專利名稱：通過花藥培養(yǎng)獲得洋桔梗再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過花藥培養(yǎng)獲得洋桔梗再生植株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
洋桔梗(Eustoma grandif lorum)為龍膽科觀賞植物，原產(chǎn)于北美洲，其株態(tài)輕盈， 花色典雅，花形別致，莖桿葉片光潔動(dòng)人，是近年來國際上流行的一種高檔切花。其種源主 要是從國外進(jìn)口 Fl雜種，價(jià)格昂貴，給洋桔梗切花生產(chǎn)帶來很多困難。
發(fā)明內(nèi)容
為解決Fl雜種需進(jìn)口，洋桔梗切花難以生產(chǎn)等問題，本發(fā)明提供一種通過花藥培 養(yǎng)獲得洋桔梗再生植株的方法。通過本發(fā)明可對(duì)洋桔梗進(jìn)行花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株，再 經(jīng)秋水仙素加倍處理能夠產(chǎn)生純合自交系，可為Fl代種子生產(chǎn)提供優(yōu)良的親本材料。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成一種通過花藥培養(yǎng)獲得洋桔梗再生植株的方法， 其特征在于經(jīng)過下列工藝步驟A.將經(jīng)過預(yù)處理的花蕾滅菌后切除花冠，剝出花藥，除去花絲，將花藥接種在 MS+0. 5 3mg/L的ΚΤ+0. 5 3mg/L的2，4_D，pH為5. 5 6. O的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng) 度為1500 20001x，光照時(shí)間為8 12小時(shí)/天，溫度為20 28°C條件下，培養(yǎng)20 40天，取出，放入上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，如此反復(fù)培養(yǎng)至花藥上長出愈傷組織；B.將A中繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于MS+0. 5 3mg/L的ΚΤ+0. 1 0. 5mg/L的NAA， pH為5. 5 6. 0的分化培養(yǎng)基上，在溫度為20 28°C，光照強(qiáng)度為1500 20001x，光照 時(shí)間為8 12小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)20 40天，使愈傷組織分化出芽，未分化的愈傷 組織繼續(xù)放入上述相同分化培養(yǎng)基上，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至分化出芽；C.將B中分化出的芽置于MS+0. 1 0. 5mg/L的ΒΑ+0. 1 0. 5mg/L的NAA，pH為 5. 5 6. 0的繁殖培養(yǎng)基上，在溫度為20 28°C，光照強(qiáng)度為1500 20001x，光照時(shí)間 為8 12小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)20 40天，即獲得花藥培養(yǎng)的洋桔梗再生植株。所述A中的花蕾預(yù)處理經(jīng)過下列步驟(1)于冬季選洋桔梗材料，取其花蕾；(2)將花蕾裝入塑料袋中，放入3 6°C冰箱中2 4天； (3)花蕾用體積濃度為75 %的酒精消毒30 60秒，再用質(zhì)量濃度為0. 05 0. 2 % 的HgC12消毒10 20分種，最后用無菌水沖洗2 4次，吸干花蕾上的水分，得預(yù)處理滅 菌的花蕾。所述A中的花蕾為花萼等長于花冠或者花萼稍長于花冠的花蕾。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果通過本發(fā)明之方法對(duì)洋桔?；ㄋ庍M(jìn) 行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)洋桔梗基因型成功率達(dá)100 %，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)35 100 %，愈傷組織分化 率為8 23%，分化植株最高可達(dá)28株/愈傷組織，為洋桔梗單倍體植株的獲得提供了可 靠技術(shù)支持，進(jìn)而有望解決生產(chǎn)洋桔梗切花困難、成本高等問題。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。實(shí)施例1A.所用洋桔梗材料為‘Ceremony Orange’，取花萼與花冠等長的花蕾；將花蕾送冰箱內(nèi)于;TC放置4天；取出花蕾用體積濃度為75%的酒精消毒30秒，再用質(zhì)量濃度為 0.2%的HgC12消毒10分種，最后用無菌水沖洗3次，用經(jīng)過高壓滅菌處理的濾紙吸干花蕾 上的水分；將花蕾切除花冠，剝出花藥，除去花絲后，接種在MS+0. 5mg/L的KT+0. 5mg/L的 2,4-D, pH為5. 5的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度為15001x，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，溫度 20°C，培養(yǎng)40天，取出，放入新的與上述相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上至花藥長出愈傷組織，切下愈 傷組織，未長愈傷組織的花藥繼續(xù)在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng) 至長出愈傷組織；B.將A中繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于MS+0. 5mg/L的KT+0. lmg/L的NAA，pH為5. 5 的分化培養(yǎng)基上，在溫度20°C，光照強(qiáng)度為15001x，光照12小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)40天， 從愈傷組織分化出芽，未分化的愈傷組織再放入相同配方的上述分化培養(yǎng)基上、在相同培 養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)分化出芽；C.將B中分化出的芽置于MS+0. lmg/L的BA+0. lmg/L的NAA，pH為5. 5的繁殖培 養(yǎng)基上，在溫度為20°C，光照強(qiáng)度為15001χ，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，培養(yǎng)40天，即獲得 花藥培養(yǎng)的洋桔梗再生植株。該實(shí)施例的愈傷誘導(dǎo)率達(dá)77. 3%，愈傷組織分化率為12. 1 %。實(shí)施例2Α.選洋桔梗材料‘Art Peach’，取花萼稍長于花冠的花蕾；將花蕾放入冰箱中于 6°C放置2天；取出花蕾用體積濃度為75%的酒精消毒60秒，再用質(zhì)量濃度為0. 05%的 HgC12消毒20分種，最后用無菌水沖洗2次，用經(jīng)過高壓滅菌處理的濾紙吸干花蕾上的水 分；將花蕾切除花冠，剝出花藥，除去花絲，將花藥接種在MS+3mg/L的KT+3mg/L的2，4_D， PH為6.0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為8小時(shí)/天，溫度28°C，培 養(yǎng)20天，取出，放入上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上至花藥長出愈傷組織，切下愈傷組織，未長愈傷組織 的花藥繼續(xù)在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)至長出愈傷組織；B.將A中繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于MS+3mg/L的KT+0. 5mg/L的NAA，pH為6. 0的 分化培養(yǎng)基上，在溫度28°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照8小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)20天，從 愈傷組織分化出芽，未分化的愈傷組織繼續(xù)放入相同配方的上述分化培養(yǎng)基上，在相同培 養(yǎng)條件下繼續(xù)分化出芽；C.將B中分化出的芽置于MS+0. 5mg/L的BA+0. 5mg/L的NAA，pH為6. 0的繁殖培 養(yǎng)基上，在溫度為28°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為8小時(shí)/天，培養(yǎng)20天，即獲得花 藥培養(yǎng)的洋桔梗再生植株。該例愈傷誘導(dǎo)率達(dá)100 %，愈傷組織分化率為15.6%。實(shí)施例3A.選洋桔梗材料‘Cessna White’，取花萼稍長于花冠的花蕾；將花蕾放入冰箱內(nèi) 于4°C放置3天；花蕾用體積濃度為75%的酒精消毒40秒，再用質(zhì)量濃度為0. 1 %的HgC12消毒15分種，最后用無菌水沖洗4次，用經(jīng)過高壓滅菌處理的濾紙吸干花蕾上的水分；將花蕾切除花冠，剝出花藥，除去花絲，將花藥接種在MS+lmg/L的KT+lmg/L的2，4_D，pH為5. 8 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度為18001x，光照時(shí)間為10小時(shí)/天，溫度25°C，培養(yǎng)30天， 取出，放入上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上至花藥長出愈傷組織，切下愈傷組織，未長愈傷組織的花藥繼 續(xù)在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)至長出愈傷組織；B.將A中繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于MS+1. 2mg/L的KT+0. 3mg/L的NAA，pH為5. 8 的分化培養(yǎng)基上，在溫度25°C，光照強(qiáng)度為ISOOlx,光照10小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)30天， 從愈傷組織分化出芽，未分化的愈傷組織繼續(xù)放入相同配方的上述分化培養(yǎng)基上，在相同 培養(yǎng)條件下繼續(xù)分化出芽；C.將B中分化出的芽置于MS+0. 2mg/L的BA+0. 2mg/L的NAA，pH為5. 8的繁殖培 養(yǎng)基上，在溫度為25°C，光照強(qiáng)度為18001χ，光照時(shí)間為10小時(shí)/天，培養(yǎng)30天，即獲得 花藥培養(yǎng)的洋桔梗再生植株。該例愈傷誘導(dǎo)率達(dá)92.3%，愈傷組織分化率為17.7%。實(shí)施例4Α.選洋桔梗材料‘Cessna Green’，取花萼稍長于花冠的花蕾；將花蕾放入冰箱內(nèi) 于4°C放置2天；取出花蕾用體積濃度為75%的酒精消毒50秒，再用質(zhì)量濃度為0. 的 HgC12消毒15分種，最后用無菌水沖洗3次，用經(jīng)過高壓滅菌處理的濾紙吸干花蕾上的水 分；將花蕾切除花冠，剝出花藥，除去花絲，將花藥接種在MS+2mg/L的KT+2mg/L的2，4_D， PH為5. 5的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為10小時(shí)/天，溫度25°C，培 養(yǎng)30天，取出，放入上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上至花藥長出愈傷組織，切下愈傷組織，未長愈傷組織 的花藥繼續(xù)在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)至長出愈傷組織；B.將A中繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于MS+1. Omg/L KT+0. 5mg/L NAA, pH為5. 5的分 化培養(yǎng)基上，在溫度25°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照10小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)30天，從 愈傷組織分化出芽，未分化的愈傷組織繼續(xù)放入相同配方的上述分化培養(yǎng)基上，在相同培 養(yǎng)條件下繼續(xù)分化出芽；C.將B中分化出的芽置于MS+0. 3mg/L BA+0. lmg/L NAA, pH為5. 5的繁殖培養(yǎng)基 上，在溫度為25°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為10小時(shí)/天，培養(yǎng)30天，即獲得花藥
培養(yǎng)的洋桔梗再生植株。該例愈傷誘導(dǎo)率達(dá)85.7%，愈傷組織分化率為22.2%。實(shí)施例5A.選洋桔梗材料‘Volet Spring’，取花萼等長于花冠的花蕾；將花蕾于4°C冰箱 中放置2天；取出花蕾用體積濃度為75%的酒精消毒30秒，再用質(zhì)量濃度為0. 2%的HgC12 消毒10分種，最后用無菌水沖洗2次，用經(jīng)過高壓滅菌處理的濾紙吸干花蕾上的水分；將花 蕾切除花冠，剝出花藥，除去花絲，將花藥接種在MS+3mg/L KT+lmg/L 2，4_D，pH為6. 0的 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為8小時(shí)/天，溫度25°C，培養(yǎng)40天，花藥 長出愈傷組織，切下愈傷組織，未長愈傷組織的花藥繼續(xù)在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，相同培養(yǎng) 條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)至長出愈傷組織；B.將A中繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于MS+1. Omg/L KT+0. 3mg/L NAA, pH為6. 0的分 化培養(yǎng)基上，在溫度25°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照12小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)40天，從愈傷組織分化出芽，未分化的愈傷組織繼續(xù)放入相同配方的上述分化培養(yǎng)基上，在相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)分化出芽；C.將B中分化出的芽置于MS+0. 4mg/L BA+0. 2mg/L NAA, pH為6. 0的繁殖培養(yǎng)基 上，在溫度為25°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，培養(yǎng)30天，即獲得花藥
培養(yǎng)的洋桔梗再生植株。該例愈傷誘導(dǎo)率達(dá)69. 2 %，愈傷組織分化率為14. 3 %。
權(quán)利要求
一種通過花藥培養(yǎng)獲得洋桔梗再生植株的方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟A.將經(jīng)過預(yù)處理的花蕾滅菌后切除花冠，剝出花藥，除去花絲，將花藥接種在MS+0.5～3mg/L的KT+0.5～3mg/L的2，4-D，pH為5.5～6.0的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為8～12小時(shí)/天，溫度為20～28℃條件下，培養(yǎng)20～40天，取出，放入上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，如此反復(fù)培養(yǎng)至花藥上長出愈傷組織；B.將A中繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于MS+0.5～3mg/L的KT+0.1～0.5mg/L的NAA，pH為5.5～6.0的分化培養(yǎng)基上，在溫度為20～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為8～12小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)20～40天，使愈傷組織分化出芽，未分化的愈傷組織繼續(xù)放入上述相同分化培養(yǎng)基上，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)至分化出芽；C.將B中分化出的芽置于MS+0.1～0.5mg/L的BA+0.1～0.5mg/L的NAA，pH為5.5～6.0的繁殖培養(yǎng)基上，在溫度為20～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)間為8～12小時(shí)/天的條件下，培養(yǎng)20～40天，即獲得花藥培養(yǎng)的洋桔梗再生植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述A中預(yù)處理為經(jīng)過下列步驟(1)于冬季選洋桔梗材料，取其花蕾；(2)將花蕾裝入塑料袋中，放入3 6°C冰箱中2 4天；(3)花蕾用體積濃度為75%的酒精消毒30 60秒，再用質(zhì)量濃度為0.05 0. 2%的 HgC12消毒10 20分種，最后用無菌水沖洗2 4次，吸干花蕾上的水分，得預(yù)處理滅菌的花蕾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述A中的花蕾為花萼等長于花冠或者花 萼稍長于花冠的花蕾。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過花藥培養(yǎng)獲得洋桔梗再生植株的方法，經(jīng)過選材、花蕾消毒、愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織分化成芽、再生植株的擴(kuò)繁等步驟，獲得花藥培養(yǎng)的洋桔梗再生植株。本發(fā)明誘導(dǎo)洋桔?；蛐统晒β蔬_(dá)100％，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)35～100％，愈傷組織分化率為8～23％，分化植株最高可達(dá)28株/愈傷組織，可為F1代種子生產(chǎn)提供優(yōu)良的親本材料。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101836587SQ20101013393
公開日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者周旭紅, 張顥, 曹樺, 李紳崇, 李金澤, 桂敏, 王繼華, 莫錫君, 蔣亞蓮 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所