少。在60g和120g的球孢鏈 霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物熏蒸處理下的沙糖橘的發(fā)病率分別為70. 6%和19. 0%，而在240g 和480g球孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物熏蒸處理情況下的沙糖橘的發(fā)病率均為0。這表明 本發(fā)明的球孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉病有很好的防治效果
實施例6 球孢鏈霉菌JK-I產生的揮發(fā)性物質對自然發(fā)病的柑橘青霉病的防治效 果選取顏色、大小一致的沙糖橘(購自商品)，放在金屬分離篩(直徑25cm，高5cm) 里面，取240g的球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物放在該金屬篩底，在金屬篩上面蓋上蓋子后用 封口膜密封。在25°C培養(yǎng)IOd后觀察計算沙糖橘自然發(fā)病情況。結果如圖5所示，在240g 球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物熏蒸的情況下，沙糖橘的柑橘青霉的發(fā)病率為7. 5%，而未用 球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物處理的對照組的沙糖橘的柑橘青霉的發(fā)病率為25. 3%，本發(fā) 明的防效高達70.4%。這說明本發(fā)明的球孢鏈霉菌JK-I麥粒培養(yǎng)物產生的揮發(fā)性物質對 自然侵染的柑橘青霉病具有很好的防治效果。附表和文獻表1 (請參見第6-7頁)。表2(請參見第7頁)。參考文獻(請參見第7頁)。表1應用氣相色譜/質譜分析鑒定球孢鏈霉菌JK-I的麥粒培養(yǎng)物產生的揮發(fā)性
物質成分 表2球孢鏈霉菌JK-I的產生的揮發(fā)性物質對柑橘青霉病發(fā)病率和嚴重度的影響 參考文獻中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊.北京科學出版社， 1975;方中達.植病研究方法(第三版).北京中國農業(yè)出版社，1998;Grimme, E. , Zidack, N. K. , Sikora, R. A. , Strobel, G. A. &Jacobsen, B. J. , 2007. Comparison of Muscodor albusvolatiles with a biorational mixture for control of seedling diseases of sugar beet and root-knot nematode ontomato. Plant Dis.91, 220-225.Herrington, p. R. , Graig, J. Τ. , Chea, C. Y. &Sheridan, J. Ε. , 1985. Inhibition of spore germination of volatiles fromStreptomyces griseoruber. Soil Biol. Biochem. 19，509-512.Moore-Landecker, E. &Stotzky, G. , 1973. Morphological abnormalities of fungi induced by volatile microbialmetabolites. Mycologia65,519-530.Strobel, G. A. , Kluck, K. , Hess, W. Μ. , Sears, J. , Ezra, D. &Vargas, P. N., 2007. Muscodor albus E_6, anendophyte of Guazuma ulmifolia making volatile antibiotics :Isolation, characterization and experimentalestablishment in the host plant. Microbiologyl53,2613-2620.Wan, Μ. , Li, G. , Zhang, J. ， Jiang, D. &Huang, H. C. ,2008. Effect of volatile substances of Streptomyces platensisF-1 on control of plant fungal diseases. Biol.Control,46,552-559.
權利要求
一種能產生抗真菌揮發(fā)性物質的球孢鏈霉菌，其特征在于，該菌株為球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)JK-1，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM2010093。
2.包含權利要求1所述菌株的微生物菌劑。
3.權利要求1所述的球孢鏈霉菌JK-1在防治柑橘青霉病中的應用。
4.權利要求2所述的微生物菌劑在防治柑橘青霉病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農業(yè)微生物技術領域。具體涉及一株生防球孢鏈霉菌分離鑒定及在防治柑橘青霉病中的應用。本發(fā)明獲得一株能產生抗真菌揮發(fā)性物質的球孢鏈霉菌JK-1，該菌株為球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)，保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM2010093。本發(fā)明還包括由球孢鏈霉菌菌株JK-1制備的微生物菌劑。利用該球孢鏈霉菌JK-1產生的揮發(fā)性物質進行了貯藏保鮮中柑橘青霉病的防治，證明本發(fā)明的微生物及其菌劑屬于一種新的生防菌。
文檔編號C12N1/20GK101845412SQ20101016246
公開日2010年9月29日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權日2010年4月27日
發(fā)明者李其利, 鄭露, 黃俊斌 申請人:華中農業(yè)大學