Uhplc-cad技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及UHPLC-CAD聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法，所述的6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物為地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦其特征在于該方法包括以下的步驟：1）對(duì)照品的配制、2）內(nèi)標(biāo)溶液的配制、3）樣品溶液制備、4）流動(dòng)相溶液的配制、5）色譜條件的設(shè)置、6）電噴霧檢測(cè)器條件的優(yōu)化、7）樣品測(cè)定、8）梯度濃度對(duì)照品溶液的配制、9）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、?10）數(shù)據(jù)分析計(jì)算。本發(fā)明的方法先進(jìn)，臨床應(yīng)用前景及作用良好，能夠?yàn)榕R床合理用藥，提高藥物療效、減低毒副作用及藥物費(fèi)用，發(fā)揮積極的作用。
【專利說(shuō)明】UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種屬于藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種采用高效液相-電噴霧檢測(cè)聯(lián)用技術(shù)，同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代社會(huì)生活由于工作競(jìng)爭(zhēng)激烈，生活節(jié)奏緊張，外界各種刺激因素影響著人們的情緒，產(chǎn)生失眠、緊張，進(jìn)而發(fā)展為焦慮、抑郁等各種心理和生理問(wèn)題，給家庭和社會(huì)都造成巨大的壓力。國(guó)外的一項(xiàng)調(diào)查顯示50%-60%的成年人患有不同程度的睡眠障礙，我國(guó)失眠的發(fā)病率高達(dá)40%。巴比妥類藥物作為第I代鎮(zhèn)靜催眠藥，由于有抑制呼吸等不良反應(yīng)，近年來(lái)已基本被其他有關(guān)藥物所取代。目前臨床上常用的鎮(zhèn)靜、催眠和抗焦慮藥物為苯二氮卓類藥物(第2代鎮(zhèn)靜催眠藥物)，以及新一代的非苯二氮卓類藥物(第3代鎮(zhèn)靜催眠藥物)，均可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的抑制，隨著用量的加大，臨床表現(xiàn)可自輕度的鎮(zhèn)靜到催眠甚至昏迷。苯二氮卓類藥物中代表藥物主要有地西泮、阿普唑侖、勞拉西泮等，其主要作用機(jī)制為通過(guò)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性受體GABAa( Y -氨基丁酸A)受體復(fù)合體中的Y -亞單位結(jié)合，活化GABAa受體，促進(jìn)GABA ( Y -氨基丁酸)與GABAa受體的結(jié)合，使Cl—通道開放頻率增加，誘導(dǎo)更多的Cl—內(nèi)流，加強(qiáng)GABA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的效應(yīng)。第3代非苯二氮卓類藥物中代表藥物主要有酒石酸唑吡坦、扎來(lái)普隆、佐匹克隆等，其中酒石酸唑吡坦的作用機(jī)制為選擇性地作用于苯二氮卓集合位點(diǎn)的BZ1 ( ω P亞型，增進(jìn)GABA對(duì)GABAa受體親和性，導(dǎo)致Cl—通道開放。上述藥物通常用于睡眠障礙的治療，但在重度抑郁癥，文化相關(guān)精神障礙，強(qiáng)迫癥以及精神分裂癥等精神疾病的對(duì)癥治療中也有廣泛應(yīng)用，與抗抑郁藥物、抗精神分裂藥物以及其他精神類藥物聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)緩解躁狂、焦慮、妄想等精神癥狀療效確切，顯著提高綜合療效。
[0003]然而，臨床上鎮(zhèn)靜催眠類藥物往往按藥物半衰期連續(xù)給藥或根據(jù)臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)給藥，由于患者病情程度不同以及個(gè)體差異，藥物的開始起效時(shí)間和在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間差異較大，常導(dǎo)致藥物的過(guò)量使用。再者，由于此類患者的特殊性，依從性較差，藥物使用中時(shí)常出現(xiàn)頓服過(guò)量或自行減藥等現(xiàn)象，直接影響治療效果，并且易導(dǎo)致戒斷綜合征，甚至可能出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥。因此鎮(zhèn)靜催眠類藥物的合理使用是與臨床療效及病人安全密切相關(guān)的關(guān)鍵因素，若能做到血藥濃度的快速檢測(cè)，并進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，治療時(shí)即可根據(jù)患者個(gè)體特點(diǎn)調(diào)給藥方案，則可能采用最小有效劑量，達(dá)到發(fā)揮療效的目的，避免精神藥物的過(guò)量使用。
[0004]目前對(duì)于鎮(zhèn)靜催眠類藥物的含量方法主要有高效液相色譜-紫外檢測(cè)器(HPLC-UV)、高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)、氣相色譜(GC)、質(zhì)譜(MS)等分析方法。GC以及GC-MS對(duì)檢測(cè)低沸點(diǎn)樣品具有優(yōu)勢(shì)，對(duì)苯二氮卓類藥物的檢測(cè)并非最佳，且儀器價(jià)格昂貴，維護(hù)成本高，普及程度不夠，推廣性較差；HPLC-UV及HPLC-DAD作為檢測(cè)手段的文獻(xiàn)，多采用不同檢測(cè)波長(zhǎng)，分別進(jìn)行分析檢測(cè)，對(duì)于同時(shí)服用兩種或兩種以上的鎮(zhèn)靜催眠類藥物的患者，無(wú)法提供一測(cè)多評(píng)的圖譜信息。
[0005]電噴霧檢測(cè)器(CAD)是目前通用的檢測(cè)器，與HPLC聯(lián)用時(shí)，HPLC洗脫液經(jīng)霧化器中氮?dú)獾淖饔枚F化，其中較大的液滴在碰撞器的作用下經(jīng)廢液管流出，較小的溶質(zhì)(分析物)液滴在室溫下干燥，形成溶質(zhì)顆粒。同時(shí)，用于載氣的氮?dú)夥至餍纬傻牡诙傻獨(dú)饬鹘?jīng)過(guò)電暈式裝置(含高壓鉬金絲電極)形成帶正電荷的氮?dú)忸w粒，與溶質(zhì)顆粒反向相遇時(shí)經(jīng)碰撞使溶質(zhì)顆粒帶上正電。它不依賴于分析物的結(jié)構(gòu)，也不需要將分析物電離，只要該物質(zhì)屬于半揮發(fā)性或非揮發(fā)性化合物就可以被檢出，且靈敏度可以達(dá)到Pg級(jí)別，重現(xiàn)性良好，是紫外(UV)、質(zhì)譜(MS)、示差折光(RI)與蒸發(fā)光散射(ELSD)等常用檢測(cè)器的有力補(bǔ)充。本項(xiàng)目采用UHPLC-CAD的檢測(cè)技術(shù)，分析壓力較常規(guī)液相有所增大，使分析時(shí)間明顯縮短，提高了分析效率；同時(shí)檢測(cè)器既能克服DAD檢測(cè)器對(duì)于痕量成分檢測(cè)時(shí)響應(yīng)值較低的劣勢(shì)，又能解決不同紫外吸收波長(zhǎng)的藥物無(wú)法一次性檢測(cè)的問(wèn)題，獲得低檢測(cè)限的含量測(cè)定結(jié)果，實(shí)現(xiàn)多種該類藥物一次性、快速的測(cè)定，且該項(xiàng)技術(shù)相較于GC、HPLC-MS等分析技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，維護(hù)及使用成本較低。
[0006]因此，本發(fā)明建立的針對(duì)多種鎮(zhèn)靜催眠類藥物的檢測(cè)，分析時(shí)間短、靈敏度高，重現(xiàn)性好，能實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)的檢測(cè)方法，能夠?yàn)榕R床藥物濃度檢測(cè)提供檢測(cè)方法，達(dá)到提高藥物使用效率，降低毒副反應(yīng)的目的。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前采用UHPLC-CAD方法測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物(包含2代及3代藥物)含量的方法，以及精神科患者血藥監(jiān)測(cè)應(yīng)用，未見文獻(xiàn)報(bào)道及專利公開。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是建立一種同時(shí)測(cè)定血清中6種苯二氮卓類藥物含量的檢測(cè)方法，為臨床藥物濃度監(jiān)測(cè)提供方案。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種應(yīng)用高液相色譜-電噴霧檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-CAD),同時(shí)測(cè)定血清6種苯二氮卓類藥物含量的方法，該方法包括以下的步驟:
1)對(duì)照品的配制
精密稱取地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西對(duì)照品，分別置于容量瓶中，加入乙腈溶解，配成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，備用，精密稱取酒石酸唑吡坦對(duì)照品，置于容量瓶中，加入純水溶解，配成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，備用，精密量取6種對(duì)照品溶液，配成所需質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，備用；
2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制
精密稱取秋水仙堿對(duì)照品，置于容量瓶中，加入乙腈溶解，配成所需質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)溶液，備用；
3)樣品溶液制備
精密量取睡眠障礙患者服藥后血清，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，高速離心后，分離上清液；上清液中加入至甲醇和水活化后的SPE柱，上樣后用水淋洗，適當(dāng)濃度的甲醇洗脫，洗脫液揮干，用乙腈溶解，即得樣品溶液，備用；
4)流動(dòng)相溶液的配制
取一定量的色譜純乙腈，作為流動(dòng)相A相，備用；取一定量的純水，作為流動(dòng)相B相，備用；
5)色譜條件的設(shè)置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為4.6 X 250_，填料內(nèi)徑為5μπι的色譜柱；柱溫為30°C，流動(dòng)相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，定量進(jìn)樣，進(jìn)行梯度洗脫；采用電噴霧檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè)；
6)電噴霧檢測(cè)器條件的優(yōu)化
選擇電噴霧檢測(cè)器，氮?dú)鈮毫?5psi，量程ΙΟΟρΑ，霧化溫度30°C ；
取步驟I)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，定量進(jìn)樣，并由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的色譜圖；
7)樣品測(cè)定
取步驟3)的樣品溶液，分別定量進(jìn)樣，在步驟5)與步驟6)的條件下，測(cè)定，分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品，秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物以及樣品的色譜圖，樣品圖譜中，與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品以及秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處，為血清樣品中的待測(cè)地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦，以及定量加入的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物；
8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制
精密吸取步驟I)的地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液，配制成混合對(duì)照品溶液，加乙腈，稀釋成梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，備用；
9)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
取睡眠障礙的患者空白組織液多份，分別定量加入步驟8)的梯度濃度混合對(duì)照品溶液，按照步驟3)方法操作，得到梯度加標(biāo)樣品溶液，在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定；以地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰的濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，地西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940)，勞拉西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0758x- 0.5796 (r=0.9968)，阿普唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =0.0813χ_0.6502(r=0.9946)，艾司唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0666χ-0.5455 (r=0.9939)，氯硝西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 0.0622x-0.4402 (r=0.9972)，酒石酸唑吡坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.1428x_0.6019(r=0.9963)。其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，x為被測(cè)物質(zhì)量濃度；
10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算
記錄地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦和秋水仙堿的峰面積，計(jì)算6種藥物與內(nèi)標(biāo)秋水仙堿峰面積的比值，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出6種藥物的質(zhì)量濃度；即為血清中藥物的濃度。
[0009]作為進(jìn)一步改進(jìn),上述的步驟5)中流動(dòng)相梯度洗脫程序如下:0-7.0Omin, 45%A相和 55%B 相；7.01min-15.0Omin，70%A 相和 30%B 相；15.01min-20.0Omin，45%A 相和 55%B 相。
[0010]作為進(jìn)一步改進(jìn)，上述的步驟8)定量稀釋成濃度梯度為183.16 μ g/mL、91.58 μ g/mL、45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL、9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對(duì)照品溶液，177.44 μ g/mL、88.72 μ g/mL、44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL、8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對(duì)照品溶液，173.56 μ g/mL,86.78 μ g/mL,43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL,8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對(duì)照品溶液，190.04 μ g/mL,95.02 μ g/mL,47.51 μ g/mL、19.0O μ g/mL,9.52 μ g/mL、L 81 μ g/mL 的氯硝西泮對(duì)照品溶液，174.40 μ g/mL,87.20 μ g/mL、43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對(duì)照品溶液，以及100.00 μ g/mL、50.00 μ g/mL、25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL 的酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液。
[0011]作為進(jìn)一步改進(jìn)，上述的步驟9)中取LOmL睡眠障礙的患者空白血清6份，編號(hào)I?6號(hào)，I號(hào)加入183.16 μ g/mL地西泮，177.44 μ g/mL艾司唑侖，173.56 μ g/mL勞拉西泮，190.04 μ g/mL氯硝西泮，190.04 μ g/mL阿普唑侖，100.00 μ g/mL酒石酸唑卩比坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;2號(hào)加入91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL艾司唑侖，86.78 μ g/mL勞拉西泮，95.02 μ g/mL氯硝西泮，87.20 μ g/mL阿普唑侖，50.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ; 3號(hào)加入45.79 μ g/mL地西泮，44.36 μ g/mL艾司唑侖，43.39 μ g/mL勞拉西泮，47.51 μ g/mL氯硝西泮，43.60 μ g/mL阿普唑侖，25.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;4號(hào)加入18.32 μ g/mL地西泮，17.74 μ g/mL艾司唑侖，17.74 μ g/mL勞拉西泮，19.00 μ g/mL氯硝西泮，17.44 μ g/mL阿普唑侖，10.00 μ g/mL酒石酸唑卩比坦對(duì)照品溶液各1yL; 5號(hào)加入9.16 μ g/mL地西泮，8.72 μ g/mL艾司唑侖，8.68 μ g/mL勞拉西泮，9.52 μ g/mL氯硝西泮，8.72 μ g/mL阿普唑侖，8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各1yL; 6號(hào)加入1.83 μ g/mL地西泮，1.77 μ g/mL艾司唑侖，1.74 μ g/mL勞拉西泮，1.81 μ g/mL氯硝西泮，1.74 μ g/mL阿普唑侖，1.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各10 μ L0
[0012]本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案及步驟，具有以下的特點(diǎn):
1、方法先進(jìn)性
UHPLC-CAD聯(lián)用技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)較先進(jìn)的分析檢測(cè)手段，與傳統(tǒng)的液相色譜-紫外檢測(cè)器聯(lián)用、氣相色譜、光譜分析方法比，分析時(shí)間較常規(guī)液相顯著縮短，同時(shí)由于采用通用檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了不同種類、不同波長(zhǎng)的藥物的同時(shí)測(cè)定，具有一測(cè)多評(píng)的優(yōu)越性。本發(fā)明首次采用該技術(shù)同時(shí)測(cè)定睡眠障礙患者血液中地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦的含量，方法先進(jìn)可行，能夠?yàn)樵撀?lián)用技術(shù)開展多組分化合物的同時(shí)定量測(cè)定應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0013]2、臨床應(yīng)用前景及作用良好
藥物濃度檢測(cè)作為臨床安全、合理用藥的重要手段，能夠提供體內(nèi)藥物濃度數(shù)據(jù)。本方法建立的方法能夠?yàn)榈匚縻?、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦的藥物濃度監(jiān)測(cè)提供切實(shí)可行的方法，臨床應(yīng)用前景良好，能夠?yàn)榕R床合理用藥，提高藥物療效、減低毒副作用及藥物費(fèi)用，發(fā)揮積極的作用。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為混合對(duì)照品色譜圖。
[0015]圖2為內(nèi)標(biāo)物秋水仙堿色譜圖。
[0016]圖3為臨床樣品色譜圖。
[0017]圖4為地西泮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0018]圖5為勞拉西泮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0019]圖6為氯硝西泮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0020]圖7為艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0021 ] 圖8為阿普唑侖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0022]圖9為酒石酸唑吡坦標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做一個(gè)詳細(xì)的說(shuō)明。
[0024]UHPLC-CAD聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法，該方法包括以下的步驟:
I)對(duì)照品的配制
精密稱取地西泮對(duì)照品45.79mg、勞拉西泮對(duì)照品43.39mg、氯硝西泮對(duì)照品47.51mg、艾司唑侖對(duì)照品44.36mg、阿普唑侖對(duì)照品43.60mg,酒石酸唑吡坦對(duì)照品25.00 mg分別置于10mL容量瓶中，加入乙腈溶解，分別定量配成質(zhì)量濃度為0.4579mg/mL的地西泮對(duì)照品溶液、0.4339mg/mL的勞拉西泮對(duì)照品溶液、0.475 lmg/mL的氯硝西泮對(duì)照品溶液、
0.4436mg/mL的艾司唑侖對(duì)照品溶液、0.4360mg/mL的阿普唑侖對(duì)照品溶液和0.2500mg/mL的酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液，備用。
[0025]2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制
精密稱取秋水仙堿對(duì)照品13.37mg，置于1mL容量瓶中，加入乙腈溶解，精密吸取上述溶液2ml，置于1mL容量瓶中，加入乙腈溶解，配成質(zhì)量濃度為26.74 μ g/mL的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)溶液，備用。
[0026]3)樣品溶液制備
經(jīng)醫(yī)院倫理委員審核同意，經(jīng)患者知情告知后，文化相關(guān)精神障礙(幻聽幻想、被害妄想)患者服用勞拉西泮后，取血3mL，分離得到血清，精密量取血清1.0mL，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)溶液25uL，渦旋混勻，13000r/min高速離心15min后，取上清液60 uL過(guò)SPE柱；SPE柱首先用甲醇3mL和水3mL活化SPE柱，活化時(shí)控制流速3-5min/mL,上樣后用ImL的水淋洗,再用80%甲醇ImL洗脫,洗脫時(shí)控制流速l-2mL/min,洗脫下來(lái)的溶液，水浴揮干溶劑，用50 μ L乙腈溶解，即得樣品溶液，備用。
[0027]4)流動(dòng)相溶液的配制
精密量取色譜純乙腈，作為流動(dòng)相A相，備用；精密量取純水，作為流動(dòng)相B相，備用。
[0028]5)色譜條件的設(shè)置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為4.6X250mm，填料內(nèi)徑為5.0 μ m的色譜柱；柱溫為30°C，流動(dòng)相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣10yL，優(yōu)化的流動(dòng)相梯度洗脫程序:0-7.00min，45%A相和55%B相；
7.01min-15.0Omin，70%A 相和 30%B 相；15.01min-20.0Omin，45%A 相和 55%B 相，進(jìn)行梯度洗脫；采用電噴霧檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè)。
[0029]6)電噴霧檢測(cè)器條件的優(yōu)化
選擇電噴霧檢測(cè)器，氮?dú)鈮毫?5psi，量程ΙΟΟρΑ，霧化溫度30°C ；
取步驟I)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，分別進(jìn)樣10 μ L，由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
[0030]7)樣品測(cè)定取步驟3)的樣品溶液，分別進(jìn)樣20 μ L，在步驟5)的色譜條件與步驟6)的檢測(cè)條件下，測(cè)定，分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦混合對(duì)照品、秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物以及樣品的色譜圖，樣品色譜中，與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品以及秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處，為血清樣品中的待測(cè)藥物，以及定量加入的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物；且各物質(zhì)色譜圖與對(duì)照品色譜圖一致。[0031 ] 8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制
各精密吸取步驟I)的混合對(duì)照品溶液，置于容量瓶中，加乙腈，定量稀釋成為濃度梯度為 183.16 μ g/mL、91.58 μ g/mL、45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL、9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對(duì)照品溶液，177.44 μ g/mL,88.72 μ g/mL,44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對(duì)照品溶液，173.56 μ g/mL,86.78 μ g/mL,43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL、8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對(duì)照品溶液，190.04 μ g/mL、95.02 μ g/mL、47.51 μ g/mL、19.00 μ g/mL、9.52 μ g/mL、1.81 μ g/mL 的氯硝西泮對(duì)照品溶液，174.40 μ g/mL、87.20 μ g/mL,43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對(duì)照品溶液，以及 100.00 μ g/mL、50.00 μ g/mL、25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL的酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液，備用。
[0032]9)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
經(jīng)醫(yī)院倫理委員審核同意，經(jīng)患者知情告知后，取1.0mL睡眠障礙患者的空白血清，分為6份，編號(hào)I?6號(hào)，I號(hào)加入183.16 μ g/mL地西泮，177.44 μ g/mL艾司唑侖，173.56 μ g/mL勞拉西泮，190.04 μ g/mL氯硝西泮，190.04 μ g/mL阿普唑侖，100.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;2號(hào)加入91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL艾司唑侖，86.78 μ g/mL勞拉西泮，95.02 μ g/mL氯硝西泮,87.20 μ g/mL阿普唑侖,50.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各10 μ L ; 3號(hào)加入45.79 μ g/mL地西泮，44.36 μ g/mL艾司唑侖，43.39 μ g/mL勞拉西泮，47.51 μ g/mL氯硝西泮,43.60 μ g/mL阿普唑侖,25.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;4號(hào)加入18.32 μ g/mL地西泮，17.74 μ g/mL艾司唑侖，17.74 μ g/mL勞拉西泮，19.00 μ g/mL氯硝西泮，17.44 μ g/mL阿普唑侖，10.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各1yL; 5號(hào)加入9.16 μ g/mL地西泮，8.72 μ g/mL艾司唑侖，8.68 μ g/mL勞拉西泮，9.52 μ g/mL氯硝西泮，8.72 μ g/mL阿普唑侖，8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各1yL; 6號(hào)加入1.83μ g/mL地西泮，1.77μ g/mL艾司唑侖，1.74μ g/mL勞拉西泮，
1.81 μ g/mL氯硝西泮，1.74 μ g/mL阿普唑侖，1.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各1uL0按照步驟3)方法操作，得到梯度加標(biāo)樣品溶液；在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定。以6種藥物各自峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)萬(wàn)古霉素濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，地西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940)，勞拉西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0758χ-
0.5796 (r=0.9968)，阿普唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =0.0813x_0.6502 (r=0.9946)，艾司唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0666x-0.5455 (r=0.9939)，氯硝西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 0.0622χ_0.4402(r=0.9972)，酒石酸唑吡坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.1428χ-0.6019 (r=0.9963)。其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，X為被測(cè)物質(zhì)量濃度。
[0033]10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算
記錄患者血清中勞拉西泮和秋水仙堿的峰面積，計(jì)算藥物與內(nèi)標(biāo)秋水仙堿峰面積的比值，代入勞拉西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出藥物的質(zhì)量濃度，即為血清中的藥物濃度。結(jié)果見表I。
[0034]表1.臨床文化相關(guān)精神疾病患者服用勞拉西泮后血藥濃度表
羅號(hào)|取血時(shí)間I血清藥物濃度(ng/mL)
12014.07.0122:0014.33
22014.07.0206:0072.43
32014.07.0222:0093.79
4|2Q14.07.1106:00+53.38■
【權(quán)利要求】
1.UHPLC-CAD聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法，所述的6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物為地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦其特征在于該方法包括以下的步驟: . 1)對(duì)照品的配制 精密稱取地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦對(duì)照品，分別置于容量瓶中，加入乙腈溶解，配成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，備用，精密量取6種對(duì)照品溶液，配成所需質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，備用； .2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取秋水仙堿對(duì)照品，置于容量瓶中，加入乙腈溶解,配成所需質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)溶液，備用； .3)樣品溶液制備 按照睡眠障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)，入選患者，臨床醫(yī)生根據(jù)癥狀給予I種或數(shù)種鎮(zhèn)靜催眠藥物進(jìn)行治療，患者服藥后定時(shí)取血，分離血清，置于具塞離心試管中，定量加入步驟2)的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，高速離心后，分離上清液；上清液中加入至甲醇和水活化后的SPE柱，上樣后用水淋洗，適當(dāng)濃度的甲醇洗脫，洗脫液揮干，用乙腈溶解，即得樣品溶液，備用； .4)流動(dòng)相溶液的配制 取色譜純乙腈，作為流動(dòng)相A相，備用；取純水，作為流動(dòng)相B相，備用； .5)色譜條件的設(shè)置 選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為4.6X250mm，填料內(nèi)徑為5.0 μ m的色譜柱；柱溫為30°C，流動(dòng)相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，定量進(jìn)樣，進(jìn)行梯度洗脫；采用電噴霧檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè)； .6)電噴霧檢測(cè)器條件優(yōu)化 選擇電噴霧檢測(cè)器，氮?dú)鈮毫?5psi，量程ΙΟΟρΑ，霧化溫度30°C ； 取步驟I)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液，定量進(jìn)樣，由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖； .7)樣品測(cè)定 取步驟3)的樣品溶液，分別定量進(jìn)樣，在步驟5)與步驟6)的條件下，測(cè)定，分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品，秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物以及樣品的色譜圖，樣品圖譜中，與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品以及秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處，為血清樣品中的待測(cè)地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦，以及定量加入的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物； .8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制 精密吸取步驟I)的地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液，配制成混合對(duì)照品溶液，加乙腈，稀釋成梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，備用； .9)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取睡眠障礙的患者空白血清多份，分別定量加入步驟8)的梯度濃度混合對(duì)照品溶液，按照步驟3)方法操作，得到梯度加標(biāo)樣品溶液，在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定；以地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰的濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，地西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940)，勞拉西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0758x- 0.5796 (r=0.9968)，阿普唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =0.0813χ_0.6502(r=0.9946)，艾司唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0666χ-0.5455 (r=0.9939)，氯硝西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 0.0622x-0.4402 (r=0.9972)，酒石酸唑吡坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.1428x_0.6019(r=0.9963);其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，x為被測(cè)物質(zhì)量濃度； .10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算 記錄地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦和秋水仙堿的峰面積，計(jì)算6種藥物與內(nèi)標(biāo)秋水仙堿峰面積的比值，分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出6種藥物的質(zhì)量濃度；即為血清中藥物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法，其特征在于步驟5)的梯度洗脫程序如下:0-7.00min，45%A相和55%B相；.7.01min-15.0Omin, 70%A 相和 30%B 相；15.01min-20.0Omin, 45%A 相和 55%B 相。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法，其特征在于步驟6)的電噴霧檢測(cè)器條件如下:氮?dú)鈮毫?5psi，量程ΙΟΟρΑ，霧化溫度 30。。。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法，其特征在于步驟8)定量稀釋成濃度梯度為183.16yg/mL,91.58yg/mL,.45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL,9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對(duì)照品溶液，177.44 μ g/mL、.88.72 μ g/mL,44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對(duì)照品溶液，173.56 μ g/mL、86.78 μ g/mL、43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL、8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對(duì)照品溶液，190.04 μ g/mL、95.02 μ g/mL、47.51 μ g/mL、19.00 μ g/mL、9.52 μ g/mL、.1.81 μ g/mL 的氯硝西泮對(duì)照品溶液，174.40 μ g/mL,87.20 μ g/mL,43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL、8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對(duì)照品溶液，以及 100.00 μ g/mL,50.00 μ g/mL、.25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL 的酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法，其特征在于步驟9)中取1.0mL睡眠障礙的患者空白血清6份，編號(hào)I?6號(hào)，I號(hào)加入 183.16 μ g/mL 地西泮，177.44 μ g/mL 艾司唑侖，173.56 μ g/mL 勞拉西泮，190.04 μ g/mL氯硝西泮，190.04 μ g/mL阿普唑侖，100.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ；.2號(hào)加入 91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL 艾司唑侖，86.78 μ g/mL 勞拉西泮，95.02 μ g/mL 氯硝西泮，87.20 μ g/mL阿普唑侖，50.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各1yL; 3號(hào)加入 45.79 μ g/mL 地西泮，44.36 μ g/mL 艾司唑侖，43.39 μ g/mL 勞拉西泮，47.51 μ g/mL 氯硝西泮，43.60 μ g/mL阿普唑侖，25.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;4號(hào)加入 18.32 μ g/mL 地西泮，17.74 μ g/mL 艾司唑侖，17.74 μ g/mL 勞拉西泮，19.00 μ g/mL 氯硝西泮，17.44 μ g/mL阿普唑侖，10.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ; 5號(hào)加入.9.16 μ g/mL地西泮，8.72 μ g/mL艾司唑侖，8.68 μ g/mL勞拉西泮，9.52 μ g/mL氯硝西泮，.8.72 μ g/mL阿普唑侖，8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ; 6號(hào)加入1.83 μ g/mL地西泮，1.77 μ g/mL艾司唑侖，1.74 μ g/mL勞拉西泮，1.81 μ g/mL氯硝西泮，1.74 μ g/mL阿普唑侖，1.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L0
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104133030SQ201410362714
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】張揚(yáng), 陳炯, 壽旦, 馬永春 申請(qǐng)人:浙江省中醫(yī)藥研究院