專利名稱：松乳菇菌絲深層發(fā)酵培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種培養(yǎng)液，具體是松乳菇菌絲深層發(fā)酵的一種培養(yǎng)基。同時(shí)，本發(fā)明還涉及利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)松乳菇后所獲得的產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
液體深層發(fā)酵是食(藥)用菌菌絲培養(yǎng)的一種常用方法。它是將菌種接種于發(fā)酵罐或錐形瓶的培養(yǎng)液中，在自動(dòng)控制理化調(diào)節(jié)下，通過不斷同期攪拌或振蕩，使菌種在液體深層處快速繁殖的方法。在液體深層培養(yǎng)中，菌絲細(xì)胞能在反應(yīng)器內(nèi)處于最適宜的溫度、酸堿度、氧氣和碳氮比等環(huán)境中生長，呼吸作用所產(chǎn)生的代謝廢氣又能及時(shí)排放，因此新陳代謝旺盛，菌絲生長分裂迅速，能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的菌絲體。液體深層發(fā)酵是獲取大量松乳菇多糖的有效途徑。與其它發(fā)酵研究一樣，食用菌的發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、 生長因子等，國內(nèi)學(xué)者對松乳菇的發(fā)酵條件與工藝進(jìn)行了研究，但結(jié)果很不一致。多數(shù)研究表明松乳菇菌絲在以葡萄糖、蔗糖、糊精、甘露醇等為碳源、以玉米漿、牛肉膏、硝酸銨等為氮源的培養(yǎng)基上生長好，礦質(zhì)鹽MgSO4和NaCl使菌絲啟動(dòng)加快，磷酸二氫鉀使菌絲產(chǎn)量提高；VB1、VB6、煙酸對菌絲的生長有促進(jìn)作用，適宜的培養(yǎng)溫度25 27°C，pH6 7. 5。目前常用松乳菇基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分為玉米漿1.5%，硝酸銨0. 15%，羧甲基纖維素鈉0.4%，葡萄糖 1. 5%, PH6. 5。以上研究為松乳菇的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)，但目前液體深層發(fā)酵技術(shù)得到的松乳菇菌絲量少，多糖的分離純化技術(shù)不成熟，多糖得率很低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對松乳菇菌絲深層發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，通過在發(fā)酵液體培養(yǎng)液中添加中藥材進(jìn)行深層發(fā)酵，提高菌絲及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量，同時(shí)改善多糖成份，增強(qiáng)多糖的藥理活性。本發(fā)明提供的松乳菇菌培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入一種或多種中草藥。上述中藥材中優(yōu)選白術(shù)、甘草、天花粉、大棗、玉竹、麥冬、黨參、粉葛、百合、當(dāng)歸、 淮山。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，更優(yōu)選麥冬、淮山、大棗、玉竹。本發(fā)明根據(jù)生物體生物酶作用機(jī)制和產(chǎn)物的累積作用，在普通培養(yǎng)基中添加中藥材，提高松乳菇菌絲及其多糖的生物產(chǎn)量，并改善多糖成份，增強(qiáng)藥理活性。經(jīng)對添加14種中草藥的初篩試驗(yàn)表明，培養(yǎng)基添加多糖類中藥材可促進(jìn)松乳菇菌絲生長，提高多糖產(chǎn)量。 進(jìn)而挑選麥冬、淮山、大棗三種促進(jìn)作用強(qiáng)的中藥材進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，再次發(fā)現(xiàn)菌絲生長量及多糖含量均顯著高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的產(chǎn)量；同時(shí)經(jīng)組分分析發(fā)現(xiàn)添加這三種中藥材菌絲多糖組分明顯改變，經(jīng)抗菌和抗病毒的藥理試驗(yàn)證明藥理作用增強(qiáng)。中藥材最好以均漿的形式加入，以擴(kuò)大中草藥與松乳菇菌絲的接觸面積，產(chǎn)生的菌絲體或菌絲體中多糖的含量與加入中草藥的量成正比。但是，加入到液體培養(yǎng)基中中草藥的比例有一定的限制，量過多，則培養(yǎng)液容易成團(tuán)或凝固，不利于菌絲充分發(fā)酵。對于麥冬、淮山、大棗優(yōu)選其占培養(yǎng)基的重量體積濃度為0. 5-5%，更優(yōu)選2-3%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明從中藥材中篩選出14種富含糖類的中草材，添加到松乳菇發(fā)酵液中，能提高松乳菇菌絲及其胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量，并增強(qiáng)其多糖的藥理(抑菌等)活性。本發(fā)明所選擇的中藥材本身富含多糖，松乳菇菌絲在生長過程中可能對這些多糖直接吸收利用或通過修飾改造后整合到松乳菇菌絲胞內(nèi)多糖的組分中，使得松乳菇菌絲胞內(nèi)多糖含量從提高到48. 5% ；本發(fā)明使松乳菇多糖的藥理功能也發(fā)生相應(yīng)的改變。如原松乳菇胞內(nèi)多糖對大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌和巴氏桿菌的MIC分別為25mg/ml、12. 5mg/ml、3. 175mg/ml、25mg/ ml，添加了麥冬、淮山和大棗所得到的菌絲胞內(nèi)多糖對四種細(xì)菌的MIC除了對鏈球菌有所提高或相同外，其余均有所降低，表明通過添加中草藥，可以提高松乳菇菌絲胞內(nèi)多糖的抗菌能力。經(jīng)雞胚雞新城疫病毒和雞法氏囊病毒感染抑制試驗(yàn)證明添加麥冬、淮山或大棗發(fā)酵的松乳菇多糖與未添加中藥發(fā)酵的松乳菇多糖比，顯著提高感染雞胚的存活時(shí)間，且有約30%的雞胚存活。這種藥效提高可能是松乳菇菌絲體一方面同化吸納了中藥中的藥理活性成分，即藥效疊加；另一方面菌絲體異化作用對中藥成份進(jìn)行修飾，將非活性多糖成分改造成活性成份，將低活性成份改造成高活性成份。本發(fā)明篩選出的添加中藥材來源廣，產(chǎn)量高、價(jià)格低，為大規(guī)模地生產(chǎn)高活性松乳菇多糖提供技術(shù)和物質(zhì)保障。本發(fā)明利用富含糖類的中藥材添加發(fā)酵松乳菇，既提高了松乳菇菌絲多糖的含量，也提高了松乳菇菌絲多糖的藥理活性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中，按照加入物質(zhì)的形態(tài)來區(qū)分百分比，本發(fā)明培養(yǎng)基是液態(tài)，一般來說加入是干物質(zhì)，百分比即重量/體積；加入的是液體物質(zhì)，百分比即體積/體積。實(shí)例1 中藥發(fā)酵對松乳菇菌絲生長及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響1 材料松乳菇菌種由湖南民康生物技術(shù)研究所保存。普通培養(yǎng)基玉米漿1. 5%，硝酸銨0. 15%，羧甲基纖維素鈉0. 4%，葡萄糖1. 5%, 蒸餾水定容至100ml，pH6. 5真菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基各組分都是用百分比表示，參見朱戎，陳向東，蘭進(jìn)“藥用真菌液體發(fā)酵研究進(jìn)展”中草藥購自湖南養(yǎng)天和大藥房，將中草藥洗凈，干燥箱內(nèi)60°C烘干，粉碎后放入勻漿機(jī)勻漿，最后經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥，備用。中草藥改良培養(yǎng)基中草藥2 %，玉米漿1%，硝酸銨0. 15%，羧甲基纖維素鈉 0. 4%，葡萄糖1. 5%，蒸餾水定容至100ml, PH6. 52 方法將斜面培養(yǎng)基上的菌種接種于固體培養(yǎng)基進(jìn)行一次活化，然后挑選2cm大小長勢好的圓形菌絲塊接入裝有普通培養(yǎng)基的三角瓶中，于恒溫培養(yǎng)搖床上(轉(zhuǎn)速12Orpm08°C 培養(yǎng)5d得普通培養(yǎng)基，再將普通培養(yǎng)基按15 %的接種量接入中草藥改良培養(yǎng)基中，按前述
4條件培養(yǎng)5d，每天觀察菌絲生長情況并記錄。5d后將發(fā)酵液抽濾，所得菌絲干燥稱重，粉碎過60目篩，超聲提取后測量多糖含量。比較添加不同單味中草藥的發(fā)酵液中菌絲干重以及多糖含量，以此探討添加中草藥對松乳菇菌絲生長及其胞內(nèi)多糖含量的影響。松乳菇菌絲胞內(nèi)多糖超聲提取松乳菇菌絲干燥后粉碎過60目篩，料液比 1 2500，超聲功率400W，一次超聲9s，間隔3s，超聲30min。吸取超聲提取液Iml至IOOml 容量瓶中，加水至100ml，搖勻，測多糖含量。3 結(jié)果表1 添加14種中草藥的發(fā)酵液菌絲生長情況
權(quán)利要求
1.松乳菇菌培養(yǎng)基，在普通培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入一種或多種中草藥，尤其是多糖類中草藥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的松乳菇培養(yǎng)基，其特征在于上述中藥材選自白術(shù)、甘草、天花粉、大棗、玉竹、麥冬、黨參、粉葛、百合、當(dāng)歸、淮山中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的松乳菇培養(yǎng)基，其特征在于中藥材選自麥冬、淮山、大棗、玉竹中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的松乳菇培養(yǎng)基，其特征在于中藥材麥冬、淮山或大棗在培養(yǎng)基中的重量體積百分濃度為0. 5-5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的松乳菇培養(yǎng)基，其特征在于藥材麥冬、淮山或大棗在培養(yǎng)基中的重量體積百分濃度為2-3%。
6.一種松乳菇菌絲體制備方法，其特征在于采用權(quán)利要求1-5所述的培養(yǎng)基。
7.一種松乳菇菌絲體中提取的多糖，其特征是采用權(quán)利要求6的方法制備松乳菇菌絲體。
8.權(quán)利要求7所述的松乳菇菌絲體中提取的多糖在制備抗菌獸藥中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所說的抗菌獸藥，為抗沙門氏菌、鏈球菌及巴氏桿菌的獸藥。
10.權(quán)利要求7所述的松乳菇菌絲體中提取的多糖在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，其中所述的病毒是新城疫病毒和雞法氏囊病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種培養(yǎng)液，具體是松乳菇菌絲深層發(fā)酵的一種培養(yǎng)基。同時(shí)，本發(fā)明還涉及利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)松乳菇后所獲得的產(chǎn)物的應(yīng)用。所述松乳菇菌培養(yǎng)基，在普通培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入一種或多種中草藥，尤其是多糖類中草藥。本發(fā)明對松乳菇菌絲深層發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，通過在發(fā)酵液體培養(yǎng)液中添加中藥材進(jìn)行深層發(fā)酵，提高菌絲及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量，同時(shí)改善多糖成份，增強(qiáng)多糖的藥理活性。本發(fā)明篩選出的添加中藥材來源廣，產(chǎn)量高、價(jià)格低，為大規(guī)模地生產(chǎn)高活性松乳菇多糖提供技術(shù)和物質(zhì)保障。
文檔編號(hào)C05G3/00GK102267833SQ20101018993
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者李益, 王慧明 申請人:湖南民康生物技術(shù)研究所