專利名稱：一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌即DH5a-pBVnm23-H1的發(fā)酵方法，它屬于基因工程藥物制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所指工程菌即DH5a-pBVnm23-H1是一種抗癌轉(zhuǎn)移基因工程藥物Nm23-H1的中試發(fā)酵方法研究。從Dialog國際聯(lián)機檢索數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果來看，雖然有許多研究表明nm23基因的表達水平和惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其中未發(fā)現(xiàn)涉及nm23-H1工程菌的中試發(fā)酵的研究及其文獻報道。
本發(fā)明工程菌的發(fā)酵方法包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝。培養(yǎng)基的篩選是在首先了解單個因素對工程菌的生長及目標蛋白表達的影響后，再通過正交實驗綜合考慮各因素之間的交互作用，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后確定發(fā)酵配方，同時進行發(fā)酵工藝檢驗和優(yōu)選，至選定發(fā)酵工藝條件。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是探索一種工程菌的發(fā)酵方法，篩選出能滿足設(shè)計要求的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝條件，進而達到高菌體得率與高目標蛋白表達。
本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達到一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌即DH5a-pBVnm23-H1的發(fā)酵方法，它包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選和發(fā)酵工藝條件的選定。按配制10L發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基配方(重量百分比)如下酵母提取物(Yeast extract) 0.30～3.0蛋白胨(Typtone) 0.30～3.0氯化鈉(NaCl)0.50～1.5葡萄糖(Glucose) 0.30～5.0微量元素適量發(fā)酵工藝條件為(1)菌種的加入量菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的5～15％，菌種的光密度(OD值)為1～3。
(2)工程菌生長和誘導(dǎo)表達的時間及溫度工程菌發(fā)酵過程中，長菌溫度為28～35℃，時間2～5小時，誘導(dǎo)表達的溫度為39～45℃，時間3～7小時。
(3)加糖時刻及方式選擇加糖方式采取慢速加糖方式，加糖量為100～350g，且在0.5～3小時加完。
(4)發(fā)酵液酸堿度調(diào)節(jié)采用酸堿自動平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.5～7.5之間。
(5)溶氧水平通過通氣量與轉(zhuǎn)速自動調(diào)節(jié)溶氧，維持在40％以上水平。
本發(fā)明的目的還可以通過以下措施來達到調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值采用氫氧化鈉(NaOH)和鹽酸(HCL)自動平衡調(diào)節(jié)。
本發(fā)明具有如下特點(1)菌體得率高，達10～60菌體濕重/L發(fā)酵液。
(2)目標蛋白表達量高(包括相對含量和絕對含量)，其含量可達15～45％。
(3)發(fā)酵時間短。
(4)發(fā)酵成本低。
具體實施例方式本發(fā)明下面將結(jié)合實施例作進一步詳述。
例一A發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.0％蛋白胨(Typtone)2.0％氯化鈉(NaCl) 1.0％葡萄糖(Glucose)2.0％微量元素 適量B發(fā)酵工藝按上述配方配制10L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的10％，光密度(OD值)為2.5。同時設(shè)定溶氧水平為50％，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，開始進行培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)2小時后把葡萄糖100g(首先配成50％的溶液消毒)慢速加入發(fā)酵罐，用時2.5小時。發(fā)酵過程中長菌溫度為30℃，時間3小時，誘導(dǎo)溫度40℃，時間7小時。
發(fā)酵完畢經(jīng)分離，菌體得率為30g菌體濕得/L發(fā)酵液，目標蛋白含量達35％。
例二A發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.2％蛋白胨(Typtone)2.0％氯化鈉(NaCl) 0.9％葡萄糖(Glucose)1.7％微量元素 適量B發(fā)酵工藝按上述配方配制10L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的10％，光密度(OD值)為2.3。同時設(shè)定溶氧水平為45％，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，開始進行培養(yǎng)。培養(yǎng)3小時后開始把葡萄糖150g慢速加入發(fā)酵罐，用時3小時，發(fā)酵過程中長菌溫度為31℃，時間3.5小時，誘導(dǎo)溫度42℃，時間6.5小時。
發(fā)酵完畢經(jīng)分離，菌體得率為33g菌體濕重/L發(fā)酵液，目標蛋白含量達33％。
例三A發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下酵母提取物(Yeast extract) 1.0％蛋白胨(Typtone)2.2％氯化鈉(NaCl) 1.0％葡萄糖(Glucose)1.5％微量元素 適量B發(fā)酵工藝按上述配方配制10L發(fā)酵液(用去離子水)于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種菌種，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的8％，光密度(OD值)為3。同時設(shè)定溶氧水平為55％，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2，開始進行培養(yǎng)。培養(yǎng)1小時后把葡萄糖180g慢速加入發(fā)酵罐，用時3小時。發(fā)酵過程中長菌溫度為34℃，時間4小時，誘導(dǎo)溫度43.5℃，時間5.5小時。
發(fā)酵完畢經(jīng)分離，菌體得率為38g菌體濕重/L發(fā)酵液，目標蛋白含量達32.5％。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌的發(fā)酵方法，其特征是A.按配制10L發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基配方重量百分比如下酵母提取物(Yeast extract)0.30～3.0蛋白胨(Typtone) 0.30～3.0氯化鈉(NaCl) 0.50～1.5葡萄糖(Glucose) 0.30～5.0微量元素 適量B.發(fā)酵工藝(1)菌種的加入量菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的5～15％，菌種的光密度為1～3；(2)工程菌生長和誘導(dǎo)表達的時間及溫度工程菌發(fā)酵過程中，長菌溫度為28～35℃，時間2～5小時，誘導(dǎo)表達的溫度為39～45℃，時間3～7小時；(3)加糖時刻及方式選擇加糖方式采取慢速加糖方式，加糖量為100～350g，且在0.5～3小時加完；(4)發(fā)酵液酸堿度調(diào)節(jié)采用酸堿自動平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.5～7.5之間；(5)溶氧水平通過通氣量與轉(zhuǎn)速自動調(diào)節(jié)溶氧，維持在40％以上水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之方法，其特征是調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值采用氫氧化鈉和鹽酸自動平衡調(diào)節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明是一種生產(chǎn)抗癌藥物工程菌即DH5a－pBVnm23－H1的發(fā)酵方法研究。該法包括如下步驟發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選和發(fā)酵工藝條件選定。配方包括酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖等組成，發(fā)酵工藝包括菌種的加入量及其最佳生長時期，工程菌生長和誘導(dǎo)表達的時間及溫度、加糖時刻及方式選擇，發(fā)酵液酸堿度的調(diào)節(jié)等。用本發(fā)明培養(yǎng)基配方及所建立的發(fā)酵工藝進行DH5a－pBVnm23－H1的發(fā)酵，具有菌體得率高、目標蛋白表達量高、時間短、成本低等特點。
文檔編號A61P35/00GK1412297SQ01129780
公開日2003年4月23日 申請日期2001年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月18日
發(fā)明者王一飛, 張美英, 錢垂文, 李久香 申請人:暨南大學(xué)