專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其在真菌病害防治中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌，及其在煙草或蔬菜真菌病害防治、促進(jìn)煙草或蔬菜生長中的應(yīng)用，屬于生物防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長期以來，植物病害以化學(xué)防治為主，但受到高效低毒的殺菌劑農(nóng)藥品種少、防效易受環(huán)境條件影響、易造成環(huán)境污染和產(chǎn)生抗藥性等問題困擾。生物防治具有對環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全的優(yōu)點(diǎn)，在病蟲害綜合治理中發(fā)揮了越來越大的作用，并被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段。隨著人們對環(huán)境安全和健康的關(guān)注，對煙草(吸食品)和蔬菜產(chǎn)品的質(zhì)量要求也越來越高，無公害、綠色食品甚至有機(jī)食品逐漸成為消費(fèi)市場的主流，因此，采用生物防治技術(shù)得到了廣泛的認(rèn)可。近年來，國內(nèi)外廣泛利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物來抑制病原菌生存和活動，使得這一防治措施得以快速發(fā)展。美國已有GB03、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢桿菌變種等4株枯草芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可。在德國解淀粉枯草芽孢桿菌變種 raBM被商業(yè)化生產(chǎn)，用于控制糧食作物的不同真菌病害。我國已開發(fā)成功并投入生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌商品制劑有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等。上述產(chǎn)品主要用于糧食和果樹真菌病害的防治，尚未見用于煙草、辣椒、黃瓜、茄子、番茄真菌病害的報(bào)道。國內(nèi)已報(bào)道防治煙草赤星病、黑脛病等真菌病害的拮抗細(xì)菌主要有熒光假單胞桿菌(顧金剛等，2004;李洪林等，2008)、綠針假單胞菌(王遠(yuǎn)山等，2002)、短小芽孢桿菌 AR03 (王靜，2010)、枯草芽孢桿菌(易龍等，2007 ；張成省等2008)，防治辣椒疫病拮抗細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌(柳鳳，2009)，防治黃瓜枯萎病、茄子黃萎病、番茄葉霉病等蔬菜真菌病害拮抗細(xì)菌未見報(bào)道。上述研究僅是生防菌株篩選與機(jī)理研究，并未將其制成適用于工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的制劑，其實(shí)際應(yīng)用存在難題。本發(fā)明人已經(jīng)努力開發(fā)了一種具有強(qiáng)抗真菌活性、促進(jìn)植物生長、防治真菌病害、 改善煙葉品質(zhì)的多功能新微生物殺菌劑，所述植物病害包括煙草赤星病、煙草黑脛病、辣椒疫病、番茄葉霉病、茄子黃萎病和黃瓜枯萎病。經(jīng)檢索，在所有已申請的專利文獻(xiàn)中均沒有涉及本發(fā)明主題的文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一株枯草芽孢桿菌，其對煙草或蔬菜真菌病害具有防治作用，對煙草或蔬菜的生長具有促進(jìn)作用，對煙葉品質(zhì)的提高也有一定的作用。 本發(fā)明還提供了一種由該菌種培養(yǎng)制備而成的微生物制劑。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一株枯草芽孢桿菌，該菌株命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtil is，已于2008 年12月四日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏編號為 CGMCCNo. 2843。
本發(fā)明所涉及的枯草芽孢桿菌Tpl355，其分離鑒定、培養(yǎng)方法、生物特性、發(fā)酵條件等，已經(jīng)公開，記載在中國文獻(xiàn)“煙草葉圍細(xì)菌Tpb55菌株的鑒定及其抑菌活性，中國生物防治，2008，24 (1) :63-68"以及“煙草赤星病拮抗細(xì)菌Tpb55搖瓶發(fā)酵條件的篩選，中國煙草科學(xué)2009，30(1)54_57”上，在此不再贅述。一種微生物制劑，由枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis Tpb55的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis Tpb55的孢子組成；該制劑對煙草或蔬菜真菌病害具有防病促生作用。其可通過以下制備方法制備得到(1)將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis Tpb55試管種接種于肉湯培養(yǎng)基(為常規(guī)培養(yǎng)基，其配方為公知，在此不再贅述)搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；(2)將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比10%接種量接入30L種子罐， 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L、蛋白胨3g/L、MgSO4 0. 5g/ L、酵母膏1. 5g/L，牛肉膏1. 5g/L ；培養(yǎng)條件溶氧量為15-18%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度 31°C ；(3)將種子液生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐培養(yǎng)基配方為玉米粉 20g/L、豆餅粉 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，MnSO4 · H2O 10g/L ；培養(yǎng)條件溶氧量為15-18%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度31°C ；培養(yǎng)至最終生物量為109cfu/g，芽孢形成率達(dá)97%以上，發(fā)酵完成；(4)發(fā)酵完成后，培養(yǎng)液出罐，用白炭黑吸附用包裝袋裝成固體劑型。本發(fā)明的菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是從煙草葉面生境中分離篩選到的，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液對煙草赤星病、辣椒炭疽病等真菌病害病原菌有很強(qiáng)的抑制作用，對煙草赤星病、煙草黑脛病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黃瓜疫病、茄子黃萎病、大蔥紫斑病、蘆筍莖枯病等顯示出很好的防病效果，同時(shí)對煙草、辣椒、黃瓜、番茄和茄子具有良好的促生作用，因此，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌可以用于制備生物防治煙草或蔬菜真菌病害的菌劑，也可以用于制備促進(jìn)煙草或蔬菜生長的生長劑。另外，實(shí)驗(yàn)還表明，本發(fā)明的菌株對煙葉品質(zhì)的提高也有作用?？梢灶A(yù)見，本發(fā)明的菌株在煙草或蔬菜真菌病害的生物防治領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。上述描述中，所述煙草赤星病是由鏈格孢菌煙草?；?Altternaria altternata f. sp. nicotianae)引起的。所述煙草黑脛病是由寄生疫霉煙草變種 (Phytophthora parasitica var. nicotianae)引起的。所述辣椒疫病是由辣椒疫霉 (Phytophthora capsici)引起的。所述辣椒炭疽病是由辣椒刺盤孢(Colletotrichum capsici)引起的。所述番茄枯萎病是由番茄尖鐮孢菌番茄?；?Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)引起的。所述黃瓜枯萎病是由尖鐮孢菌黃瓜?；筒【?Fusarium oxysporum f. . sp. cucumerinum)弓丨起的。所述黃瓜疫病是由瓜疫霉(Phytophthora melonis)引起的。所述茄子黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的。所述大蔥紫斑病是由香蔥鏈格孢(Alternaria porri)引起的。所述蘆筍莖枯病是由天門冬擬蓬點(diǎn)霉(Phomopsis asparagi)弓丨起的。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Tpb55命名為Bacillus subtilis，已于2008年12月四日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCCNO. 2843， 保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所，郵編100101。圖1 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株對辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)菌絲的生長平板抑制作用示意圖。圖2 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株抑制煙草赤星病菌(Alternaria alternate)示意圖，圖中可見，煙草赤星病菌發(fā)生畸形，菌絲膨大呈結(jié)節(jié)狀。圖3 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株處理煙草赤星病菌(Alternaria alternate)示意圖，圖中可見，菌絲末端膨大，破裂，原生質(zhì)泄漏。圖4 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株發(fā)酵液處理煙草赤星病菌(Alternaria alternate)示意圖，圖中可見，赤星病菌分生孢子不萌發(fā)，且產(chǎn)
生囊泡。 圖5 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Tpb55 (Bacillus subtilis Tpb55)菌株發(fā)酵液處理煙草赤星病菌(Alternaria alternate)示意圖，圖中可見，分生孢子囊泡破裂，分生孢子徹底消解。圖6 煙草赤星病菌(Alternaria alternate)分生孢子正常萌發(fā)、菌絲正常生長示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1菌株對煙草和蔬菜真菌病害病原菌生長的抑制作用采用濾紙片法測定菌株Tpb55對煙草和蔬菜真菌病害病菌的拮抗作用取發(fā)酵液 20 μ 1于滅菌濾紙片上，晾干后移至燕麥培養(yǎng)基平板中央，在濾紙片四周等距離接入病原菌菌餅(ΦρΟ. 5cm)，于28°C培養(yǎng)3 4d，測定抑菌圈大小。每種靶標(biāo)菌重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。燕麥瓊脂培養(yǎng)基燕麥片30g，瓊脂20g，水lOOOmL。燕麥片加水IOOOmL,在沸水浴上加熱lh，紗布過濾后加水補(bǔ)足IOOOmL,加瓊膠熔化后分裝滅菌(12rC，20min)。結(jié)果如表1所示，可見，菌株Tpb55對煙草赤星病菌、煙草黑脛病、辣椒疫病菌、辣椒炭疽病菌、番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、黃瓜疫霉菌、茄子黃萎病菌、大蔥紫斑病菌、蘆筍莖枯病菌等病原真菌具有明顯的抑制作用。圖1所示為Tpb55菌株對辣椒炭疽病菌菌絲生長抑制作用。挑取抑菌圈邊緣菌絲顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)Tpb55菌株可以導(dǎo)致病原菌菌絲畸形、甚至消解。如圖2所示，Tpb55菌株導(dǎo)致煙草赤星病菌膨大呈結(jié)節(jié)狀，頂端形成泡囊， 泡囊破裂后發(fā)生原生質(zhì)泄漏(圖3)。 表1菌株Tpb55對植物病原真菌抑制作用
權(quán)利要求
1.一株枯草芽孢桿菌，其特征在于該菌株命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，已于2009年1月15日由中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏， 保藏編號為CGMCC No. 2843。
2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在煙草真菌病害防治中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述煙草真菌病害包括煙草赤星病，黑脛病。
4.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在蔬菜真菌病害防治中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述蔬菜真菌病害包括辣椒疫病，辣椒炭疽病，番茄葉霉病，黃瓜枯萎病，茄子黃萎病、大蔥紫斑病、蘆筍莖枯病。
6.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在促進(jìn)煙草或蔬菜生長中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述蔬菜包括黃瓜，辣椒，茄子，番茄。
8.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在改善煙葉品質(zhì)中的應(yīng)用。
9.一種微生物制劑，其特征在于由枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis Tpb55的全培養(yǎng)液培養(yǎng)物和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis Tpb55的孢子組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的微生物制劑，其特征在于其是通過以下制備方法制備得到的(1)將枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis Tpb55試管種接種于肉湯培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；(2)將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比10%接種量接入30L種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L、蛋白胨3g/L、MgSO4 0. 5g/L、 酵母膏1. 5g/L，牛肉膏1. 5g/L ；培養(yǎng)條件溶氧量為15-18%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度 31 °C ；(3)將種子液生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐培養(yǎng)基配方為 玉米粉 20g/L、豆餅粉 50g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，MnSO4 · H2O 10g/L ；培養(yǎng)條件溶氧量為 15-18%，攪拌速度200rpm，發(fā)酵溫度31°C ；培養(yǎng)至最終生物量為109cfu/g，芽孢形成率達(dá) 97%以上，發(fā)酵完成；(4)發(fā)酵完成后，培養(yǎng)液出罐，用白炭黑吸附用包裝袋裝成固體劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌，該菌株命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，已于2009年1月15日由中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏編號為CGMCC No.2843。本發(fā)明的菌株枯草芽孢桿菌是從煙草葉面生境中分離篩選到的，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，其發(fā)酵液對煙草赤星病、辣椒炭疽病等真菌病害病原菌有很強(qiáng)的抑制作用，對煙草赤星病、煙草黑脛病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黃瓜疫病、茄子黃萎病等顯示出很好的防病效果，同時(shí)對煙草、辣椒、黃瓜、番茄和茄子具有良好的促生作用，因此，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌可以用于制備生物防治煙草或蔬菜真菌病害的菌劑，也可以用于制備促進(jìn)煙草或蔬菜生長的生長劑。
文檔編號A24B15/20GK102154186SQ20111009341
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者關(guān)小紅, 孔凡玉, 張成省 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所