專(zhuān)利名稱(chēng)：發(fā)酵云芝高產(chǎn)eps的培養(yǎng)基配方及其在卷煙中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種液體發(fā)酵云芝生產(chǎn)胞外多糖的工藝及胞外多糖的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
云芝(Coriolus versicolor)又名彩絨革蓋菌、雜色云芝、彩絨菌和瓦菌等，隸屬非褶菌目，多孔菌科，栓菌屬。子實(shí)體一般較小，無(wú)柄，呈覆瓦狀排列。云芝是中藥和食品中用途最為廣泛的真菌之一，具有健脾利濕、止咳平喘、清熱解毒、抗腫瘤等功能。云芝中含有多種生理活性成分，其中最主要的成分之一就是云芝多糖。云芝多糖分子量在10萬(wàn)以上， 是富含β_(1，;3)糖苷鍵的葡聚糖，同時(shí)含有甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。大量的研究資料表明云芝多糖成分是一類(lèi)具有多種生物活性的多糖物質(zhì)，具有多種藥理和生理功能，功效顯著，藥用價(jià)值高，可做各類(lèi)藥品、保健品、功能性食品的原料。大量研究表明， 云芝多糖具有抗細(xì)菌、霉菌及病毒的功能，刺激巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加血液里的白細(xì)胞介素I、 Y干擾素及腫瘤壞死因子的作用，能抑制癌細(xì)胞生成，是一種新型的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)劑，能激活免疫細(xì)胞，提高機(jī)體免疫功能而對(duì)正常細(xì)胞，沒(méi)有毒副作用。云芝多糖是國(guó)際公認(rèn)的高效免疫促進(jìn)劑，是一種口服有效的多糖，臨床可用于治療慢性乙型肝炎、酒精肝，加強(qiáng)消化系統(tǒng)、肺及宮頸、乳腺等部位的癌癥放化療作用，可明顯提高患者的細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)化學(xué)治療的耐受性減少感染與出血，提高患者生命質(zhì)量。云芝多糖同時(shí)具有保肝護(hù)肝作用，可顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶，對(duì)肝組織病變和肝壞死有明顯的修復(fù)作用。云芝多糖包括三類(lèi)，一是從云芝的子實(shí)體中提取的粗多糖(CVPQ，二是從云芝深層培養(yǎng)菌絲體中分離到一種結(jié)合蛋白多糖(PSK)(又稱(chēng)為云芝肽糖)，三是從液體發(fā)酵云芝的發(fā)酵液中提取的云芝胞外多糖(EPS)。從云芝菌絲體和發(fā)酵液中提取的多糖均具有極強(qiáng)烈的抑制癌細(xì)胞活性，抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)功能，是良好的免疫增強(qiáng)劑，可提高動(dòng)物機(jī)體 IgM的量等作用；而云芝糖肽的抗腫瘤作用、免疫增強(qiáng)作用和保護(hù)肝臟的作用也已普遍用于臨床。在臨床上，云芝多糖具有安全性高、毒副作用小、適用面廣和對(duì)機(jī)體損害小等優(yōu)點(diǎn)， 已作為一種免疫療法用藥應(yīng)用于慢性乙型肝炎，消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病及宮頸和乳腺等部位癌癥疾病的治療和輔助治療。將云芝多糖開(kāi)發(fā)為天然藥物免疫促進(jìn)劑和調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于其他疾病的防制方面具有更廣闊的前景。近年來(lái)人們對(duì)云芝子實(shí)體和發(fā)酵菌絲體多糖的提取方法、功能和應(yīng)用等已進(jìn)行了大量的研究，但就發(fā)酵云芝生產(chǎn)胞外多糖(EPQ和EPS功能及應(yīng)用方面的研究還很少。隨著世界范圍內(nèi)反吸煙運(yùn)動(dòng)的不斷深入和人類(lèi)對(duì)自身健康的關(guān)注，“吸煙與健康” 已經(jīng)成為醫(yī)藥界和煙草界共同面臨的重大難題，是煙草行業(yè)所面臨的主要挑戰(zhàn)及當(dāng)今社會(huì)廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來(lái)，隨著履行《煙草控制框架公約》工作的啟動(dòng)，社會(huì)對(duì)吸煙與健康問(wèn)題的關(guān)注不斷加強(qiáng)，減少吸煙對(duì)健康的危害已成為煙草行業(yè)必須承擔(dān)的責(zé)任和義務(wù)。目前國(guó)內(nèi)已在中草藥選擇、藥物作用機(jī)理以及臨床應(yīng)用效果上對(duì)中國(guó)特有的新型卷煙進(jìn)行了深入的研究，研制開(kāi)發(fā)成功對(duì)人體某些疾病具有一定療效商業(yè)卷煙，如“金圣”、“五葉神”、“江山”等。這些卷煙除對(duì)緩解人體呼吸系統(tǒng)疾病有一定良性作用外，還可對(duì)心血管系統(tǒng)疾病等有一定的預(yù)防作用。還有研究表明，含有云芝等類(lèi)中草藥有效成分的卷煙在燃吸時(shí)，其有效成分被蒸餾、氣化、揮發(fā)和升華形成微粒相和氣相，可捕獲煙氣中的自由基，阻斷或降低有害物質(zhì)的生成，減輕吸煙引起的心血管和微循環(huán)系統(tǒng)的危害。因此，煙用中草藥的研究目前已成為各煙草企業(yè)和科研院所研究的熱點(diǎn)之一。但目前，還未見(jiàn)發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖用于卷煙中的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種發(fā)酵云芝高產(chǎn)EPS的培養(yǎng)基配方。本發(fā)明的另一目的在于提供一種液體發(fā)酵云芝培養(yǎng)物的方法及從云芝培養(yǎng)發(fā)酵液中分離純化胞外多糖的方法。本發(fā)明的再一目的是公開(kāi)了云芝胞外多糖在卷煙中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明的發(fā)酵云芝高產(chǎn)EPS的培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨4_7g/L，麥芽糖50_55g/L，起始PH為5。優(yōu)選為多價(jià)胨5.870g/L，麥芽糖53. 120g/L，起始pH為5。本發(fā)明的液體發(fā)酵云芝培養(yǎng)物的方法，以4%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨4-7g/L，麥芽糖50-55g/L，起始pH為5，在，150r/ min條件下培養(yǎng)7-9天。優(yōu)選為以4%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨5. 870g/L,麥芽糖53. 120g/L,起始pH為5，在28°C，150r/min條件下培養(yǎng)8天。所述的種子培養(yǎng)液為菌種cfcc 87458的斜面培養(yǎng)物經(jīng)一次平板培養(yǎng)和一次液體培養(yǎng)的產(chǎn)物，斜面培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后 28 °C培養(yǎng)4-6天;平板培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后在 28 °C培養(yǎng)6-8天;液體培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨4_7g/L，麥芽糖50_55g/L，起始pH為5，以4%的接種量接種后在^°C，150r/min條件下培養(yǎng)4_6天。從云芝培養(yǎng)發(fā)酵液中分離純化胞外多糖的方法為發(fā)酵液通過(guò)旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4°C 過(guò)夜；lOOOOr/min離心lOmin，得沉淀為粗多糖；將粗多糖樣品用蒸餾水溶解，加入1/4體積的氯仿-正丁醇溶液，氯仿與正丁醇的體積比為4 1，置于具塞容器中，充分振搖30min后，經(jīng)離心機(jī)lOOOr/min離心5min，然后將水相與氯仿相分開(kāi)；將水相再加入相當(dāng)于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述過(guò)程，共計(jì)重復(fù)二次；純化出的胞外多糖成分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，透析除去NaCl，得精制云芝胞外多糖，真空冷凍干燥保存。云芝胞外多糖在卷煙中的應(yīng)用，將精制的云芝胞外多糖的噴入煙絲或注入煙卷中，胞外多糖含量為煙絲質(zhì)量的0. 01% -0. 04%，然后放入恒溫恒濕箱在溫度22°C，濕度60%下平衡48h。本發(fā)明中所用的菌種cfcc 87458購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，保藏于中國(guó)林業(yè)微生物保藏管理中心。本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)酵云芝高產(chǎn)EPS的培養(yǎng)基配方及液體發(fā)酵云芝培養(yǎng)物的方法，采用該發(fā)明的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法，多糖得率為10. 0982g/L。并對(duì)EPS生理活性進(jìn)行初探，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)云芝EPS及其在醫(yī)藥食品行業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用做好了準(zhǔn)備。本發(fā)明就是找到了一種云芝胞外多糖在卷煙中的應(yīng)用方法，為云芝等真菌的胞外多糖在卷煙中的應(yīng)用提供了一種可行方案，具有廣闊發(fā)展空間，將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效應(yīng)。利用中草藥搭建起具有傳統(tǒng)吸煙文化內(nèi)涵和中式吸味特征的低危害卷煙的技術(shù)壁壘，提高中國(guó)卷煙產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，可應(yīng)對(duì)WHO和WTO帶來(lái)的壓力和挑戰(zhàn)。將云芝等優(yōu)質(zhì)溫補(bǔ)中草藥發(fā)酵提取胞外多糖添加到卷煙中，形成的獨(dú)特的香氣風(fēng)格、口味特征以及加工方式均符合國(guó)家局提出的中式卷煙發(fā)展方向，對(duì)卷煙煙氣能起到減害增益的作用，符合國(guó)家煙草科技發(fā)展方向，有利于提高我國(guó)煙草工業(yè)產(chǎn)品的技術(shù)含量和競(jìng)爭(zhēng)力，使卷煙消費(fèi)者在享受吸煙樂(lè)趣的同時(shí)盡可能的降低吸煙的危害性。
圖1精制云芝胞外多糖過(guò)kpharose CL-6B層析柱結(jié)果。圖2過(guò)柱得云芝胞外多糖組分的紅外光譜圖。圖3精制云芝胞外多糖在卷煙煙氣中的轉(zhuǎn)移率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)斜面菌種培養(yǎng)配制固體培養(yǎng)基，分裝試管，斜面培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆， 麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；滅菌后制備斜面，劃線(xiàn)接種云芝后，于培養(yǎng)5天， 冷凍保藏即為云芝菌株菌種。(2)從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出0. 5平方厘米的一小塊，接種到P天A固體平板中。平板培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2% 瓊脂；接種時(shí)要使接種塊上包含盡量少的培養(yǎng)基，一個(gè)平板接兩塊，放入恒溫培養(yǎng)箱，接種后在培養(yǎng)7天。(3)使用直徑0. 5cm的打孔器，從固體平板培養(yǎng)基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養(yǎng)基中O50ml三角瓶，50毫升培養(yǎng)液)，液體培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨 5. 870g/L,麥芽糖53. 120g/L,起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)5天。(4)以4%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨5. 870g/L,麥芽糖53. 120g/L,起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)8天。云芝發(fā)酵結(jié)束后，將50mL的發(fā)酵物通過(guò)真空抽濾法分離菌絲與發(fā)酵液，發(fā)酵液通過(guò)旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4°C過(guò)夜。lOOOOr/min 離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱(chēng)取0. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測(cè)定計(jì)算發(fā)酵液中多糖含量為10. 10g/L。實(shí)施例2
(1)斜面菌種培養(yǎng)配制固體培養(yǎng)基，分裝試管，斜面培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆， 麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；滅菌后制備斜面，劃線(xiàn)接種云芝后，于培養(yǎng)4天， 冷凍保藏即為云芝菌株菌種。(2)從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出0. 5平方厘米的一小塊，接種到P天A固體平板中。平板培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2% 瓊脂；接種后在培養(yǎng)6-8天；接種時(shí)要使接種塊上包含盡量少的培養(yǎng)基，一個(gè)平板接兩塊，放入恒溫培養(yǎng)箱，28°C培養(yǎng)8天。(3)使用直徑0. 5cm的打孔器，從固體平板培養(yǎng)基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養(yǎng)基中O50ml三角瓶，50毫升培養(yǎng)液)，液體培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨 4g/L，麥芽糖55g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)6天。(4)以4%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨4g/L，麥芽糖55g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)7天。云芝發(fā)酵結(jié)束后，將50mL的發(fā)酵物通過(guò)真空抽濾法分離菌絲與發(fā)酵液，發(fā)酵液通過(guò)旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4°C過(guò)夜。lOOOOr/min 離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱(chēng)取0. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測(cè)定計(jì)算發(fā)酵液中多糖含量為10. 12g/L。實(shí)施例3(1)斜面菌種培養(yǎng)配制固體培養(yǎng)基，分裝試管，斜面培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆， 麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；滅菌后制備斜面，劃線(xiàn)接種云芝后，于培養(yǎng)6天， 冷凍保藏即為云芝菌株菌種。(2)從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出0. 5平方厘米的一小塊，接種到P天A固體平板中。平板培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2% 瓊脂；接種后在培養(yǎng)6天；接種時(shí)要使接種塊上包含盡量少的培養(yǎng)基，一個(gè)平板接兩塊，放入恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6天。(3)使用直徑0. 5cm的打孔器，從固體平板培養(yǎng)基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養(yǎng)基中O50ml三角瓶，50毫升培養(yǎng)液)，液體培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨 7g/L,麥芽糖50g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)4天。(4)以4%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨7g/L，麥芽糖50g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)9天。云芝發(fā)酵結(jié)束后，將50mL的發(fā)酵物通過(guò)真空抽濾法分離菌絲與發(fā)酵液，發(fā)酵液通過(guò)旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4°C過(guò)夜。lOOOOr/min 離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱(chēng)取0. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測(cè)定計(jì)算發(fā)酵液中多糖含量為10. 09g/L。實(shí)施例4(1)斜面菌種培養(yǎng)配制固體培養(yǎng)基，分裝試管，斜面培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆， 麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；滅菌后制備斜面，劃線(xiàn)接種云芝后，于培養(yǎng)6天， 冷凍保藏即為云芝菌株菌種。(2)從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出0. 5平方厘米的一小塊，接種到P天A固體平板中。平板培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后在培養(yǎng)6天；接種時(shí)要使接種塊上包含盡量少的培養(yǎng)基，一個(gè)平板接兩塊，放入恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6天。(3)使用直徑0. 5cm的打孔器，從固體平板培養(yǎng)基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養(yǎng)基中O50ml三角瓶，50毫升培養(yǎng)液)，液體培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨 6g/L,麥芽糖53g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)4天。(4)以4%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨5g/L，麥芽糖52g/L，起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)9天。云芝發(fā)酵結(jié)束后，將50mL的發(fā)酵物通過(guò)真空抽濾法分離菌絲與發(fā)酵液，發(fā)酵液通過(guò)旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4°C過(guò)夜。lOOOOr/min 離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱(chēng)取0. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測(cè)定計(jì)算發(fā)酵液中多糖含量為10. 09g/L。稱(chēng)取Ig的的粗多糖樣品，室溫下加入50mL蒸餾水溶解，加入1/4體積的氯仿-正丁醇(預(yù)先配制成體積比為4 1混合液)溶液，置于具塞容器中，充分振搖30min后，經(jīng)離心機(jī)lOOOr/min離心5min，然后將水相與氯仿相分開(kāi)。將水相再加入相當(dāng)于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述過(guò)程，共計(jì)重復(fù)二次。用硫酸-苯酚法對(duì)胞外多糖進(jìn)行檢測(cè)。 純化出的胞外多糖成分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，得精制云芝胞外多糖，真空冷凍干燥保存。以實(shí)施例5得到的精致云芝胞外多糖為分析樣品，進(jìn)行下述分析研究。1、發(fā)酵產(chǎn)云芝胞外多糖組分分析稱(chēng)取80mg云芝精制胞外多糖溶于4mL 0. 2mol/L的NaCl緩沖液溶解，離心，上清液過(guò)0. 45 μ m的濾膜；取2mL上Sepharose CL-6B凝膠柱，以0. 2mol/L NaCl緩沖液洗脫， 流速為0. 6mL/min，利用分步收集器收集，5mL/管；用硫酸-苯酚法對(duì)胞外多糖進(jìn)行檢測(cè)。 分離出的胞外多糖組分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，真空冷凍干燥保存。將精制云芝胞外多糖樣品過(guò)kpharose CL-6B柱，用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量， 以管號(hào)為橫坐標(biāo)以多糖吸光度為縱坐標(biāo)用SigmaPlot軟件作圖，結(jié)果如下圖1所示。從結(jié)果圖1可以看出，精制云芝胞外多糖經(jīng)過(guò)kpharose CL-6B柱分離出了一種主要多糖組分。 重復(fù)過(guò)柱5次，每次都對(duì)過(guò)柱后的溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果相同，將5次所得到的組分收集起來(lái)進(jìn)行濃縮、透析、冷凍干燥得到一個(gè)多糖組分。2、云芝胞外多糖組分紅外光譜分析稱(chēng)取過(guò)柱得云芝胞外多糖組分lmg，用溴化鉀(KBr)壓片后進(jìn)行紅外光譜(IR)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖譜中特征吸收波峰分析可知，在3421. 4cm-l有一特征寬峰，屬O-H的伸縮振動(dòng)，表明在該糖中應(yīng)存在O-H ；在2926. Icm-I處有吸收峰，應(yīng)為C-H伸縮振動(dòng)，是糖類(lèi)的特征吸收峰，在2361cm-l、2335. 8cm-l處有吸收峰，應(yīng)為C = N或C = C伸縮振動(dòng)，發(fā)生費(fèi)米共振；在1645. 7cm-l、1071. 9cm-l處有吸收峰，說(shuō)明該組分中有羧酸存在，推知該胞外多糖組分為酸性多糖。3、云芝EPS抗氧化性能的測(cè)定用鄰二氮菲法測(cè)定云芝EPS對(duì)· OH自由基的清除率，結(jié)果見(jiàn)表1。表1多糖對(duì)· OH自由基的清除效率
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵云芝高產(chǎn)EPS的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其特征在于培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨4_7g/ L,麥芽糖50-55g/L,起始pH為5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵云芝高產(chǎn)EPS的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，其特征在于培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨5. 870g/L，麥芽糖53. 120g/L，起始pH為5。
3.一種液體發(fā)酵云芝培養(yǎng)物的方法，其特征在于以4 %的接種量將種子培養(yǎng)液接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨4-7g/L，麥芽糖50-55g/L，起始pH為5，在 28 0C，150r/min條件下培養(yǎng)7_9天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液體發(fā)酵云芝培養(yǎng)物的方法，其特征在于以4%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨5. 870g/L，麥芽糖53. 120g/L, 起始pH為5，在，150r/min條件下培養(yǎng)8天。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的液體發(fā)酵云芝培養(yǎng)物的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)液為菌種Cfcc 87458的斜面培養(yǎng)物經(jīng)一次平板培養(yǎng)和一次液體培養(yǎng)的產(chǎn)物，斜面培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后培養(yǎng)4-6天；平板培養(yǎng)基配方為250g/L 土豆，麥芽糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；接種后在培養(yǎng)6-8天；液體培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨4-7g/L，麥芽糖50-55g/L，起始pH為5，以4%的接種量接種后在，150r/min條件下培養(yǎng)4_6天。
6.一種從云芝培養(yǎng)發(fā)酵液中分離純化胞外多糖的方法，其特征在于發(fā)酵液通過(guò)旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無(wú)水乙醇，4°C過(guò)夜； 10000r/min離心lOmin，得沉淀為粗多糖；將粗多糖樣品用蒸餾水溶解，加入1/4體積的氯仿-正丁醇溶液，氯仿與正丁醇的體積比為4 1，置于具塞容器中，充分振搖30min后，經(jīng)離心機(jī)lOOOr/min離心5min，然后將水相與氯仿相分開(kāi)；將水相再加入相當(dāng)于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述過(guò)程，共計(jì)重復(fù)二次；純化出的胞外多糖成分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，透析除去NaCl，得精制云芝胞外多糖，真空冷凍干燥保存。
7.云芝胞外多糖在卷煙中的應(yīng)用，其特征在于將精制的云芝胞外多糖的噴入煙絲或注入煙卷中，胞外多糖含量為煙絲質(zhì)量的0. 01 % -0. 04%，然后放入恒溫恒濕箱在溫度 22°C，濕度60%下平衡48h。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)酵云芝高產(chǎn)胞外多糖(EPS)的培養(yǎng)基配方及液體發(fā)酵云芝培養(yǎng)物的方法，發(fā)酵培養(yǎng)方法為以4％的接種量將種子培養(yǎng)液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為多價(jià)胨4-7g/L，麥芽糖50-55g/L，起始pH為5，在28℃，150r/min條件下培養(yǎng)7-9天。采用該發(fā)明的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)方法，多糖得率為10.0982g/L。并對(duì)EPS在卷煙中的應(yīng)用進(jìn)行了探索，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)云芝EPS及其在醫(yī)藥食品行業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用做好了準(zhǔn)備。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102399840SQ20111036229
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者毛多斌, 王吉中, 耿盧婧, 許春平 申請(qǐng)人:鄭州輕工業(yè)學(xué)院