專(zhuān)利名稱(chēng)：球孢白僵菌菌核的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蟲(chóng)生真菌菌核的培養(yǎng)方法及其在防治害蟲(chóng)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
西花薊馬 Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera Thripidae) 是世界性的多種經(jīng)濟(jì)作物上的一種重要害蟲(chóng)。西花薊馬通過(guò)銼吸取食和傳播植物病毒對(duì)作物造成嚴(yán)重為害。西花薊馬的生活史包括地上取食階段(成蟲(chóng)，1齡和2齡若蟲(chóng))和土棲階段O齡若蟲(chóng)末期，預(yù)蛹和蛹)。大部分西花薊馬的老熟2齡若蟲(chóng)都表現(xiàn)出正趨地性和負(fù)趨光性，從植物上轉(zhuǎn)移到土壤或盆栽介質(zhì)中化蛹。依據(jù)寄主植物種類(lèi)的不同，最多有98%的薊馬在地下化蛹，并分布在1.5 2. Ocm深的土層中，直到發(fā)育為成蟲(chóng)后從土壤中羽化出來(lái)再轉(zhuǎn)移到地上為害。此外，由于反復(fù)頻繁地施用化學(xué)藥劑，該蟲(chóng)已發(fā)展出對(duì)多種化學(xué)殺蟲(chóng)劑具抗性的種群。土壤中施用蟲(chóng)生真菌是有效治理薊馬土棲階段的有效措施。球孢白僵菌 (Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin,以下簡(jiǎn)稱(chēng)白僵菌)是寄主譜廣泛的重要昆蟲(chóng)病原真菌之一，許多商用或非商用的白僵菌菌株均能引起西花薊馬的高度侵染。用蟲(chóng)生真菌防治地下害蟲(chóng)的商用興趣促進(jìn)了相應(yīng)劑型的發(fā)展。這些劑型的基礎(chǔ)是液相培養(yǎng)產(chǎn)生的菌絲或者是在營(yíng)養(yǎng)或非營(yíng)養(yǎng)載體上固相培養(yǎng)產(chǎn)生的分生孢子。這些菌絲或分生孢子通常是干旱耐受性差以及貨架壽命較短，從而限制了它們的實(shí)際應(yīng)用。為了在土壤和腐敗的植物材料中存活，許多植物病原真菌產(chǎn)生菌核，即緊密的菌絲聚集體，并以這些繁殖體作為越冬結(jié)構(gòu)。一些植物病原真菌，例如大豆炭疽病菌 Colletotrichum truncatum (Schweinitz)禾口大豆褐紅壞死病菌 Mycoleptodiscus terrestris(Gerd.)在深層液體培養(yǎng)發(fā)酵中，能夠產(chǎn)生微菌核(microsclerotia，MS)，即直徑200 600 μ m的菌核顆粒。作為真菌除草劑，這些雜草病原物的MS是土壤和水生環(huán)境中有持效侵染性的繁殖體。然而，到目前為止還沒(méi)有對(duì)防治西花薊馬土棲階段重要病原真菌-白僵菌MS培養(yǎng)與應(yīng)用的報(bào)道。以昆蟲(chóng)病原真菌菌核防治西花薊馬等害蟲(chóng)，可以簡(jiǎn)化抗蟲(chóng)制劑的生產(chǎn)工藝，降低成本，并對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，因此，具有廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)分生孢子作為昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)劑的繁殖體存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種液體培養(yǎng)蟲(chóng)生真菌菌核的技術(shù)，所述蟲(chóng)生真菌優(yōu)選為球孢白僵菌。本發(fā)明所提供的蟲(chóng)生真菌菌核的液體培養(yǎng)方法，需要將液體培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件控制在一定的范圍內(nèi)。培養(yǎng)出的菌核經(jīng)過(guò)真空干燥后，可以長(zhǎng)期貯藏，在適宜的條件下仍然能萌發(fā)出菌絲和有致病力的分生孢子，該技術(shù)成本低，菌核貯藏期長(zhǎng)，非常適合推廣普及。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)—種蟲(chóng)生真菌菌核的培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟1) 一級(jí)平板培養(yǎng)；2)孢子懸浮液的制備；幻液體培養(yǎng)菌核；4)菌核的干燥。所述蟲(chóng)生真菌包括任何昆蟲(chóng)病原真菌，優(yōu)選為球孢白僵菌。所述一級(jí)平板培養(yǎng)是真菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)待其產(chǎn)生孢子，將產(chǎn)生孢子的切成瓊脂塊，于甘油中超低溫保存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)時(shí)可在常規(guī)的真菌培養(yǎng)條件下進(jìn)行，如于室溫下( 22°C )在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周，將產(chǎn)生孢子的瓊脂平板切成Imm2的瓊脂塊，浸沒(méi)在10%甘油中于-80°C下保存。所述孢子懸浮液的制備是將冷凍貯藏的瓊脂塊接種到PDA平板上，在室溫( 220C )下培養(yǎng)2 3周，加入含有0. 1 %的聚乙二醇油酸基化合物(吐溫-80)的無(wú)菌水，無(wú)菌操作打散混勻、稀釋?zhuān)瞥涉咦討腋∫?終濃度為L(zhǎng)OXlO9L-1)備用。所述液體培養(yǎng)菌核是將步驟2、制備的孢子懸浮液接入培養(yǎng)液中(使孢子終濃度達(dá)到5 X IO6L-1)，放置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度2248°C，搖速^0-300rpm ；優(yōu)選為培養(yǎng)溫度25°C，搖速300rpm。所述菌核的干燥是將步驟3)的培養(yǎng)液中加入硅藻土(DE)，使?jié)舛冗_(dá)到 5gDE/100mL培養(yǎng)液，將MS-DE混合物抽濾到預(yù)稱(chēng)重的濾紙上，從濾紙上分離下來(lái)，用冷凍干燥機(jī)真空干燥至含水量< 5%時(shí)，冷凍密封，并于4°C貯存。上述菌核培養(yǎng)過(guò)程中所用的PDA培養(yǎng)基為常用的微生物培養(yǎng)基，其成分和含量均是公知的，可通過(guò)教科書(shū)或?qū)嶒?yàn)手冊(cè)查得。液體培養(yǎng)菌核時(shí)所用的培養(yǎng)液組成包括基礎(chǔ)鹽(g·!/1)，微量元素(yg·!/1)，復(fù)合維生素Bhg·!/1)，氮源(g.L-1)，碳源(g.L-1)和吐溫-80 (ν/ν)；其中，所述的基礎(chǔ)鹽 (g · I/1)選自=KH2PO4 0. 5-2. 0、MgS04 · 7H20 0. 5-2. 5 或 CaCl2 · 2H20 0. 01-0. 05 ；所述的微量元素(μ g · L-1)選自=H3BO3 5-30、MnSO4 · 4H20 10-50、CuSO4 · 5H20 50-80、ZnSO4 · 7H20 50-400或佝(13 · 6H20 20-500 ；所述的復(fù)合維生素B ( μ g · L-1)選自硫胺5-30、核黃素 2-15、吡哆胺0. 5-2或右旋泛酸鈣2-10;所述氮源(g · L-1)選自大豆粉5_15或玉米粉， 5-15;所述的碳源(g.L—1)是葡萄糖，5-25 ；所述的吐溫-80 (ν/ν)為0. 2-0.8% ；培養(yǎng)液的最終PH調(diào)至5. 5-7. 1。優(yōu)選為其中所述的基礎(chǔ)鹽(g · L—1)選自=KH2PO4 1. 5, MgSO4 · 7H20 0. 5 或 CaCl2 · 2H20 0. 01 ；所述的微量元素(μ g · Γ1)選自=H3BO3 30、MnSO4 · 4Η20 40、 CuSO4 · 5Η20 80、ZnSO4 · 7Η20400 或 FeCl3 · 6Η20 500 ；所述的復(fù)合維生素 B ( μ g · Γ1)選自 硫胺30、核黃素15、吡哆胺2或右旋泛酸鈣10 ；所述的氮源(g -Γ1)選自大豆粉15或玉米粉15;所述的碳源(g·!/1)為葡萄糖25 ；所述的吐溫-80 (ν/ν)為0.4-0. 8% ；培養(yǎng)液的最終PH調(diào)至6. 8。本發(fā)明還涉及通過(guò)上述培養(yǎng)方法獲得的蟲(chóng)生真菌菌核在制備防治害蟲(chóng)的生防制劑中的應(yīng)用，所述蟲(chóng)生真菌優(yōu)選球孢白僵菌，所述害蟲(chóng)優(yōu)選西花薊馬。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種防治害蟲(chóng)的生防制劑，其特征在于，包括通過(guò)上述培養(yǎng)方法獲得的蟲(chóng)生真菌菌核和輔料。所述蟲(chóng)生真菌菌核優(yōu)選球孢白僵菌菌核，所述害蟲(chóng)優(yōu)選西花薊馬；所述輔料是抗蟲(chóng)制劑制備領(lǐng)域常用的輔助試劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以根據(jù)制劑的類(lèi)型選擇相應(yīng)的輔料類(lèi)型。本發(fā)明所用的真菌菌株和蟲(chóng)源，如球孢白僵菌和西花薊馬，均屬于公知公用的實(shí)驗(yàn)材料，可通過(guò)常規(guī)的途徑獲得，如商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)等。例如，實(shí)施例中所用的球孢白僵菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所。
本發(fā)明首次用液體深層發(fā)酵法能產(chǎn)生蟲(chóng)生真菌菌核。干燥制備的微菌核能夠保持活力，復(fù)水后能夠萌發(fā)出菌絲和孢子，增加了上述真菌作為西花薊馬土棲階段防治因子的潛力。該生產(chǎn)過(guò)程工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)污染性廢料產(chǎn)生，十分環(huán)保。用該方法獲得的蟲(chóng)生真菌防治西花薊馬等害蟲(chóng)，可以減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)植物和環(huán)境的污染，對(duì)人和動(dòng)物沒(méi)有傷害，因此，本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖1在搖床上液體深層培養(yǎng)時(shí)球孢白僵菌菌核的發(fā)育。在(A) 24小時(shí)后接入的分生孢子開(kāi)始形成勻質(zhì)的菌絲。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌絲開(kāi)始聚集形成菌核；(B)Day 2 ； (C)Day 4 ； (D)Day 6。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的真菌菌株和蟲(chóng)源，如球孢白僵菌和西花薊馬，均屬于公知公用的實(shí)驗(yàn)材料，可通過(guò)常規(guī)的途徑獲得，如商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)等。例如，實(shí)施例中所用的球孢白僵菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所。實(shí)施例1球孢白僵菌菌核的培養(yǎng)1.培養(yǎng)方法1. 1 一級(jí)平板菌種培養(yǎng)將球孢白僵菌菌株于室溫下( 22°C)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周。將產(chǎn)生孢子的瓊脂平板切成Imm2的瓊脂塊，浸沒(méi)在10%甘油中于-80°C下保存。1. 2孢子懸浮液的制備液體培養(yǎng)時(shí)，將冷凍貯藏的瓊脂塊接種到PDA平板上，在室溫( 22°C )下培養(yǎng) 2 3周。加入含有0. 的聚乙二醇油酸基化合物(吐溫-80，Sigma)的無(wú)菌水，無(wú)菌操作打散混勻、稀釋?zhuān)瞥山K濃度為1. OX IO9L-1的孢子懸浮液備用。1. 3液體培養(yǎng)菌核在250mL燒杯中，裝入IOOmL培養(yǎng)液，接入孢子懸浮液，使孢子終濃度達(dá)到 5X ΙΟ6!/1，放置于恒溫?fù)u床(溫度25°C ；搖速SOOrev.mirT1)中培養(yǎng)。經(jīng)常用手搖晃燒杯， 以減少菌絲在燒杯壁上的生長(zhǎng)。并于接種后逐日顯微觀察培養(yǎng)液中生成物的形態(tài)，第6天時(shí)檢測(cè)生物量累積，孢子濃度和MS濃度。在每次實(shí)驗(yàn)中，從每個(gè)燒杯中取2次樣，每種培養(yǎng)液設(shè)置3個(gè)燒杯重復(fù)。所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次。所述培養(yǎng)液成分包括(1)基礎(chǔ)鹽(g· Γ1) =KH2PO4,1. 5、MgSO4 · 7Η20，0. 5、 CaCl2 · 2Η20，0· 01 ； (2)微量元素(μ g · Γ1) =H3BO3, 30, MnSO4 · 4H20，40、CuSO4 · 5H20，80g ； ZnSO4 · 7H20，400、FeCl3 · 6H20，500 ； (3)復(fù)合維生素 B ( μ g · Γ1)硫胺，30、核黃素，15、吡哆胺，2、右旋泛酸鈣，10; (4)氮源(g.L-1)大豆粉，15、玉米粉，15; (5)碳源(g · L-1)葡萄糖，25 ； (6)吐溫-80 (ν/ν) :0%,0. 1%、0. 2%、0. 4%、0. 6%、0. 8%、1. 0%或 1. 2%。培養(yǎng)液的最終pH調(diào)至6. 8。在試驗(yàn)中保持基礎(chǔ)鹽、微量元素、復(fù)合維生素B、碳源固定，檢測(cè)加入不同種類(lèi)氮源和不同濃度吐溫80組合后所得的結(jié)果。檢測(cè)累積的生物量時(shí)，從培養(yǎng)燒杯中取ImL培養(yǎng)液，真空過(guò)濾到預(yù)稱(chēng)重的濾紙上。 濾紙于室溫下真空干燥至穩(wěn)定重量。根據(jù)濾紙前后重量的變化計(jì)算累積的生物量。檢測(cè)微
5菌核濃度時(shí)，首先將培養(yǎng)液稀釋到適宜MS計(jì)數(shù)為度，然后取100 μ L培養(yǎng)液于玻璃載玻片上，蓋上蓋玻片。顯微計(jì)數(shù)玻片上所有的MS。只有直徑超過(guò)50 μ m，獨(dú)立的聚集菌絲體才計(jì)為MS。在培養(yǎng)液稀釋和取樣時(shí)，持續(xù)搖晃以確保均勻。檢測(cè)孢子濃度時(shí)，首先將培養(yǎng)液稀釋到適宜孢子計(jì)數(shù)為度。然后取100 μ L培養(yǎng)液于血球計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片。五點(diǎn)取樣計(jì)算孢子數(shù)。1.4菌核的干燥球孢白僵菌培養(yǎng)8d后，向培養(yǎng)液中加入硅藻土(DE)，使?jié)舛冗_(dá)到5gDE/100mL培養(yǎng)液。用循環(huán)水真空泵(SHZ-III，上海亞榮生化儀器廠)將MS-DE混合物抽濾到預(yù)稱(chēng)重的 Whatman No. M號(hào)濾紙上。將MS-DE混合物從濾紙上分離下來(lái)，用冷凍干燥機(jī)(LGJ-10D，北京四環(huán)儀器廠科學(xué)儀器有限公司)真空干燥至含水量<5%時(shí)，用封口機(jī)(上海鼎利輕工機(jī)械制造有限公司)包裝于鋁箔袋中，并于4°C貯存。2.氮源對(duì)球孢白僵菌微菌核、芽孢和生物量的影響最初的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明(表1)，在固定基礎(chǔ)鹽，復(fù)合維生素B，微量元素，碳源和 0.4%的吐溫80不變時(shí)，接入球孢白僵菌孢子懸浮液培養(yǎng)5d后，以大豆粉和玉米粉作為氮源的培養(yǎng)液，能觀察到邊緣光滑，發(fā)育良好的菌核，且兩者間數(shù)量存在顯著性差異(P < 0. 05)。表1氮源對(duì)球孢白僵菌生物量、芽孢和微菌核產(chǎn)量的影響
權(quán)利要求
1.一種蟲(chóng)生真菌菌核的培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟1) 一級(jí)平板培養(yǎng)；幻孢子懸浮液的制備；；3)液體培養(yǎng)菌核；4)菌核的干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述蟲(chóng)生真菌為球孢白僵菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟1)的一級(jí)平板培養(yǎng)是真菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)待其產(chǎn)生孢子，將產(chǎn)生孢子的切成瓊脂塊，于甘油中超低溫保存?zhèn)溆谩?br>
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟幻的孢子懸浮液的制備是將冷凍貯藏的瓊脂塊接種到PDA平板上，在室溫下培養(yǎng)2 3周，加入含有0. 的聚乙二醇油酸基化合物的無(wú)菌水，無(wú)菌操作打散混勻、稀釋?zhuān)瞥涉咦討腋∫簜溆谩?br>
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟幻的液體培養(yǎng)菌核是將步驟幻制備的孢子懸浮液接入培養(yǎng)液中，放置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度 22-28 0C，搖速 280-300rpm，優(yōu)選培養(yǎng)溫度 25 °C，搖速 300rpm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟；3)液體培養(yǎng)菌核時(shí)所用的培養(yǎng)液組成包括基礎(chǔ)鹽(g·!^1)，微量元素(μ g·!/1)，復(fù)合維生素B (μ g ·Ι^)，氮源 (g-L—1)，碳源(g·!/1)和吐溫-80(v/v)；其中，所述的基礎(chǔ)鹽(g.L—1)選自=KH2PO4O. 5-2. 0、 MgSO4 · 7H20 0. 5-2. 5 或 CaCl2 · 2H20 0. 01-0. 05 ；所述的微量元素(μ g · L—1)選自=H3BO3 5-30、MnSO4· 4H20 10-50、CuSO4· 5H20 50-80、ZnSO4· 7H20 50-400 或 FeCl3· 6H20 20-500 ； 所述的復(fù)合維生素Β(μ g · Γ1)選自硫胺5-30、核黃素2-15、吡哆胺0. 5-2或右旋泛酸鈣 2-10 ；所述氮源(g 選自大豆粉5-15或玉米粉，5-15 ；所述的碳源(g · L—1)是葡萄糖 5-25 ；所述的吐溫-80 (ν/ν)為0. 2-0. 8% ；培養(yǎng)液的最終ρΗ調(diào)至5. 5-7. 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟幻液體培養(yǎng)菌核時(shí)所用的培養(yǎng)液組成包括基礎(chǔ)鹽(g · L-1)，微量元素(μ g · L-1)，復(fù)合維生素B ( μ g · L-1)，氮源 (g.L—1)，碳源(g.L-1)和吐溫-80(v/v)；其中所述的基礎(chǔ)鹽(g.L-1)選自=KH2PO4 1.5、 MgSO4 ·7Η200· 5 或CaCl2 ·2Η20 0. 01 ；所述的微量元素(μ g .Γ1)選自=H3BO3 30,MnSO4 ·4Η20 40、CuSO4 · 5Η20 80、ZnSO4 · 7Η20 400 或 FeCl3 · 6Η20 500 ；所述的復(fù)合維生素 B (μ g · Γ1) 選自硫胺30、核黃素15、吡哆胺2或右旋泛酸鈣10;所述的氮源(g·!/1)選自大豆粉15 或玉米粉15 ；所述的碳源(g · Γ1)為葡萄糖25 ；所述的吐溫-80 (ν/ν)為0. 4-0. 8% ；培養(yǎng)液的最終PH調(diào)至6. 8。
8.用上述權(quán)利要求1-7之一所述培養(yǎng)方法獲得的蟲(chóng)生真菌菌核在制備防治害蟲(chóng)的生防制劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是所述蟲(chóng)生真菌為球孢白僵菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征是所述害蟲(chóng)為西花薊馬。
11.一種防治害蟲(chóng)的生防制劑，其特征是，包括通過(guò)上述權(quán)利要求1-7之一所述培養(yǎng)方法獲得的蟲(chóng)生真菌菌核和輔料。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的生防制劑，其特征是，所述蟲(chóng)生真菌菌核為球孢白僵菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的生防制劑，其特征是，所述害蟲(chóng)為西花薊馬。
全文摘要
針對(duì)分生孢子作為昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)劑的繁殖體存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種液體培養(yǎng)蟲(chóng)生真菌菌核的技術(shù)，所述蟲(chóng)生真菌可以是球孢白僵菌。本發(fā)明所提供的蟲(chóng)生真菌菌核的液體培養(yǎng)方法，需要將液體培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件控制在一定的范圍內(nèi)。培養(yǎng)出的菌核經(jīng)過(guò)真空干燥后，可以長(zhǎng)期貯藏，在適宜的條件下仍然能萌發(fā)出菌絲和有致病力的分生孢子。干燥制備的微菌核能夠保持活力，復(fù)水后能夠萌發(fā)出菌絲和孢子，增加了白僵菌作為西花薊馬土棲階段生防因子的潛力。該技術(shù)成本低，菌核貯藏期長(zhǎng)，非常適合推廣普及。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102206587SQ20111010166
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者王海鴻, 問(wèn)錦曾, 雷仲仁 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所