基于發(fā)光細菌法的大氣顆粒物中有機污染物毒性檢測方法與流程

本發(fā)明涉及一種基于發(fā)光細菌法的大氣顆粒物中有機污染物毒性檢測方法，屬于發(fā)光細菌的綜合毒性檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展,城市建設(shè)規(guī)模的擴大,大氣總懸浮顆粒物(tsp)污染已成為我國各大城市面臨的重要問題。大部分有機污染物容易吸附在顆粒物上，研究表明有機物是大氣細顆粒物中最重要的組分占大氣顆粒物40%。從大氣顆粒物中檢測出的有機污染物種類繁多,且多數(shù)物質(zhì)對人體有害。如多環(huán)芳烴類物質(zhì),苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[ghi]芘等均為致癌物;環(huán)境樣品已中檢出百余種多環(huán)芳烴類物質(zhì)。由于多環(huán)芳烴種類多,在環(huán)境中分布廣泛,對人們的康健危害性也大。苯酚類尤其是多氯酚、苯胺類和硝基芳香烴類均為有毒物質(zhì);酞酸酯類物質(zhì)已被證實是環(huán)境激素類污染物。因此,對大氣顆粒物中有機污染物毒性的測定對研究大氣污染狀況和治理是很有必要的。

捕集大氣顆粒物后必須進行高效提取后才能測定,有人對超聲波提取條件進行了詳細研究,并于索氏抽提效果進行了比較。前人認為以正己烷+丙酮（1:1）為提取劑,微波提取功率為40w,提取時間為20min時最為合適,,將試樣提取并凈化后用gc-ms法測定的報道較多,也有用hplc一熒光檢測器或化學發(fā)光監(jiān)測器測定的報道。此外用大氣壓離子化lc一ms法測定苯并花,及傅里葉變換熒光顯微鏡測定顆粒中的多環(huán)芳烴也有報道。用gc一ms法同時測定多環(huán)芳烴和正構(gòu)烷烴及有機氯化物的報道較多。但是上述檢測方法操作復雜，耗時較多，成本較高，不利于大氣環(huán)境的常規(guī)檢測和應急檢測。目前,我國尚未建立大氣顆粒物樣品有機物毒性檢測的規(guī)范方法,因此,構(gòu)建一種成本低、操作簡便的方法,對大氣顆粒物中有機污染物毒性進行及時、快速、準確、定量的檢測的工作對人們的健康和生活有重大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于發(fā)光細菌法的大氣顆粒物中有機污染物毒性檢測方法，該檢測方法采用丙醇-正己烷混合溶液為萃取劑的加壓流體萃取方法對樣品中的非水溶性有毒物質(zhì)進行浸提，利用發(fā)光細菌對有毒有害物質(zhì)的靈敏性和較低的檢測限，建立一種簡便快速的大氣顆粒物中有機物綜合毒性檢測方法,降低了對采樣量的要求。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種基于發(fā)光細菌法的大氣顆粒物中有機污染物毒性檢測方法,所述方法包括以下步驟：

（1）樣品的采集與保存：利用大氣顆粒物采樣器采集大氣顆粒物樣品,采樣結(jié)束后,用鋁箔紙包裹好載有大氣顆粒物樣品的濾膜,密閉低溫保存,防止樣品中毒性物質(zhì)的損失；

（2）樣品的萃?。簩⑤d有大氣顆粒物樣品的濾膜破碎成細小碎片,選用丙醇-正己烷混合溶劑做萃取劑，對樣品中的有機污染物用加壓流體萃取法進行萃取，加壓流體萃取裝置設(shè)置載氣壓力0.8mpa，萃取池壓1200-2000psi，加熱溫度120-180℃，加熱5分鐘，萃取結(jié)束后加入二甲基亞砜,然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙醇-正己烷混合溶劑,獲得樣品液；同時以空白濾膜按照載有大氣顆粒物樣品的濾膜相同的處理方法得到的萃取液作為對照液；

（3）樣品的毒性檢測:調(diào)節(jié)樣品液的ph并將樣品液稀釋，使ph達到7,且樣品液中二甲基亞砜含量為1%(v/v）,然后將發(fā)光細菌培養(yǎng)液、經(jīng)稀釋的樣品液、15%nacl溶液和純凈水按體積比為1：2：4：13的比例混勻,進行發(fā)光細菌毒性試驗，測定對發(fā)光細菌15min的發(fā)光強度，同時將對照液按照樣品液相同處理后進行發(fā)光細菌毒性試驗作為空白對照，測定對發(fā)光細菌15min的發(fā)光強度；

（4）樣品毒性的表達:采用發(fā)光細菌15min的發(fā)光抑制率或同氯化汞進行綜合毒性的當量濃度比對,來表征大氣顆粒物中有機污染物的綜合毒性水平。

所述發(fā)光細菌為費氏弧菌或明亮發(fā)光桿菌。

所述丙醇-正己烷混合溶劑為農(nóng)殘級丙醇與農(nóng)殘級正己烷的按體積比為1:1的比例混合而成。

所述樣品液和對照液均設(shè)3組平行測定發(fā)光抑制率,發(fā)光抑制率相對偏差不超過10%,結(jié)果取3組測定發(fā)光抑制率的平均值。

有益效果：

本發(fā)明的檢測方法能夠適應樣品量小的物質(zhì)的綜合毒性檢測，其選擇丙酮-正己烷混合溶液作為浸提液對樣品中的毒性物質(zhì)進行浸提，比傳統(tǒng)的水提法具有更好的浸提效果。然后將丙酮-正己烷混合溶液中的毒性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到對發(fā)光細菌低毒的二甲基亞砜溶劑中，提高了檢測結(jié)果準確度。本方法利用發(fā)光細菌法進行檢測，樣品與發(fā)光細菌的反應時間僅為15分鐘，能夠迅速獲得檢測結(jié)果，靈敏度高、適應性強、重復性好，適應大批量樣品的快速檢測，大大縮短了綜合毒性的檢測時間，提高了檢測效率。

附圖說明

圖1、為不同濃度的二甲基亞砜對發(fā)光細菌發(fā)光強度的影響關(guān)系圖。

具體實施方式

為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明,并使本發(fā)明的上述優(yōu)點能夠更加明顯易懂,下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

實施例1

基于發(fā)光細菌法的大氣顆粒物中有機物染物毒性檢測方法，其具體操作分為以下4個步驟：

（1）樣品的采集與保存：嚴格按照環(huán)境空氣質(zhì)量監(jiān)測規(guī)范等相關(guān)規(guī)范流程,利用大氣顆粒物采樣器采集大氣顆粒物樣品,本實例中利用大氣顆粒物采樣器采集大氣顆粒物pm2.512小時,采樣結(jié)束后,取下濾膜,用鋁箔紙包裹好后置于聚乙烯自封袋中,排盡空氣,密閉保存于-20℃的冰箱中,以防止樣品中毒性物質(zhì)的損失。

（2）樣品的浸提：將載有大氣顆粒物樣品的濾膜破碎成細小碎片,選擇體積比1：1的農(nóng)殘級丙醇和正己烷溶劑混合液對樣品中毒性物質(zhì)用加壓流體萃取法進行萃取。加壓流體萃取裝置設(shè)置載氣壓力0.8mpa,萃取池壓1200-2000psi，加熱溫度120-180℃；萃取池壓優(yōu)選1500psi；加熱溫度優(yōu)選150℃，然后加熱5分鐘，萃取3次。在對樣品進行萃取后,再在萃取液中加入二甲基亞砜,然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙醇-正己烷混合溶液,以獲得含有有機污染樣品的二甲基亞砜溶液。同時以空白濾膜按照載有大氣顆粒物樣品的濾膜相同的處理方法得到的萃取液作為對照液。

由于大氣顆粒物中的有機污染物多為脂溶性物質(zhì)，因此本試驗利用加壓流體萃取法對毒性物質(zhì)進行抽提。本發(fā)明中所有方法中采用的提取液為丙酮/正己烷（體積比1：1），通過兩種不同極性的溶液以不同比例配置成混合提取液，高效率地提取全部有機物，要比單一的提取液效果更佳。

以蒸餾水為對照，分別測定了甲醇、二甲亞砜、丙酮-正己烷混合液對發(fā)光細菌的生物毒性。結(jié)果表明，丙酮-正己烷混合溶劑對發(fā)光細菌具有強毒性，而二甲亞砜的毒性較小，不同有機溶劑對發(fā)光細菌發(fā)光強度的影響見下表1。

表1不同有機溶劑對發(fā)光細菌發(fā)光強度的影響

二甲基亞砜相對于其他有機溶劑對發(fā)光細菌的毒性較小,故檢測大氣顆粒物中有機污染物生物毒性時常用二甲基亞砜交換極性的萃取溶劑獲取污染物提取液。本實驗采用二甲基亞砜配制多環(huán)芳烴化合物測試液,并為使其對發(fā)光細菌發(fā)光強度的影響減至最小,在溶解和測試過程中保持樣品溶液中二甲基亞砜濃度≤0.1%(v/v)。由圖1可知當二甲基亞砜濃度為0.1%～0.75%(v/v)時對發(fā)光細菌發(fā)光強度無甚影響,其相對發(fā)光強度保持在97%～99%間。當二甲亞砜濃度>1%(v/v)時對發(fā)光細菌發(fā)光強度的影響顯著,且隨二甲亞砜濃度的升高而發(fā)光細菌發(fā)光強度逐漸減弱,二者間存在極顯著負相關(guān)關(guān)系(p<0.001)。

本試驗首先采用丙酮-正己烷混合溶劑對大氣顆粒物進行萃取，然后在丙醇-正己烷提取物中加入對發(fā)光細菌低毒的二甲基亞砜，最后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙酮-正己烷混合溶劑，以獲得大氣顆粒物樣品提取物的二甲亞砜溶液作為大氣顆粒物生物測定所需的最終浸提液，不會影響檢測結(jié)果的準確性。

（3）浸提液的毒性檢測:調(diào)節(jié)樣品液的ph并將樣品液稀釋，調(diào)節(jié)ph達到7，經(jīng)稀釋的樣品液中二甲基亞砜含量為1%(v/v）,通過計算經(jīng)稀釋的樣品液的體積,確定取體積比為1：2：4：13發(fā)光細菌培養(yǎng)液、經(jīng)稀釋的樣品液、15%nacl和純凈水,使?jié)舛鹊陀谫M氏弧菌的最適鹽度濃度,可以通過調(diào)節(jié)濃度達到最適鹽度,不會影響檢測結(jié)果的準確性。取50μl發(fā)光細菌培養(yǎng)液，加入100μl經(jīng)稀釋的樣品液、200μl15%nacl溶液和650μl純凈水，混勻，放置15min，然后利用sdimicrotoxmodel500溫控毒性儀（自帶溫控和校準裝置）及標配的費氏弧菌進行測定，該測試方法還適用于明亮發(fā)光桿菌等海洋發(fā)光細菌。發(fā)光細菌可選用發(fā)光細菌凍干粉或新鮮細菌培養(yǎng)液。但由于發(fā)光細菌凍干粉價格昂貴,因此本試驗擬使用發(fā)光細菌的新鮮培養(yǎng)液。測定其對發(fā)光細菌一費氏弧菌15分鐘后的發(fā)光強度，同時將對照液按照樣品液相同處理后進行發(fā)光細菌毒性試驗作為空白對照，測定對發(fā)光細菌15min的發(fā)光強度。

樣品液和對照液平行測定3次發(fā)光抑制率，發(fā)光抑制率相對偏差不超過10%，結(jié)果分別取3次測定發(fā)光抑制率的平均值。

(4)樣品毒性的表達:采用發(fā)光細菌15min的發(fā)光抑制率,來表征大氣顆粒物中有機污染物的綜合毒性水平。

發(fā)光抑制率=（對照發(fā)光強度-樣品發(fā)光強度）/對照發(fā)光強度×100%

發(fā)光抑制率越大,樣品浸提液的毒性越大,發(fā)光抑制率越小,樣品浸提液的毒性越小。采用國標gb/t15441-1995方法，急性毒性水平利用參比氯化汞濃度（mg/l）來表征詳見表2：

表2水質(zhì)急性毒性（發(fā)光細菌法）的分級標準

本實例中,sdimicrotoxmodel500溫控毒性儀三次測定的發(fā)光抑制率結(jié)果分別為85.8%、84.5%和86.6%,其最終的發(fā)光抑制率測定結(jié)果為85.6%,相對發(fā)光率為14.4%，毒性級別為高毒。