專利名稱：通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法
通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，特別涉及矮牽牛通過花藥培養(yǎng)獲得再生植株的方法。
技術(shù)背景
矮牽牛(Petunia hybrida Vilm)，又名碧科茄、靈芝牡丹，屬茄科矮牽牛屬的多年生草本植物，因其色彩豐富艷麗、品種繁多、花色多變、花期長、適應(yīng)性強、粗放型管理，是當(dāng)前我國優(yōu)良的重要花壇綠化草花，亦可以作盆栽花卉。矮牽牛較為耐熱是我國夏秋季節(jié)常用的綠化草花。由于矮牽牛具有明顯的雜種優(yōu)勢，觀賞性強，目前市面上銷售的矮牽牛種子多為Fl代，并且主要從國外進(jìn)口。利用雜交優(yōu)勢進(jìn)行雜交育種的關(guān)鍵是獲得優(yōu)良性狀的純系父母本(自交系)。為了獲得自交系，按常規(guī)的自交方法，需要耗費大量的田間土地、時間和勞力，一般需要5-6年的時間，而且手續(xù)十分繁瑣，最終的純度也不夠理想。而采用花藥培養(yǎng)獲得單倍體再加倍的方法，只需1年時間就可以獲得和多代自交效果相同的純系，可以極大地縮短雜交育種年限，提高育種效率(王成社，西安聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)自版)， 2000,3(4) :7-10)。目前，有關(guān)矮牽牛花藥培養(yǎng)的研究在國外有一定的研究基礎(chǔ)，但在國內(nèi)僅有3篇相關(guān)的論文報道，并且再生率相當(dāng)?shù)?。此外，筆者按照其所述方法并沒有得到經(jīng)花藥培養(yǎng)的矮牽牛再生植株。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法， 通過本發(fā)明可對矮牽牛進(jìn)行花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株，再經(jīng)常規(guī)的秋水仙素加倍或經(jīng)自然加倍能夠產(chǎn)生純合自交系，可為矮牽牛通過雜交獲得Fl代種子提供優(yōu)良的親本材料。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法，依次包括以下步驟
A)、低溫預(yù)處理和消毒選取矮牽?；ɡ?，并于3 7°C中進(jìn)行低溫預(yù)處理2 4 天；低溫預(yù)處理后進(jìn)行消毒處理；
B)、將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝?nèi)セㄝ嗪突ò?，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上；培養(yǎng)溫度為25士 1°C，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)；每13 17天更換一次新鮮的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基，待愈傷組織形成后將愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)至少2次；
C)、將步驟B)繼代培養(yǎng)所得的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化培養(yǎng)；培養(yǎng)室溫度25士 1°C，光照培養(yǎng)，光照強度為180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時間為 13 1 ( 一般可選擇在5 00-19 00進(jìn)行光照)；當(dāng)所得的不定芽達(dá)到3 5cm時，停止分化培養(yǎng)；
上述分化培養(yǎng)一般需要4 6周，此時會形成較多的芽叢；
D、再生苗的生根培養(yǎng)
將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，直至小苗上長出至少3條且長度> 2cm的不定根(一般需要20天左右)；得可出瓶種植的種苗，該可出瓶種植的種苗為再生植株；培養(yǎng)條件25士 1°C，需光培養(yǎng)，光照強度為200 300mol m_2 · s—1 ；
上述步驟Α) D)均在無菌環(huán)境中進(jìn)行。
作為本發(fā)明的通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法的改進(jìn)
誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. 5 2. 0mg/L6-BA+0. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 為 5·8 ；
上述誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的制備方法為在每L Nitsch基本培養(yǎng)基上添加7g的瓊脂、20g 的麥芽糖、0. 5 2. Omg 的 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤，6-Benzylaminopurine)、0. 2mg 的 2，4-DQ，4- 二氯苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid)和 0. 5mg 的 ΝΑΑ(α -萘乙酸，1-naphthlcetic acid)；然后用濃度為lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)PH值為5.8。
分化培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. 1 0. 5mg/ LIBA+1. 0 2. Omg/L 6-BA+ 水解酪蛋白 0. 5g/L, pH 為 5. 8 ；或者為Nitsch 基本培養(yǎng)基 +7g/L 瓊脂 +20g/L 麥芽糖 +0. 1 0. 5mg/L IBA+1. 0 2. Omg/L TDZ(噻苯隆， thidiazuron) + 水解酪蛋白 0. 5g/L, pH 為 5. 8 ；
上述該分化培養(yǎng)基的制備方法為在每L Nitsch基本培養(yǎng)基上添加7g的瓊脂、 20g 的麥芽糖、0. 1 0. 5mg 的 IBA (吲哚丁酸，3-indolebutyric acid)、1. 0 2. Omg 的 6-BA 和0. 5g水解酪蛋白，然后用濃度為lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為 5. 8 ；或者為在每L Nitsch基本培養(yǎng)基上添加7g的瓊脂、20g的麥芽糖、0. 1 0. 5mg的 IBA、1. 0 2. Omg的TDZ和0. 5g水解酪蛋白，然后用濃度為lmol/L的NaOH溶液或lmol/L 的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5. 8 ；
生根培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值為 5.8 ；
上述生根培養(yǎng)基的制備方法為在每L Nitsch基本培養(yǎng)基上添加7g瓊脂、30g蔗糖、0. 2mg的NAA，然后用濃度為lmol/L的NaOH溶液或lmol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為5. 8。
作為本發(fā)明的通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟A) 中低溫預(yù)處理和消毒為依次進(jìn)行以下步驟
1)、在晴天的上午，選取縱徑長度在0. 8cm 1. 3cm的矮牽牛的花蕾，
2)、將上述花蕾裝入塑料袋中，放入3 7°C冰箱中低溫預(yù)處理2 4天；
3)、將上述低溫預(yù)處理后的花蕾先放在自來水下沖洗，再用蒸餾水沖洗2 4次后用吸水紙吸干水分；然后放在超凈工作臺上，用體積濃度為70 80%的酒精滅菌0. 5 1. 5min ；接著用無菌蒸餾水沖洗2 4次后用質(zhì)量濃度為0. 05 0. 15 %的HgCl2溶液進(jìn)行消毒8 12min，消毒完后用無菌蒸餾水沖洗3 5次。
通過本發(fā)明方法獲得的矮牽牛再生植株，連同步驟D)所用的培養(yǎng)容器(例如培養(yǎng)瓶)以及培養(yǎng)容器內(nèi)原裝有的生根培養(yǎng)基一起從培養(yǎng)室內(nèi)取出后放入溫室內(nèi)進(jìn)行煉苗， 此時先不打開培養(yǎng)容器的蓋子，2 3天后打開蓋子(即敞開瓶口)，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培養(yǎng)基上有一層水即可)煉苗2 3天后進(jìn)行移栽，溫室內(nèi)的環(huán)境為 25士2°C，自然光照。
在本發(fā)明中，所用到的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基(為配制完成后的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基、 分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基)、蒸餾水以及花蕾消毒滅菌用裝置要在使用前進(jìn)行滅菌，滅菌條件在1. 1個大氣壓、121°c條件下滅菌20分鐘。
本發(fā)明對矮牽牛的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，花藥內(nèi)小孢子發(fā)育為單倍體植株，單倍體植株經(jīng)染色體加倍，只需一個世代就可獲得遺傳上穩(wěn)定的純系，與常規(guī)自交方法獲得遺傳穩(wěn)定純系需6-7代時間相比，采用花藥培養(yǎng)獲得單倍體而獲得純系是有效加速育種材料的純化與育種進(jìn)程的一條途徑，可以極大地縮短雜交育種年限，提高育種效率。
本發(fā)明中經(jīng)花藥培養(yǎng)獲得再生植株實為矮牽牛單倍體和雙倍體(或多倍體)的混合植株。諸多研究表明植物花藥培養(yǎng)的后代是不同倍植株的混合體(花藥培養(yǎng)成的單倍體植株多經(jīng)自然加倍成二倍體或多倍體)，我們在研究中發(fā)現(xiàn)獲得的再生植株有一些生長正常，形態(tài)表現(xiàn)為莖桿較粗、葉片較大(圖1A)，而有一些植株生長徒長，形態(tài)表現(xiàn)為莖桿很細(xì)、葉片較小(圖1B)。對兩種類型的植株進(jìn)行根尖細(xì)胞染色體鏡檢分析表明A植株的染色體數(shù)為7條，而B植株為2n = 2X = 14條染色體。同時通過流式細(xì)胞儀分別對花藥培養(yǎng)原植株和花藥培養(yǎng)獲得再生植株的細(xì)胞DNA含量分析也表明矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)獲得的再生植株為單倍體和雙倍體(或多倍體)的混合體。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
圖1是本發(fā)明所獲得的矮牽牛不同倍性的植株。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
實施例1、一種通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法，依次進(jìn)行以下步驟
Α)低溫預(yù)處理和消毒，依次進(jìn)行以下步驟
1)、所選用的矮牽牛材料為梅林系列紅色，于12月份播種育苗，次年4月下旬開始，在晴天的上午，選取縱徑長度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾(此時期的花蕾多處于單核靠邊期)，
2)、將上述花蕾裝入塑料袋中，放入5°C冰箱中低溫預(yù)處理2天；
3)、將上述低溫預(yù)處理后的花蕾先放在自來水下沖洗5min，再用蒸餾水沖洗3次后用吸水紙吸干水分；然后放在超凈工作臺上，用體積濃度為75%的酒精滅菌Imin ；接著用無菌蒸餾水沖洗3次后用質(zhì)量濃度為0. 1 %的HgCl2溶液進(jìn)行消毒lOmin，消毒完后用無菌蒸餾水沖洗4次。
B)、在超凈工作臺上，將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝?nèi)セㄝ嗪突ò辏〕龌ㄋ?，將花藥去凈花絲后接種在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)；培養(yǎng)室溫度為25士 1°C，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)；每15天更換一次新鮮的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基，待愈傷組織(即初代愈傷組織)形成后，及時將愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)2次， 繼代培養(yǎng)條件同上，此時可形成比較多的淡綠色、質(zhì)地較硬的愈傷組織。
所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖 +0. 5mg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 為 5.8。
上述初代愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)一般需20 30天，繼代培養(yǎng)每次需要30天左右。
C)、將步驟B)繼代培養(yǎng)所得的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化；培養(yǎng)室溫度25士 1°C，光照培養(yǎng)，光照強度為180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時間為 14h (5:00-19:00，其余時間為暗培養(yǎng))；當(dāng)所得的不定芽達(dá)到3 5cm時，停止分化培養(yǎng)；
上述分化培養(yǎng)的時間一般需要4 6周；
上述分化培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. lmg/L IBA+1. Omg/L TDZ+ 水解酪蛋白 0. 5g/L，pH 值為 5. 8。
D)、再生苗的生根培養(yǎng)
將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，直至小苗上長出至少3條且長度彡2cm的不定根(需要20天左右)；得可出瓶種植的種苗，該可出瓶種植的種苗即為再生植株；培養(yǎng)條件25士小時需光培養(yǎng)，光照強度為200 250mol m_2 · s—1 ；
生根培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值為 5. 8。
上述步驟A) D)均在無菌環(huán)境中進(jìn)行。
該例愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)40 %，愈傷組織分化率可達(dá)45 %。
注誘導(dǎo)率=(形成愈傷組織的花藥數(shù)/接種的花藥總數(shù))X 100%。
分化率=(分化出芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))X 100%。
將上述實施例1所得的再生植株(即可出瓶種植的種苗)連同培養(yǎng)瓶(包括培養(yǎng)瓶內(nèi)的生根培養(yǎng)基)從培養(yǎng)室內(nèi)取出放在溫室內(nèi)進(jìn)行煉苗，此時不打開瓶蓋，2-3天后敞開瓶口，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培養(yǎng)基上有一層水即可)煉苗2-3天后進(jìn)行移栽，溫室內(nèi)的環(huán)境為25士2°C，自然光照。
在溫室內(nèi)對矮牽牛再生苗進(jìn)行移栽，移栽時洗去根部的培養(yǎng)基，將苗移栽到營養(yǎng)缽中(土質(zhì)為營養(yǎng)土和珍珠巖重量比例為8 1)。待小苗長到5cm以上高度(一般需要 20 30天)時，帶基質(zhì)移栽至6 X IOcm的塑料花盆中，并放于單體棚中，單體棚的環(huán)境為 自然光照，溫度25-30°C。移栽后要適當(dāng)遮蔭并定時澆水，成活率可達(dá)70%以上。注成活率指的是培養(yǎng)瓶中的小苗移到花盆中，在田間種植最后的成活率。
實施例2、一種通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法，依次進(jìn)行以下步驟
A)、低溫預(yù)處理和消毒，依次進(jìn)行以下步驟
1)、所選用的矮牽牛材料為梅林系列藍(lán)色，于12月份播種育苗，次年4月下旬開始，在晴天的上午，選取縱徑長度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾(此時期的花蕾多處于單核靠邊期)，
2)、將上述花蕾裝入塑料袋中，放入5°C冰箱中低溫預(yù)處理3天；
3)、將上述低溫預(yù)處理后的花蕾先放在自來水下沖洗5min，再用蒸餾水沖洗3次后用吸水紙吸干水分；然后放在超凈工作臺上，用體積濃度為75%的酒精滅菌Imin ；接著用無菌蒸餾水沖洗3次后用質(zhì)量濃度為0. 1 %的HgCl2溶液進(jìn)行消毒lOmin，消毒完后用無菌蒸餾水沖洗4次。
B)、在超凈工作臺上，將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝?nèi)セㄝ嗪突ò?，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)；培養(yǎng)室溫度為25士 1°C，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)；每15天更換一次新鮮的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基，待愈傷組織(即初代愈傷組織)形成后，及時將愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)2次， 繼代培養(yǎng)條件同上，此時可形成比較多的淡綠色、質(zhì)地較硬的愈傷組織。
所用的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖 +1. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 為 5.8。
上述初代愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)一般需20 30天，繼代培養(yǎng)每次需要30天左右。
C)、將步驟B)繼代培養(yǎng)所得的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化；培養(yǎng)室溫度25士 1°C，光照培養(yǎng)，光照強度為180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時間為 14h (5:00-19:00，其余時間為暗培養(yǎng))；當(dāng)所得的不定芽達(dá)到3 5cm時，停止分化培養(yǎng)；
上述分化培養(yǎng)的時間一般需要4 6周；
上述分化培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0.5mg/L IBA+1. Omg/L 6-BA+ 水解酪蛋白 0. 5g/L，pH 值為 5. 8。
D)、再生苗的生根培養(yǎng)
將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，直至小苗上長出至少3條且長度彡2cm的不定根(需要20天左右)；得可出瓶種植的種苗，該可出瓶種植的種苗即為再生植株；培養(yǎng)條件25士小時需光培養(yǎng)，光照強度為220 MOmol m_2 · s—1 ；
生根培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值為 5. 8。
上述步驟A) D)均在無菌環(huán)境中進(jìn)行。
該例愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)35 %，愈傷組織分化率可達(dá)30 %。
將上述實施例2所得的再生植株(即可出瓶種植的種苗)連同培養(yǎng)瓶(包括培養(yǎng)瓶內(nèi)的生根培養(yǎng)基)從培養(yǎng)室內(nèi)取出放在溫室內(nèi)進(jìn)行煉苗，此時不打開瓶蓋，2-3天后敞開瓶口，并加入少量水(加水的量一般控制在生根培養(yǎng)基上有一層水即可)煉苗2-3天后進(jìn)行移栽，溫室內(nèi)的環(huán)境為25士2°C，自然光照。
在溫室內(nèi)對矮牽牛再生苗進(jìn)行移栽，移栽時洗去根部的培養(yǎng)基，將苗移栽到營養(yǎng)缽中(土質(zhì)為營養(yǎng)土和珍珠巖重量比例為8 1)。待小苗長到5cm以上高度(一般需要 20 30天)時，帶基質(zhì)移栽至6 X IOcm的塑料花盆中，并放于單體棚中，單體棚的環(huán)境為 自然光照，溫度25-30°C。移栽后要適當(dāng)遮蔭并定時澆水，成活率可達(dá)70%以上。
實施例3、將實施例1步驟C中的分化培養(yǎng)基改成=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂 +20g/L麥芽糖+0. lmg/L IBA+1. Omg/L 6-BA+水解酪蛋白 0. 5g/L，pH值為 5. 8。即將 1. Omg/ LTDZ改成了 1. Omg/L 6-BA。其余同實施例1。
所得結(jié)果為
該例愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)40%，愈傷組織分化率可達(dá)33%。成活率可達(dá)70%以上。
對比例1、將實施例1中的選取縱徑長度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾改成選取徑長度在 1. 4cm-1. 6cm的花蕾；其余同實施例1。
所得結(jié)果為不能獲得花藥愈傷組織。
對比例2、將實施例1中的選取縱徑長度在0. 8cm-l. 3cm的花蕾改成選取徑長度在0. 5cm-0. 7cm的花蕾；其余同實施例1。
所得結(jié)果為不能獲得花藥愈傷組織。
對比例3、將實施例1步驟A)中的放入5°C冰箱中進(jìn)行低溫預(yù)處理2天改成放入 8°C冰箱中進(jìn)行低溫預(yù)處理2天；其余同實施例1。
所得結(jié)果為
該例愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)35%，愈傷組織分化率可達(dá)40%。
對比例4、將實施例1步驟A中的放入5°C冰箱中進(jìn)行低溫預(yù)處理2天改成放入 2°C冰箱中進(jìn)行低溫預(yù)處理2天；其余同實施例1。
所得結(jié)果為
該例愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)18 %，愈傷組織分化率可達(dá)30 %。
對比例5、將實施例1步驟C)分化培養(yǎng)基中的麥芽糖改成蔗糖(濃度不變)；其余同實施例1。
所得結(jié)果為
該例愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)40 %，愈傷組織分化率可達(dá)15 %。
對比例6、將實施例1步驟B)的誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中的6-BA改成IBA (濃度不變)； 其余同實施例1。
所得結(jié)果為不能獲得花藥愈傷組織。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法，其特征是依次包括以下步驟A)、低溫預(yù)處理和消毒選取矮牽?；ɡ伲⒂? 7°C中進(jìn)行低溫預(yù)處理2 4天；低溫預(yù)處理后進(jìn)行消毒處理；B)、將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝?nèi)セㄝ嗪突ò?，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上；培養(yǎng)溫度為25士 1°C，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)；每13 17天更換一次新鮮的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基，待愈傷組織形成后將愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)至少2次；C)、將步驟B)繼代培養(yǎng)所得的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化；培養(yǎng)室溫度25士 1°C，光照培養(yǎng)，光照強度為180 220μπιΟ1 · m_2 · s—1，光照時間為13 15h ； 當(dāng)所得的不定芽達(dá)到3 5cm時，停止分化培養(yǎng)；D)、再生苗的生根培養(yǎng)將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，直至小苗上長出至少3條且長度> 2cm的不定根；得可出瓶種植的種苗，所述可出瓶種植的種苗為再生植株；培養(yǎng)條件25 士 1°C，需光培養(yǎng)，光照強度為200 300mol πΓ2 · s—1 ；上述步驟Α) D)均在無菌環(huán)境中進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法，其特征是所述誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. 5 2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L NAA,pH 為 5·8 ；所述分化培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+7g/L瓊脂+20g/L麥芽糖+0. 1 0. 5mg/ LIBA+1. 0 2. Omg/L 6-BA+水解酪蛋白0. 5g/L，pH為5. 8 ；或者為=Nitsch基本培養(yǎng)基 +7g/L 瓊脂 +20g/L 麥芽糖 +0. 1 0. 5mg/L IBA+1. 0 2. Omg/L TDZ+ 水解酪蛋白 0. 5g/L， PH 為 5. 8 ；所述生根培養(yǎng)基為=Nitsch基本培養(yǎng)基+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 2mg/L, pH值為 5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法，其特征是所述步驟A)中低溫預(yù)處理和消毒為依次進(jìn)行以下步驟1)、在晴天的上午，選取縱徑長度在0.8cm 1. 3cm的花蕾；2)、將上述花蕾裝入塑料袋中，放入3 7°C冰箱中低溫預(yù)處理2 4天；3)、將上述低溫預(yù)處理后的花蕾先放在自來水下沖洗，再用蒸餾水沖洗2 4次后用吸水紙吸干水分；然后放在超凈工作臺上，用體積濃度為70 80%的酒精滅菌0. 5 1. 5min ；接著用無菌蒸餾水沖洗2 4次后用質(zhì)量濃度為0. 05 0. 15 %的HgCl2溶液進(jìn)行消毒8 12min，消毒完后用無菌蒸餾水沖洗3 5次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過花藥培養(yǎng)獲得矮牽牛再生植株的方法，依次包括以下步驟A)、矮牽牛花蕾低溫預(yù)處理和消毒；B)、將步驟A)所得的花蕾用鑷子剝?nèi)セㄝ嗪突ò?，取出花藥，將花藥去凈花絲后接種在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上；C)、將步驟B)繼代培養(yǎng)所得的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化；當(dāng)所得的不定芽達(dá)到3～5cm時，停止分化培養(yǎng)；D)、將步驟C)所得的不定芽作為小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，直至小苗上長出至少3條且長度≥2cm的不定根；得可出瓶種植的種苗；上述步驟A)～D)均在無菌環(huán)境中進(jìn)行。
文檔編號A01H4/00GK102499091SQ201110351730
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者傅巧娟, 劉輝, 沈國正, 沈蓮佳, 陳一 申請人:杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院