本發(fā)明屬于醫(yī)療衛(wèi)生及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷的方法。
背景技術(shù)：
空氣污染已成為世界許多地區(qū)一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。越來(lái)越多的流行病學(xué)和臨床證據(jù)表明，污染物使人群各種疾病的患病率增加。大氣顆粒物(particularmatter，pm)是不同大小和化學(xué)特征的液體和固體材料的混合物，包括釋放到空氣中的煙塵、煙霧、灰塵、污垢等。顆粒物依據(jù)其動(dòng)力學(xué)直徑，將空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5μm的固體顆粒物稱為pm2.5，pm2.5是各種氣體的混合物和顆粒組件，主要由含碳物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)、元素碳的總和、有機(jī)物組成。目前認(rèn)為pm2.5主要是人為燃燒排放等過(guò)程而產(chǎn)生，是霧霾的主要成分，可能對(duì)人體健康產(chǎn)生負(fù)面影響，因此對(duì)于pm2.5的監(jiān)測(cè)和研究極為重要。眼球作為機(jī)體的一個(gè)重要器官，眼表直接暴露于外界，顆粒物pm2.5是否對(duì)眼表產(chǎn)生影響？目前，大部分的研究都是對(duì)于肺部、鼻部，而對(duì)于眼鏡，還沒(méi)有建立良好的、能夠標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化，易于推向市場(chǎng)的檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上訴技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種能夠檢測(cè)出大氣顆粒物對(duì)眼睛是否有影響的方法，方便、快捷，可為臨床防治提供理論基礎(chǔ)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)方案為：本發(fā)明公開(kāi)的檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷的方法，包括如下步驟，(1)采用四通道大氣顆粒物智能采樣儀，切割出大氣顆粒物，采用聚四氟乙烯濾膜包覆大氣顆粒物，將包覆有濾膜的大氣顆粒物浸入蒸餾水中，超聲振蕩后用紗布濾過(guò)，干燥后備用；
(2)取步驟(1)備用的大氣顆粒物，將大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌的pbs中得到大氣顆粒物滴眼液，再向大氣顆粒物加入苯扎溴銨，保存于4℃冰箱備用；
(3)取體外眼角膜組織細(xì)胞，向體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞滴入步驟(2)配置出的滴眼液設(shè)置成試驗(yàn)組，并設(shè)置空白對(duì)照組，將試驗(yàn)組和空白對(duì)照組采用熒光素染色、蘇木精、伊紅染色后，觀察體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞損傷情況。
最貼合現(xiàn)實(shí)的模擬自然環(huán)境，采用最貼合人體眼睛環(huán)境的體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，最大化與實(shí)際情況相符，采用四氟乙烯濾膜包覆大氣顆粒物、與pbs溶解、加入苯扎溴銨可以很容易的均勻分散，更容易的形成勻質(zhì)的滴眼液，有助于后續(xù)滴加進(jìn)體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞中，使實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組均勻度一致，無(wú)其他菌落，去除影響檢測(cè)的干擾。
進(jìn)一步的，所述步驟(3)中使用濃度為10g·l-1熒光素鈉溶液分別滴入1μl至試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞中，使熒光素鈉溶液均勻分布于體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞表面，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)的破裂情況。熒光素鈉本身沒(méi)有對(duì)體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞有損傷作用，采用它對(duì)體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞染色，可以良好的觀察出體外眼角膜組織細(xì)胞的損傷情況。
進(jìn)一步的，所述步驟(3)中分別將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組的體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞用質(zhì)量濃度為4％多聚甲醛溶液固定，然后經(jīng)石蠟包埋、切片處理，采用蘇木精-伊紅染色，置入顯微鏡下觀察角膜損傷情況。所述固定是制作標(biāo)本常用的方法，即就是向材料體內(nèi)注射部分固定夜，再浸漬固定液，本發(fā)明選用4％多聚甲醛溶液作為固定液，可快速殺死細(xì)胞，使細(xì)胞最大化保持原有自然狀態(tài)、不皺縮、不膨脹，同時(shí)，一方面使組織硬化便于截切，而且增加內(nèi)含物折光度，使某些體外眼角膜組織細(xì)胞便于著色、觀察。
進(jìn)一步的，該方法還包括步驟(4)，將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組的體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞分別經(jīng)質(zhì)量濃度為2.5％戊二醛溶液前固定2小時(shí)，質(zhì)量濃度為1％鋨酸溶液后固定1小時(shí)，再分別經(jīng)真空冷凍干燥、乙醇梯度脫水，包埋，經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。采用所述方法對(duì)體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞進(jìn)一步觀察，可從多方面、多角度，更綜合、真實(shí)的檢測(cè)出大氣顆粒物對(duì)體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞的損傷情況。
進(jìn)一步的，所述步驟(1)中對(duì)大氣顆粒物切割的粒徑為2.5-10μm，將包覆有大氣顆粒物的四氟乙烯濾膜裁剪為1cm×1cm，超聲振蕩45min，經(jīng)真空條件下冷凍干燥，再于4℃保存?zhèn)溆?。所切割的粒徑為自然環(huán)境條件下最常見(jiàn)的顆粒物，經(jīng)振蕩后，使顆粒物更好的與四氟乙烯濾膜相包覆。
進(jìn)一步的，所述步驟(2)中大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌pbs中得到大氣顆粒物滴眼液的濃度為5-10mg/ml，滴加滴眼液的次數(shù)為3次，在向大氣顆粒物加入苯扎溴銨時(shí)，苯扎溴銨的添加量為0.005-0.1g。所選擇的滴眼液的濃度、次數(shù)等均可最大化貼近真實(shí)情況，對(duì)平均試驗(yàn)多次結(jié)果準(zhǔn)確性的不良影響最小。
本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：設(shè)計(jì)出了一種最大化貼合實(shí)際情況、得到一種干擾因素少、能夠檢測(cè)出大氣顆粒物致眼損傷的方法，對(duì)臨床治療給出了準(zhǔn)確的理論依據(jù)，所使用的材料毒副作用小，對(duì)環(huán)境友好，安全、方便、快捷。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例一：本發(fā)明公開(kāi)的一種檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷的方法，包括如下步驟，(1)采用四通道大氣顆粒物智能采樣儀，切割出大氣顆粒物，采用聚四氟乙烯濾膜包覆大氣顆粒物，將包覆有濾膜的大氣顆粒物浸入蒸餾水中，超聲振蕩后用紗布濾過(guò)，干燥后備用；
(2)取步驟(1)備用的大氣顆粒物，將大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌的pbs中得到大氣顆粒物滴眼液，再向大氣顆粒物加入苯扎溴銨，保存于4℃冰箱備用；
(3)取體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞，向體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞滴入步驟(2)配置出的滴眼液設(shè)置成試驗(yàn)組，并設(shè)置空白對(duì)照組，將試驗(yàn)組和空白對(duì)照組采用熒光素染色、蘇木精-伊紅染色后，觀察體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞損傷情況。
采用本發(fā)明方法可以檢測(cè)得到大氣顆粒物對(duì)體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞的損害，進(jìn)而為臨床醫(yī)療提供理論基礎(chǔ)。
以下是通過(guò)此方法得到的結(jié)果，1、空白對(duì)照為a組，滴加大氣顆粒物滴眼液的為b組，a、b兩組內(nèi)干預(yù)前和干預(yù)1d、4d后fl相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝0.341,t＝0.512,t＝0.835,p均＞0.05)，兩組間干預(yù)前和干預(yù)fl相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝0.000,t＝0.469,t＝0.573,p均＞0.05)；干預(yù)7d后，a組fl較干預(yù)前無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝0.781,p均＞0.05)，而b組fl較干預(yù)前明顯惡化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝7.432,p均＜0.05)；兩組fl相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝5.893,p＜0.05，詳見(jiàn)表1)。
表1各組體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞干預(yù)前和干預(yù)后各時(shí)段熒光素染色評(píng)分情況比較(x±s)
注：*p＜0.05
1、角膜fl情況
角膜熒光染色顯示，a組體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞采用pbs滴眼液滴眼7d后角膜染色無(wú)明顯變化，b組體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞采用大氣顆粒物滴眼液滴眼7d后整個(gè)角膜熒光素染色區(qū)域明顯增加，呈點(diǎn)片狀著染。
2、角膜he染色(蘇木精-伊紅)情況和穹隆部結(jié)膜pas染色結(jié)果：pbs滴眼液滴眼7d后角膜上皮由整齊排列的4～6層上皮細(xì)胞組成，基底細(xì)胞為一單層柱狀上皮細(xì)胞層，排列緊密整齊。角膜上皮層數(shù)未見(jiàn)增加，基底細(xì)胞仍為一單層柱狀上皮細(xì)胞層，角膜上皮厚度基本沒(méi)有改變，表層上皮較為完整，而經(jīng)過(guò)大氣顆粒物滴眼液滴眼7d后角膜上皮細(xì)胞層數(shù)開(kāi)始增多，上皮厚度增加，翼狀細(xì)胞及基底細(xì)胞排列紊亂,同時(shí)伴有表層上皮細(xì)胞損傷、脫落，角膜表面欠光滑。干預(yù)7d后，b組上皮細(xì)胞層數(shù)為(4±1)層，而a組上皮細(xì)胞層數(shù)為(7±1)層，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝8.614,p<0.05)。a組結(jié)膜上穹窿部包含多層上皮細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈圓柱狀或骰狀，杯狀細(xì)胞廣泛分布于穹窿部上皮細(xì)胞之間,杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)為15±1。b組結(jié)膜上穹窿部上皮細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)缺失，杯狀細(xì)胞形態(tài)不一致，數(shù)量減少，計(jì)數(shù)為6±2,出現(xiàn)顯著性差異。
實(shí)施例二：本發(fā)明公開(kāi)的一種檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷的方法，包括如下步驟，(1)采用四通道大氣顆粒物智能采樣儀，切割出大氣顆粒物，采用聚四氟乙烯濾膜包覆大氣顆粒物，將包覆有濾膜的大氣顆粒物浸入蒸餾水中，超聲振蕩后用紗布濾過(guò)，干燥后備用；
(2)取步驟(1)備用的大氣顆粒物，將大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌的pbs中得到大氣顆粒物滴眼液，再向大氣顆粒物加入苯扎溴銨，保存于4℃冰箱備用；
(3)取體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞，向體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞滴入步驟(2)配置出的滴眼液設(shè)置成試驗(yàn)組，并設(shè)置空白對(duì)照組，分別將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組的體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞用質(zhì)量濃度為4％多聚甲醛溶液固定，然后經(jīng)石蠟包埋、切片處理將試驗(yàn)組和空白對(duì)照組采用熒光素染色、蘇木精-伊紅染色后，觀察體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞損傷情況；
進(jìn)一步的，使用濃度為10g·l-1熒光素鈉溶液分別滴入1μl至試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞中，使熒光素鈉溶液均勻分布于體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞表面，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)的破裂情況。
為了多維度檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷，本發(fā)明還包括步驟(4)，將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組的體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞分別經(jīng)質(zhì)量濃度為2.5％戊二醛溶液前固定2小時(shí)，質(zhì)量濃度為1％鋨酸溶液后固定1小時(shí)，再分別經(jīng)真空冷凍干燥、乙醇梯度脫水，包埋，經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
進(jìn)一步的，所述步驟(1)中對(duì)大氣顆粒物切割的粒徑為2.5μm，將包覆有大氣顆粒物的四氟乙烯濾膜裁剪為1cm×1cm，超聲振蕩45min，經(jīng)真空條件下冷凍干燥，再于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
進(jìn)一步的，所述步驟(2)中大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌pbs中得到大氣顆粒物滴眼液的濃度為5mg/ml，滴加滴眼液的次數(shù)為3次，在向大氣顆粒物加入苯扎溴銨時(shí)，苯扎溴銨的添加量為0.005g。
步驟(4)檢測(cè)得到的結(jié)果：空白對(duì)照組為a組，滴加大氣顆粒物的實(shí)驗(yàn)組為b組，正常角膜上皮細(xì)胞會(huì)向外伸出許多微絨毛和微皺襞，排列整齊。用pbs點(diǎn)眼7天后，通過(guò)透射電鏡下可見(jiàn)a組表層上皮細(xì)胞向外可見(jiàn)豐富的微絨毛，呈指狀突起，排列規(guī)則。相比較下b組使用大氣顆粒物滴眼液點(diǎn)眼7天后，角膜上皮微絨毛可見(jiàn)明顯減少，微絨毛形態(tài)也與a組有很大差別，偶見(jiàn)指狀突起，大部分微絨毛變短，而且排列也不規(guī)則，兩組受試體外培養(yǎng)角膜組織細(xì)胞應(yīng)用不同滴眼液處理7天后角膜上皮細(xì)胞微絨毛形態(tài)的比較(醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛×10000)：應(yīng)用pbs滴眼液點(diǎn)眼7天后，角膜上皮微絨毛呈指狀突起，微絨毛數(shù)量多，排列整齊(箭頭)：應(yīng)用大氣顆粒滴眼液點(diǎn)眼組7天后角膜上皮微絨毛減少、變短、排列紊亂,角膜上皮細(xì)胞剝脫。
以下列舉部分試驗(yàn)，用以說(shuō)明，本發(fā)明方法中所選擇的試劑聚四氟乙烯濾膜、pbs、苯扎溴銨為最優(yōu)選擇，如下表所示：
實(shí)施例三：本發(fā)明公開(kāi)的一種檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷的方法，包括如下步驟，(1)采用四通道大氣顆粒物智能采樣儀，切割出大氣顆粒物，采用聚四氟乙烯濾膜包覆大氣顆粒物，將包覆有濾膜的大氣顆粒物浸入蒸餾水中，超聲振蕩后用紗布濾過(guò)，干燥后備用；
(2)取步驟(1)備用的大氣顆粒物，將大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌的pbs中得到大氣顆粒物滴眼液，再向大氣顆粒物加入苯扎溴銨，保存于4℃冰箱備用；
(3)取體外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞，向外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞滴入步驟(2)配置出的滴眼液設(shè)置成試驗(yàn)組，并設(shè)置空白對(duì)照組，分別將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組的外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞用質(zhì)量濃度為4％多聚甲醛溶液固定，然后經(jīng)石蠟包埋、切片處理將試驗(yàn)組和空白對(duì)照組采用熒光素染色、蘇木精-伊紅染色后，觀察外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞損傷情況；
進(jìn)一步的，使用濃度為10g·l-1熒光素鈉溶液分別滴入1μl至試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞中，使熒光素鈉溶液均勻分布于外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞表面，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)的破裂情況。
為了多維度檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷，本發(fā)明還包括步驟(4)，將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組的外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞分別經(jīng)質(zhì)量濃度為2.5％戊二醛溶液前固定2小時(shí)，質(zhì)量濃度為1％鋨酸溶液后固定1小時(shí)，再分別經(jīng)真空冷凍干燥、乙醇梯度脫水，包埋，經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
進(jìn)一步的，所述步驟(1)中對(duì)大氣顆粒物切割的粒徑為10μm，將包覆有大氣顆粒物的四氟乙烯濾膜裁剪為1cm×1cm，超聲振蕩45min，經(jīng)真空條件下冷凍干燥，再于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
進(jìn)一步的，所述步驟(2)中大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌pbs中得到大氣顆粒物滴眼液的濃度為10mg/ml，滴加滴眼液的次數(shù)為3次，在向大氣顆粒物加入苯扎溴銨時(shí)，苯扎溴銨的添加量為0.1g。
以下采用部分試驗(yàn)例用以說(shuō)明，本發(fā)明所選擇的染色劑的選擇過(guò)程：
實(shí)施例四：本發(fā)明公開(kāi)的一種檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷的方法，包括如下步驟，(1)采用四通道大氣顆粒物智能采樣儀，切割出大氣顆粒物，采用聚四氟乙烯濾膜包覆大氣顆粒物，將包覆有濾膜的大氣顆粒物浸入蒸餾水中，超聲振蕩后用紗布濾過(guò)，干燥后備用；
(2)取步驟(1)備用的大氣顆粒物，將大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌的pbs中得到大氣顆粒物滴眼液，再向大氣顆粒物加入苯扎溴銨，保存于4℃冰箱備用；
(3)取外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞，向外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞滴入步驟(2)配置出的滴眼液設(shè)置成試驗(yàn)組，并設(shè)置空白對(duì)照組，分別將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組的外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞用質(zhì)量濃度為4％多聚甲醛溶液固定，然后經(jīng)石蠟包埋、切片處理將試驗(yàn)組和空白對(duì)照組采用熒光素染色、蘇木精-伊紅染色后，觀察外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞損傷情況；
進(jìn)一步的，使用濃度為10g·l-1熒光素鈉溶液分別滴入1μl至試驗(yàn)組和空白對(duì)照組的外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞中，使熒光素鈉溶液均勻分布于外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞表面，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)的破裂情況。
為了多維度檢測(cè)大氣顆粒物致眼損傷，本發(fā)明還包括步驟(4)，將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組的外培養(yǎng)眼角膜細(xì)胞分別經(jīng)質(zhì)量濃度為2.5％戊二醛溶液前固定2小時(shí)，質(zhì)量濃度為1％鋨酸溶液后固定1小時(shí)，再分別經(jīng)真空冷凍干燥、乙醇梯度脫水，包埋，經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
進(jìn)一步的，所述步驟(1)中對(duì)大氣顆粒物切割的粒徑為5μm，將包覆有大氣顆粒物的四氟乙烯濾膜裁剪為1cm×1cm，超聲振蕩45min，經(jīng)真空條件下冷凍干燥，再于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
進(jìn)一步的，所述步驟(2)中大氣顆粒物稀釋于無(wú)菌pbs中得到大氣顆粒物滴眼液的濃度為8mg/ml，滴加滴眼液的次數(shù)為3次，在向大氣顆粒物加入苯扎溴銨時(shí)，苯扎溴銨的添加量為0.01g。
以下采用部分試驗(yàn)例用以說(shuō)明，本發(fā)明步驟(3)所選擇的固定液的選擇過(guò)程：
以下列舉部分試驗(yàn)例用以說(shuō)明，本發(fā)明步驟(4)中所選取的固定液、染色劑的過(guò)程：
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。