两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

Uhplc-cad技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法

文檔序號(hào):6235576閱讀:800來(lái)源:國(guó)知局
Uhplc-cad技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及UHPLC-CAD聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法,所述的6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物為地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦其特征在于該方法包括以下的步驟:1)對(duì)照品的配制、2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制、3)樣品溶液制備、4)流動(dòng)相溶液的配制、5)色譜條件的設(shè)置、6)電噴霧檢測(cè)器條件的優(yōu)化、7)樣品測(cè)定、8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制、9)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、?10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算。本發(fā)明的方法先進(jìn),臨床應(yīng)用前景及作用良好,能夠?yàn)榕R床合理用藥,提高藥物療效、減低毒副作用及藥物費(fèi)用,發(fā)揮積極的作用。
【專利說(shuō)明】UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種屬于藥物領(lǐng)域,尤其涉及一種采用高效液相-電噴霧檢測(cè)聯(lián)用技術(shù),同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代社會(huì)生活由于工作競(jìng)爭(zhēng)激烈,生活節(jié)奏緊張,外界各種刺激因素影響著人們的情緒,產(chǎn)生失眠、緊張,進(jìn)而發(fā)展為焦慮、抑郁等各種心理和生理問(wèn)題,給家庭和社會(huì)都造成巨大的壓力。國(guó)外的一項(xiàng)調(diào)查顯示50%-60%的成年人患有不同程度的睡眠障礙,我國(guó)失眠的發(fā)病率高達(dá)40%。巴比妥類藥物作為第I代鎮(zhèn)靜催眠藥,由于有抑制呼吸等不良反應(yīng),近年來(lái)已基本被其他有關(guān)藥物所取代。目前臨床上常用的鎮(zhèn)靜、催眠和抗焦慮藥物為苯二氮卓類藥物(第2代鎮(zhèn)靜催眠藥物),以及新一代的非苯二氮卓類藥物(第3代鎮(zhèn)靜催眠藥物),均可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的抑制,隨著用量的加大,臨床表現(xiàn)可自輕度的鎮(zhèn)靜到催眠甚至昏迷。苯二氮卓類藥物中代表藥物主要有地西泮、阿普唑侖、勞拉西泮等,其主要作用機(jī)制為通過(guò)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性受體GABAa( Y -氨基丁酸A)受體復(fù)合體中的Y -亞單位結(jié)合,活化GABAa受體,促進(jìn)GABA ( Y -氨基丁酸)與GABAa受體的結(jié)合,使Cl—通道開放頻率增加,誘導(dǎo)更多的Cl—內(nèi)流,加強(qiáng)GABA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的效應(yīng)。第3代非苯二氮卓類藥物中代表藥物主要有酒石酸唑吡坦、扎來(lái)普隆、佐匹克隆等,其中酒石酸唑吡坦的作用機(jī)制為選擇性地作用于苯二氮卓集合位點(diǎn)的BZ1 ( ω P亞型,增進(jìn)GABA對(duì)GABAa受體親和性,導(dǎo)致Cl—通道開放。上述藥物通常用于睡眠障礙的治療,但在重度抑郁癥,文化相關(guān)精神障礙,強(qiáng)迫癥以及精神分裂癥等精神疾病的對(duì)癥治療中也有廣泛應(yīng)用,與抗抑郁藥物、抗精神分裂藥物以及其他精神類藥物聯(lián)合應(yīng)用,對(duì)緩解躁狂、焦慮、妄想等精神癥狀療效確切,顯著提高綜合療效。
[0003]然而,臨床上鎮(zhèn)靜催眠類藥物往往按藥物半衰期連續(xù)給藥或根據(jù)臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)給藥,由于患者病情程度不同以及個(gè)體差異,藥物的開始起效時(shí)間和在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)的時(shí)間差異較大,常導(dǎo)致藥物的過(guò)量使用。再者,由于此類患者的特殊性,依從性較差,藥物使用中時(shí)常出現(xiàn)頓服過(guò)量或自行減藥等現(xiàn)象,直接影響治療效果,并且易導(dǎo)致戒斷綜合征,甚至可能出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥。因此鎮(zhèn)靜催眠類藥物的合理使用是與臨床療效及病人安全密切相關(guān)的關(guān)鍵因素,若能做到血藥濃度的快速檢測(cè),并進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),治療時(shí)即可根據(jù)患者個(gè)體特點(diǎn)調(diào)給藥方案,則可能采用最小有效劑量,達(dá)到發(fā)揮療效的目的,避免精神藥物的過(guò)量使用。
[0004]目前對(duì)于鎮(zhèn)靜催眠類藥物的含量方法主要有高效液相色譜-紫外檢測(cè)器(HPLC-UV)、高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)、氣相色譜(GC)、質(zhì)譜(MS)等分析方法。GC以及GC-MS對(duì)檢測(cè)低沸點(diǎn)樣品具有優(yōu)勢(shì),對(duì)苯二氮卓類藥物的檢測(cè)并非最佳,且儀器價(jià)格昂貴,維護(hù)成本高,普及程度不夠,推廣性較差;HPLC-UV及HPLC-DAD作為檢測(cè)手段的文獻(xiàn),多采用不同檢測(cè)波長(zhǎng),分別進(jìn)行分析檢測(cè),對(duì)于同時(shí)服用兩種或兩種以上的鎮(zhèn)靜催眠類藥物的患者,無(wú)法提供一測(cè)多評(píng)的圖譜信息。
[0005]電噴霧檢測(cè)器(CAD)是目前通用的檢測(cè)器,與HPLC聯(lián)用時(shí),HPLC洗脫液經(jīng)霧化器中氮?dú)獾淖饔枚F化,其中較大的液滴在碰撞器的作用下經(jīng)廢液管流出,較小的溶質(zhì)(分析物)液滴在室溫下干燥,形成溶質(zhì)顆粒。同時(shí),用于載氣的氮?dú)夥至餍纬傻牡诙傻獨(dú)饬鹘?jīng)過(guò)電暈式裝置(含高壓鉬金絲電極)形成帶正電荷的氮?dú)忸w粒,與溶質(zhì)顆粒反向相遇時(shí)經(jīng)碰撞使溶質(zhì)顆粒帶上正電。它不依賴于分析物的結(jié)構(gòu),也不需要將分析物電離,只要該物質(zhì)屬于半揮發(fā)性或非揮發(fā)性化合物就可以被檢出,且靈敏度可以達(dá)到Pg級(jí)別,重現(xiàn)性良好,是紫外(UV)、質(zhì)譜(MS)、示差折光(RI)與蒸發(fā)光散射(ELSD)等常用檢測(cè)器的有力補(bǔ)充。本項(xiàng)目采用UHPLC-CAD的檢測(cè)技術(shù),分析壓力較常規(guī)液相有所增大,使分析時(shí)間明顯縮短,提高了分析效率;同時(shí)檢測(cè)器既能克服DAD檢測(cè)器對(duì)于痕量成分檢測(cè)時(shí)響應(yīng)值較低的劣勢(shì),又能解決不同紫外吸收波長(zhǎng)的藥物無(wú)法一次性檢測(cè)的問(wèn)題,獲得低檢測(cè)限的含量測(cè)定結(jié)果,實(shí)現(xiàn)多種該類藥物一次性、快速的測(cè)定,且該項(xiàng)技術(shù)相較于GC、HPLC-MS等分析技術(shù),操作簡(jiǎn)便,維護(hù)及使用成本較低。
[0006]因此,本發(fā)明建立的針對(duì)多種鎮(zhèn)靜催眠類藥物的檢測(cè),分析時(shí)間短、靈敏度高,重現(xiàn)性好,能實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)的檢測(cè)方法,能夠?yàn)榕R床藥物濃度檢測(cè)提供檢測(cè)方法,達(dá)到提高藥物使用效率,降低毒副反應(yīng)的目的。經(jīng)文獻(xiàn)檢索,目前采用UHPLC-CAD方法測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物(包含2代及3代藥物)含量的方法,以及精神科患者血藥監(jiān)測(cè)應(yīng)用,未見文獻(xiàn)報(bào)道及專利公開。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是建立一種同時(shí)測(cè)定血清中6種苯二氮卓類藥物含量的檢測(cè)方法,為臨床藥物濃度監(jiān)測(cè)提供方案。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明建立了一種應(yīng)用高液相色譜-電噴霧檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-CAD),同時(shí)測(cè)定血清6種苯二氮卓類藥物含量的方法,該方法包括以下的步驟:
1)對(duì)照品的配制
精密稱取地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西對(duì)照品,分別置于容量瓶中,加入乙腈溶解,配成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液,備用,精密稱取酒石酸唑吡坦對(duì)照品,置于容量瓶中,加入純水溶解,配成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液,備用,精密量取6種對(duì)照品溶液,配成所需質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,備用;
2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制
精密稱取秋水仙堿對(duì)照品,置于容量瓶中,加入乙腈溶解,配成所需質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)溶液,備用;
3)樣品溶液制備
精密量取睡眠障礙患者服藥后血清,置于具塞離心試管中,定量加入步驟2)的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)溶液,渦旋混勻,高速離心后,分離上清液;上清液中加入至甲醇和水活化后的SPE柱,上樣后用水淋洗,適當(dāng)濃度的甲醇洗脫,洗脫液揮干,用乙腈溶解,即得樣品溶液,備用;
4)流動(dòng)相溶液的配制
取一定量的色譜純乙腈,作為流動(dòng)相A相,備用;取一定量的純水,作為流動(dòng)相B相,備用;
5)色譜條件的設(shè)置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,規(guī)格為4.6 X 250_,填料內(nèi)徑為5μπι的色譜柱;柱溫為30°C,流動(dòng)相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液,定量進(jìn)樣,進(jìn)行梯度洗脫;采用電噴霧檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè);
6)電噴霧檢測(cè)器條件的優(yōu)化
選擇電噴霧檢測(cè)器,氮?dú)鈮毫?5psi,量程ΙΟΟρΑ,霧化溫度30°C ;
取步驟I)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液,定量進(jìn)樣,并由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的色譜圖;
7)樣品測(cè)定
取步驟3)的樣品溶液,分別定量進(jìn)樣,在步驟5)與步驟6)的條件下,測(cè)定,分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品,秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物以及樣品的色譜圖,樣品圖譜中,與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品以及秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處,為血清樣品中的待測(cè)地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦,以及定量加入的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物;
8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制
精密吸取步驟I)的地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液,配制成混合對(duì)照品溶液,加乙腈,稀釋成梯度濃度的混合對(duì)照品溶液,備用;
9)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
取睡眠障礙的患者空白組織液多份,分別定量加入步驟8)的梯度濃度混合對(duì)照品溶液,按照步驟3)方法操作,得到梯度加標(biāo)樣品溶液,在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定;以地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰的濃度進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程,地西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940),勞拉西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0758x- 0.5796 (r=0.9968),阿普唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =0.0813χ_0.6502(r=0.9946),艾司唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0666χ-0.5455 (r=0.9939),氯硝西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 0.0622x-0.4402 (r=0.9972),酒石酸唑吡坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.1428x_0.6019(r=0.9963)。其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值,x為被測(cè)物質(zhì)量濃度;
10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算
記錄地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦和秋水仙堿的峰面積,計(jì)算6種藥物與內(nèi)標(biāo)秋水仙堿峰面積的比值,分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出6種藥物的質(zhì)量濃度;即為血清中藥物的濃度。
[0009]作為進(jìn)一步改進(jìn),上述的步驟5)中流動(dòng)相梯度洗脫程序如下:0-7.0Omin, 45%A相和 55%B 相;7.01min-15.0Omin,70%A 相和 30%B 相;15.01min-20.0Omin,45%A 相和 55%B 相。
[0010]作為進(jìn)一步改進(jìn),上述的步驟8)定量稀釋成濃度梯度為183.16 μ g/mL、91.58 μ g/mL、45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL、9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對(duì)照品溶液,177.44 μ g/mL、88.72 μ g/mL、44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL、8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對(duì)照品溶液,173.56 μ g/mL,86.78 μ g/mL,43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL,8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對(duì)照品溶液,190.04 μ g/mL,95.02 μ g/mL,47.51 μ g/mL、19.0O μ g/mL,9.52 μ g/mL、L 81 μ g/mL 的氯硝西泮對(duì)照品溶液,174.40 μ g/mL,87.20 μ g/mL、43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對(duì)照品溶液,以及100.00 μ g/mL、50.00 μ g/mL、25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL 的酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液。
[0011]作為進(jìn)一步改進(jìn),上述的步驟9)中取LOmL睡眠障礙的患者空白血清6份,編號(hào)I?6號(hào),I號(hào)加入183.16 μ g/mL地西泮,177.44 μ g/mL艾司唑侖,173.56 μ g/mL勞拉西泮,190.04 μ g/mL氯硝西泮,190.04 μ g/mL阿普唑侖,100.00 μ g/mL酒石酸唑卩比坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;2號(hào)加入91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL艾司唑侖,86.78 μ g/mL勞拉西泮,95.02 μ g/mL氯硝西泮,87.20 μ g/mL阿普唑侖,50.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ; 3號(hào)加入45.79 μ g/mL地西泮,44.36 μ g/mL艾司唑侖,43.39 μ g/mL勞拉西泮,47.51 μ g/mL氯硝西泮,43.60 μ g/mL阿普唑侖,25.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;4號(hào)加入18.32 μ g/mL地西泮,17.74 μ g/mL艾司唑侖,17.74 μ g/mL勞拉西泮,19.00 μ g/mL氯硝西泮,17.44 μ g/mL阿普唑侖,10.00 μ g/mL酒石酸唑卩比坦對(duì)照品溶液各1yL; 5號(hào)加入9.16 μ g/mL地西泮,8.72 μ g/mL艾司唑侖,8.68 μ g/mL勞拉西泮,9.52 μ g/mL氯硝西泮,8.72 μ g/mL阿普唑侖,8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各1yL; 6號(hào)加入1.83 μ g/mL地西泮,1.77 μ g/mL艾司唑侖,1.74 μ g/mL勞拉西泮,1.81 μ g/mL氯硝西泮,1.74 μ g/mL阿普唑侖,1.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各10 μ L0
[0012]本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案及步驟,具有以下的特點(diǎn):
1、方法先進(jìn)性
UHPLC-CAD聯(lián)用技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)較先進(jìn)的分析檢測(cè)手段,與傳統(tǒng)的液相色譜-紫外檢測(cè)器聯(lián)用、氣相色譜、光譜分析方法比,分析時(shí)間較常規(guī)液相顯著縮短,同時(shí)由于采用通用檢測(cè)器,實(shí)現(xiàn)了不同種類、不同波長(zhǎng)的藥物的同時(shí)測(cè)定,具有一測(cè)多評(píng)的優(yōu)越性。本發(fā)明首次采用該技術(shù)同時(shí)測(cè)定睡眠障礙患者血液中地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦的含量,方法先進(jìn)可行,能夠?yàn)樵撀?lián)用技術(shù)開展多組分化合物的同時(shí)定量測(cè)定應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0013]2、臨床應(yīng)用前景及作用良好
藥物濃度檢測(cè)作為臨床安全、合理用藥的重要手段,能夠提供體內(nèi)藥物濃度數(shù)據(jù)。本方法建立的方法能夠?yàn)榈匚縻?、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦的藥物濃度監(jiān)測(cè)提供切實(shí)可行的方法,臨床應(yīng)用前景良好,能夠?yàn)榕R床合理用藥,提高藥物療效、減低毒副作用及藥物費(fèi)用,發(fā)揮積極的作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為混合對(duì)照品色譜圖。
[0015]圖2為內(nèi)標(biāo)物秋水仙堿色譜圖。
[0016]圖3為臨床樣品色譜圖。
[0017]圖4為地西泮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0018]圖5為勞拉西泮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0019]圖6為氯硝西泮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0020]圖7為艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0021 ] 圖8為阿普唑侖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0022]圖9為酒石酸唑吡坦標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做一個(gè)詳細(xì)的說(shuō)明。
[0024]UHPLC-CAD聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法,該方法包括以下的步驟:
I)對(duì)照品的配制
精密稱取地西泮對(duì)照品45.79mg、勞拉西泮對(duì)照品43.39mg、氯硝西泮對(duì)照品47.51mg、艾司唑侖對(duì)照品44.36mg、阿普唑侖對(duì)照品43.60mg,酒石酸唑吡坦對(duì)照品25.00 mg分別置于10mL容量瓶中,加入乙腈溶解,分別定量配成質(zhì)量濃度為0.4579mg/mL的地西泮對(duì)照品溶液、0.4339mg/mL的勞拉西泮對(duì)照品溶液、0.475 lmg/mL的氯硝西泮對(duì)照品溶液、
0.4436mg/mL的艾司唑侖對(duì)照品溶液、0.4360mg/mL的阿普唑侖對(duì)照品溶液和0.2500mg/mL的酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液,備用。
[0025]2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制
精密稱取秋水仙堿對(duì)照品13.37mg,置于1mL容量瓶中,加入乙腈溶解,精密吸取上述溶液2ml,置于1mL容量瓶中,加入乙腈溶解,配成質(zhì)量濃度為26.74 μ g/mL的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)溶液,備用。
[0026]3)樣品溶液制備
經(jīng)醫(yī)院倫理委員審核同意,經(jīng)患者知情告知后,文化相關(guān)精神障礙(幻聽幻想、被害妄想)患者服用勞拉西泮后,取血3mL,分離得到血清,精密量取血清1.0mL,置于具塞離心試管中,定量加入步驟2)的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)溶液25uL,渦旋混勻,13000r/min高速離心15min后,取上清液60 uL過(guò)SPE柱;SPE柱首先用甲醇3mL和水3mL活化SPE柱,活化時(shí)控制流速3-5min/mL,上樣后用ImL的水淋洗,再用80%甲醇ImL洗脫,洗脫時(shí)控制流速l-2mL/min,洗脫下來(lái)的溶液,水浴揮干溶劑,用50 μ L乙腈溶解,即得樣品溶液,備用。
[0027]4)流動(dòng)相溶液的配制
精密量取色譜純乙腈,作為流動(dòng)相A相,備用;精密量取純水,作為流動(dòng)相B相,備用。
[0028]5)色譜條件的設(shè)置
選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,規(guī)格為4.6X250mm,填料內(nèi)徑為5.0 μ m的色譜柱;柱溫為30°C,流動(dòng)相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液,進(jìn)樣10yL,優(yōu)化的流動(dòng)相梯度洗脫程序:0-7.00min,45%A相和55%B相;
7.01min-15.0Omin,70%A 相和 30%B 相;15.01min-20.0Omin,45%A 相和 55%B 相,進(jìn)行梯度洗脫;采用電噴霧檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè)。
[0029]6)電噴霧檢測(cè)器條件的優(yōu)化
選擇電噴霧檢測(cè)器,氮?dú)鈮毫?5psi,量程ΙΟΟρΑ,霧化溫度30°C ;
取步驟I)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液,分別進(jìn)樣10 μ L,由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
[0030]7)樣品測(cè)定取步驟3)的樣品溶液,分別進(jìn)樣20 μ L,在步驟5)的色譜條件與步驟6)的檢測(cè)條件下,測(cè)定,分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦混合對(duì)照品、秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物以及樣品的色譜圖,樣品色譜中,與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品以及秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處,為血清樣品中的待測(cè)藥物,以及定量加入的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物;且各物質(zhì)色譜圖與對(duì)照品色譜圖一致。[0031 ] 8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制
各精密吸取步驟I)的混合對(duì)照品溶液,置于容量瓶中,加乙腈,定量稀釋成為濃度梯度為 183.16 μ g/mL、91.58 μ g/mL、45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL、9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對(duì)照品溶液,177.44 μ g/mL,88.72 μ g/mL,44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對(duì)照品溶液,173.56 μ g/mL,86.78 μ g/mL,43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL、8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對(duì)照品溶液,190.04 μ g/mL、95.02 μ g/mL、47.51 μ g/mL、19.00 μ g/mL、9.52 μ g/mL、1.81 μ g/mL 的氯硝西泮對(duì)照品溶液,174.40 μ g/mL、87.20 μ g/mL,43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對(duì)照品溶液,以及 100.00 μ g/mL、50.00 μ g/mL、25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL的酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液,備用。
[0032]9)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
經(jīng)醫(yī)院倫理委員審核同意,經(jīng)患者知情告知后,取1.0mL睡眠障礙患者的空白血清,分為6份,編號(hào)I?6號(hào),I號(hào)加入183.16 μ g/mL地西泮,177.44 μ g/mL艾司唑侖,173.56 μ g/mL勞拉西泮,190.04 μ g/mL氯硝西泮,190.04 μ g/mL阿普唑侖,100.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;2號(hào)加入91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL艾司唑侖,86.78 μ g/mL勞拉西泮,95.02 μ g/mL氯硝西泮,87.20 μ g/mL阿普唑侖,50.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各10 μ L ; 3號(hào)加入45.79 μ g/mL地西泮,44.36 μ g/mL艾司唑侖,43.39 μ g/mL勞拉西泮,47.51 μ g/mL氯硝西泮,43.60 μ g/mL阿普唑侖,25.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;4號(hào)加入18.32 μ g/mL地西泮,17.74 μ g/mL艾司唑侖,17.74 μ g/mL勞拉西泮,19.00 μ g/mL氯硝西泮,17.44 μ g/mL阿普唑侖,10.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各1yL; 5號(hào)加入9.16 μ g/mL地西泮,8.72 μ g/mL艾司唑侖,8.68 μ g/mL勞拉西泮,9.52 μ g/mL氯硝西泮,8.72 μ g/mL阿普唑侖,8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各1yL; 6號(hào)加入1.83μ g/mL地西泮,1.77μ g/mL艾司唑侖,1.74μ g/mL勞拉西泮,
1.81 μ g/mL氯硝西泮,1.74 μ g/mL阿普唑侖,1.00 μ g/mL酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液各1uL0按照步驟3)方法操作,得到梯度加標(biāo)樣品溶液;在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定。以6種藥物各自峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)萬(wàn)古霉素濃度進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程,地西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940),勞拉西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0758χ-
0.5796 (r=0.9968),阿普唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =0.0813x_0.6502 (r=0.9946),艾司唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0666x-0.5455 (r=0.9939),氯硝西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 0.0622χ_0.4402(r=0.9972),酒石酸唑吡坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.1428χ-0.6019 (r=0.9963)。其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值,X為被測(cè)物質(zhì)量濃度。
[0033]10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算
記錄患者血清中勞拉西泮和秋水仙堿的峰面積,計(jì)算藥物與內(nèi)標(biāo)秋水仙堿峰面積的比值,代入勞拉西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出藥物的質(zhì)量濃度,即為血清中的藥物濃度。結(jié)果見表I。
[0034]表1.臨床文化相關(guān)精神疾病患者服用勞拉西泮后血藥濃度表
羅號(hào)|取血時(shí)間I血清藥物濃度(ng/mL)

12014.07.0122:0014.33

22014.07.0206:0072.43

32014.07.0222:0093.79
4|2Q14.07.1106:00+53.38■
【權(quán)利要求】
1.UHPLC-CAD聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法,所述的6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物為地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦其特征在于該方法包括以下的步驟: . 1)對(duì)照品的配制 精密稱取地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、取酒石酸唑吡坦對(duì)照品,分別置于容量瓶中,加入乙腈溶解,配成所需質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液,備用,精密量取6種對(duì)照品溶液,配成所需質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,備用; .2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取秋水仙堿對(duì)照品,置于容量瓶中,加入乙腈溶解,配成所需質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)溶液,備用; .3)樣品溶液制備 按照睡眠障礙診斷標(biāo)準(zhǔn),入選患者,臨床醫(yī)生根據(jù)癥狀給予I種或數(shù)種鎮(zhèn)靜催眠藥物進(jìn)行治療,患者服藥后定時(shí)取血,分離血清,置于具塞離心試管中,定量加入步驟2)的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)溶液,渦旋混勻,高速離心后,分離上清液;上清液中加入至甲醇和水活化后的SPE柱,上樣后用水淋洗,適當(dāng)濃度的甲醇洗脫,洗脫液揮干,用乙腈溶解,即得樣品溶液,備用; .4)流動(dòng)相溶液的配制 取色譜純乙腈,作為流動(dòng)相A相,備用;取純水,作為流動(dòng)相B相,備用; .5)色譜條件的設(shè)置 選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,規(guī)格為4.6X250mm,填料內(nèi)徑為5.0 μ m的色譜柱;柱溫為30°C,流動(dòng)相流速為0.8mL/min ;取步驟I)的對(duì)照品溶液與步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液,定量進(jìn)樣,進(jìn)行梯度洗脫;采用電噴霧檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰檢測(cè); .6)電噴霧檢測(cè)器條件優(yōu)化 選擇電噴霧檢測(cè)器,氮?dú)鈮毫?5psi,量程ΙΟΟρΑ,霧化溫度30°C ; 取步驟I)對(duì)照品溶液、步驟2)的內(nèi)標(biāo)溶液,定量進(jìn)樣,由此得到對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖; .7)樣品測(cè)定 取步驟3)的樣品溶液,分別定量進(jìn)樣,在步驟5)與步驟6)的條件下,測(cè)定,分別得到地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品,秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物以及樣品的色譜圖,樣品圖譜中,與地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品以及秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物相同保留時(shí)間處,為血清樣品中的待測(cè)地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦,以及定量加入的秋水仙堿內(nèi)標(biāo)物; .8)梯度濃度對(duì)照品溶液的配制 精密吸取步驟I)的地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液,配制成混合對(duì)照品溶液,加乙腈,稀釋成梯度濃度的混合對(duì)照品溶液,備用; .9)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取睡眠障礙的患者空白血清多份,分別定量加入步驟8)的梯度濃度混合對(duì)照品溶液,按照步驟3)方法操作,得到梯度加標(biāo)樣品溶液,在步驟7)的條件下進(jìn)行測(cè)定;以地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對(duì)地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦峰的濃度進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程,地西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0635x-0.5842 (r=0.9940),勞拉西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0758x- 0.5796 (r=0.9968),阿普唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =0.0813χ_0.6502(r=0.9946),艾司唑侖的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0666χ-0.5455 (r=0.9939),氯硝西泮的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y= 0.0622x-0.4402 (r=0.9972),酒石酸唑吡坦的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.1428x_0.6019(r=0.9963);其中y為被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值,x為被測(cè)物質(zhì)量濃度; .10)數(shù)據(jù)分析計(jì)算 記錄地西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、氯硝西泮、酒石酸唑吡坦和秋水仙堿的峰面積,計(jì)算6種藥物與內(nèi)標(biāo)秋水仙堿峰面積的比值,分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出6種藥物的質(zhì)量濃度;即為血清中藥物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法,其特征在于步驟5)的梯度洗脫程序如下:0-7.00min,45%A相和55%B相;.7.01min-15.0Omin, 70%A 相和 30%B 相;15.01min-20.0Omin, 45%A 相和 55%B 相。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法,其特征在于步驟6)的電噴霧檢測(cè)器條件如下:氮?dú)鈮毫?5psi,量程ΙΟΟρΑ,霧化溫度 30。。。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法,其特征在于步驟8)定量稀釋成濃度梯度為183.16yg/mL,91.58yg/mL,.45.79 μ g/mL、18.32 μ g/mL,9.16 μ g/mL、1.83 μ g/mL 的地西泮對(duì)照品溶液,177.44 μ g/mL、.88.72 μ g/mL,44.36 μ g/mL、17.74 μ g/mL,8.72 μ g/mL、1.77 μ g/mL 的艾司唑侖對(duì)照品溶液,173.56 μ g/mL、86.78 μ g/mL、43.39 μ g/mL、17.36 μ g/mL、8.68 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的勞拉西泮對(duì)照品溶液,190.04 μ g/mL、95.02 μ g/mL、47.51 μ g/mL、19.00 μ g/mL、9.52 μ g/mL、.1.81 μ g/mL 的氯硝西泮對(duì)照品溶液,174.40 μ g/mL,87.20 μ g/mL,43.60 μ g/mL、17.44 μ g/mL、8.72 μ g/mL、1.74 μ g/mL 的阿普唑侖對(duì)照品溶液,以及 100.00 μ g/mL,50.00 μ g/mL、.25.00 μ g/mL、10.00 μ g/mL、5.00 μ g/mL、1.00 μ g/mL 的酒石酸唑批坦對(duì)照品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UHPLC-CAD技術(shù)同時(shí)測(cè)定血清中6種鎮(zhèn)靜催眠類藥物含量的方法,其特征在于步驟9)中取1.0mL睡眠障礙的患者空白血清6份,編號(hào)I?6號(hào),I號(hào)加入 183.16 μ g/mL 地西泮,177.44 μ g/mL 艾司唑侖,173.56 μ g/mL 勞拉西泮,190.04 μ g/mL氯硝西泮,190.04 μ g/mL阿普唑侖,100.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;.2號(hào)加入 91.58 μ g/mL, 88.72 μ g/mL 艾司唑侖,86.78 μ g/mL 勞拉西泮,95.02 μ g/mL 氯硝西泮,87.20 μ g/mL阿普唑侖,50.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各1yL; 3號(hào)加入 45.79 μ g/mL 地西泮,44.36 μ g/mL 艾司唑侖,43.39 μ g/mL 勞拉西泮,47.51 μ g/mL 氯硝西泮,43.60 μ g/mL阿普唑侖,25.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ;4號(hào)加入 18.32 μ g/mL 地西泮,17.74 μ g/mL 艾司唑侖,17.74 μ g/mL 勞拉西泮,19.00 μ g/mL 氯硝西泮,17.44 μ g/mL阿普唑侖,10.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ; 5號(hào)加入.9.16 μ g/mL地西泮,8.72 μ g/mL艾司唑侖,8.68 μ g/mL勞拉西泮,9.52 μ g/mL氯硝西泮,.8.72 μ g/mL阿普唑侖,8.72 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L ; 6號(hào)加入1.83 μ g/mL地西泮,1.77 μ g/mL艾司唑侖,1.74 μ g/mL勞拉西泮,1.81 μ g/mL氯硝西泮,1.74 μ g/mL阿普唑侖,1.00 μ g/mL酒石酸唑吡坦對(duì)照品溶液各10 μ L0
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104133030SQ201410362714
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】張揚(yáng), 陳炯, 壽旦, 馬永春 申請(qǐng)人:浙江省中醫(yī)藥研究院
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产伦精品一区二区三区四那| 99久久综合免费| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美xxxx性猛交bbbb| 99久久中文字幕三级久久日本| 麻豆成人av视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国精品久久久久久国模美| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久 成人 亚洲| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费看光身美女| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久综合国产亚洲精品| av免费观看日本| 18+在线观看网站| 欧美3d第一页| 寂寞人妻少妇视频99o| 久热久热在线精品观看| 精品一区二区三区视频在线| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩伦理黄色片| 2022亚洲国产成人精品| 制服丝袜香蕉在线| 欧美区成人在线视频| 国产精品国产av在线观看| 高清毛片免费看| 春色校园在线视频观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日本vs欧美在线观看视频 | 99九九在线精品视频 | 黄色欧美视频在线观看| 又爽又黄a免费视频| 超碰97精品在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 秋霞伦理黄片| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲情色 制服丝袜| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日本免费在线观看一区| 久久久欧美国产精品| 国产69精品久久久久777片| 一本大道久久a久久精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲经典国产精华液单| 久久毛片免费看一区二区三区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 九色成人免费人妻av| 亚洲国产精品专区欧美| 黑丝袜美女国产一区| 午夜免费观看性视频| 日韩av免费高清视频| 亚洲av日韩在线播放| 国产av精品麻豆| 午夜视频国产福利| h视频一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产成人aa在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久人妻精品一区果冻| av在线观看视频网站免费| av有码第一页| 国产熟女欧美一区二区| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国模一区二区三区四区视频| 天堂8中文在线网| www.色视频.com| 欧美bdsm另类| 深夜a级毛片| 日本黄色日本黄色录像| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产色婷婷99| 国产精品久久久久久av不卡| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲久久久国产精品| 久久这里有精品视频免费| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产在线男女| 99热这里只有精品一区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲,一卡二卡三卡| 观看美女的网站| 偷拍熟女少妇极品色| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品视频女| 最新的欧美精品一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 91精品一卡2卡3卡4卡| a级一级毛片免费在线观看| 91成人精品电影| 少妇熟女欧美另类| 简卡轻食公司| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 一区二区三区四区激情视频| 午夜激情久久久久久久| 一级,二级,三级黄色视频| 精品酒店卫生间| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国产一级毛片在线| 在线观看www视频免费| 免费看av在线观看网站| 少妇人妻精品综合一区二区| 高清不卡的av网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 男女国产视频网站| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 中文天堂在线官网| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲国产日韩一区二区| 熟女av电影| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜老司机福利剧场| 国产精品熟女久久久久浪| 六月丁香七月| 中国三级夫妇交换| 久久99蜜桃精品久久| 免费大片18禁| 最黄视频免费看| 国产高清不卡午夜福利| 熟女电影av网| 丁香六月天网| 免费黄频网站在线观看国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品国产国语对白av| 久久97久久精品| 一级a做视频免费观看| 日韩大片免费观看网站| 日韩大片免费观看网站| 高清黄色对白视频在线免费看 | 91精品国产国语对白视频| 色吧在线观看| 777米奇影视久久| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲高清免费不卡视频| 熟女人妻精品中文字幕| 国产欧美亚洲国产| 国产成人午夜福利电影在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 中文字幕人妻丝袜制服| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人免费观看视频高清| 久久久久久久久久成人| 成人特级av手机在线观看| 只有这里有精品99| 免费人妻精品一区二区三区视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品国产露脸久久av麻豆| 永久免费av网站大全| 22中文网久久字幕| 又爽又黄a免费视频| 精品久久久噜噜| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 伊人久久国产一区二区| 热re99久久精品国产66热6| 97在线人人人人妻| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本欧美视频一区| 美女中出高潮动态图| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲精品456在线播放app| 日韩伦理黄色片| 91aial.com中文字幕在线观看| 一区二区av电影网| 美女国产视频在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产黄色视频一区二区在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产亚洲一区二区精品| 国产亚洲一区二区精品| 中文字幕制服av| 亚洲av不卡在线观看| av线在线观看网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 黄色欧美视频在线观看| 青春草视频在线免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 深夜a级毛片| 精华霜和精华液先用哪个| 午夜日本视频在线| 男女免费视频国产| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲中文av在线| 波野结衣二区三区在线| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲欧美日韩东京热| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产深夜福利视频在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 老熟女久久久| 国产成人精品一,二区| 蜜桃在线观看..| 99视频精品全部免费 在线| 日日啪夜夜撸| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产极品天堂在线| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产熟女欧美一区二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日韩在线观看h| 我的女老师完整版在线观看| 国产成人一区二区在线| 青春草国产在线视频| 少妇熟女欧美另类| 黄色怎么调成土黄色| 久久国产亚洲av麻豆专区| 一级毛片我不卡| 韩国高清视频一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 伦精品一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 中国三级夫妇交换| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品久久久久久久久免| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产一级毛片在线| 国产高清三级在线| 欧美人与善性xxx| 日本免费在线观看一区| 少妇人妻一区二区三区视频| 大片电影免费在线观看免费| 丰满少妇做爰视频| 中文字幕制服av| 久久婷婷青草| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产成人精品一,二区| 日韩大片免费观看网站| 国产综合精华液| 日韩亚洲欧美综合| 黑人高潮一二区| 激情五月婷婷亚洲| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丰满少妇做爰视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲精品自拍成人| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 色哟哟·www| 女性被躁到高潮视频| 欧美成人午夜免费资源| 午夜免费观看性视频| 九九在线视频观看精品| 久久精品国产自在天天线| 99久国产av精品国产电影| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲图色成人| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美人与善性xxx| 大话2 男鬼变身卡| 99热国产这里只有精品6| 有码 亚洲区| 精品少妇内射三级| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产黄片视频在线免费观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 丁香六月天网| 亚洲av二区三区四区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一级毛片 在线播放| 久久久久久久精品精品| 国产成人免费无遮挡视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 在线观看www视频免费| 久久久久久久亚洲中文字幕| 午夜福利,免费看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黄色日韩在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 中国三级夫妇交换| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 51国产日韩欧美| 国产精品人妻久久久影院| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久久久久久久久久丰满| 黑丝袜美女国产一区| 国产一区二区三区av在线| 亚州av有码| 国产有黄有色有爽视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲第一区二区三区不卡| 最黄视频免费看| 9色porny在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品国产自在天天线| 黄片无遮挡物在线观看| 一级毛片电影观看| 久久精品夜色国产| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 美女主播在线视频| 青青草视频在线视频观看| 久久人人爽人人片av| 成人综合一区亚洲| 九九在线视频观看精品| 国产熟女欧美一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 9色porny在线观看| a 毛片基地| 精品人妻熟女av久视频| 观看免费一级毛片| 日韩电影二区| 99re6热这里在线精品视频| 伊人亚洲综合成人网| 国产成人精品婷婷| 最近手机中文字幕大全| 乱人伦中国视频| 少妇高潮的动态图| 少妇人妻一区二区三区视频| 伦理电影免费视频| 麻豆成人午夜福利视频| 又爽又黄a免费视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 下体分泌物呈黄色| 免费看不卡的av| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av福利一区| 一本大道久久a久久精品| 久久久国产欧美日韩av| 中文字幕人妻丝袜制服| 一级毛片 在线播放| 热re99久久国产66热| 91精品国产九色| 国产又色又爽无遮挡免| www.av在线官网国产| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲情色 制服丝袜| 啦啦啦啦在线视频资源| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 只有这里有精品99| 青春草亚洲视频在线观看| 免费黄色在线免费观看| 美女中出高潮动态图| 十分钟在线观看高清视频www | 人妻制服诱惑在线中文字幕| 永久免费av网站大全| 亚洲欧洲国产日韩| 国产男人的电影天堂91| 高清不卡的av网站| 一本大道久久a久久精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 天堂8中文在线网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 另类亚洲欧美激情| 欧美三级亚洲精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产一区二区三区av在线| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 久久久久久久久久久丰满| 国产成人精品无人区| 国精品久久久久久国模美| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久久国产网址| 亚洲欧洲国产日韩| 简卡轻食公司| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 成人国产麻豆网| 日韩欧美精品免费久久| 久久久久久久久久久丰满| 波野结衣二区三区在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 美女福利国产在线| 99久久人妻综合| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲情色 制服丝袜| 韩国高清视频一区二区三区| 国产成人一区二区在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久久久久精品精品| 亚洲精品456在线播放app| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产熟女欧美一区二区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 午夜91福利影院| 老女人水多毛片| 91久久精品电影网| 国产精品免费大片| 日韩 亚洲 欧美在线| 色5月婷婷丁香| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品午夜福利在线看| 国产日韩欧美在线精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩中字成人| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久久久久久国产电影| 免费av不卡在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩欧美精品免费久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 久久久a久久爽久久v久久| 国产免费福利视频在线观看| 有码 亚洲区| 欧美3d第一页| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品一区二区免费观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 两个人免费观看高清视频 | 日韩欧美精品免费久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 99久久综合免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 91久久精品电影网| 青春草亚洲视频在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 中文天堂在线官网| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日本91视频免费播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲经典国产精华液单| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丝袜脚勾引网站| 国产毛片在线视频| 少妇丰满av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 少妇的逼水好多| 美女主播在线视频| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费看光身美女| 桃花免费在线播放| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品久久久久久久电影| 午夜激情久久久久久久| 午夜激情福利司机影院| 精品酒店卫生间| 亚洲自偷自拍三级| 青春草国产在线视频| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲国产欧美在线一区| 精品一品国产午夜福利视频| 街头女战士在线观看网站| 日韩欧美精品免费久久| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲国产精品一区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线天堂最新版资源| 丰满乱子伦码专区| 九九爱精品视频在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 久久综合国产亚洲精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 91久久精品电影网| 精品人妻熟女av久视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产 一区精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| av天堂中文字幕网| 美女福利国产在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品一区二区三卡| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲欧美清纯卡通| 免费看光身美女| 亚洲精品乱久久久久久| 精品久久久噜噜| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产日韩欧美亚洲二区| 中文字幕人妻丝袜制服| 日韩成人av中文字幕在线观看| 高清欧美精品videossex| 亚洲欧美精品专区久久| av卡一久久| 人妻 亚洲 视频| 一级毛片 在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 边亲边吃奶的免费视频| 国产成人a∨麻豆精品| 国产免费又黄又爽又色| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 老司机亚洲免费影院| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 又爽又黄a免费视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 丝瓜视频免费看黄片| av天堂中文字幕网| 久久久久久伊人网av| 五月天丁香电影| 秋霞伦理黄片| 伊人亚洲综合成人网| 日韩av免费高清视频| 熟女人妻精品中文字幕| 中文字幕久久专区| 免费观看在线日韩| 97超视频在线观看视频| 婷婷色综合www| 中文字幕久久专区| 91久久精品电影网| 日韩三级伦理在线观看| 简卡轻食公司| av有码第一页| 亚洲精品色激情综合| 免费看av在线观看网站| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 大码成人一级视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 男女无遮挡免费网站观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级 | av在线老鸭窝| 成年人午夜在线观看视频| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲av男天堂| 国产69精品久久久久777片| 日韩人妻高清精品专区| 精品国产国语对白av| 男女边摸边吃奶| 丰满少妇做爰视频| 看十八女毛片水多多多| 久久6这里有精品| 亚洲无线观看免费| 欧美另类一区| 美女中出高潮动态图| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 色网站视频免费| 国产高清有码在线观看视频| 深夜a级毛片| 嫩草影院入口| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产91av在线免费观看| 十分钟在线观看高清视频www | 欧美精品一区二区免费开放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲国产av新网站| 涩涩av久久男人的天堂| 国产男人的电影天堂91| 99久久精品一区二区三区| 偷拍熟女少妇极品色| 久久女婷五月综合色啪小说| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一区二区三区精品91| 自线自在国产av| 午夜激情久久久久久久| 色哟哟·www| 欧美+日韩+精品| 午夜福利视频精品| 欧美日韩综合久久久久久| 五月天丁香电影| 一区二区三区精品91| 晚上一个人看的免费电影| 国产真实伦视频高清在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 制服丝袜香蕉在线| 丰满少妇做爰视频| 国产精品一区二区在线观看99| av卡一久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 嫩草影院入口| 国产在线免费精品| 嫩草影院入口| 老司机影院毛片| 亚洲高清免费不卡视频| 少妇高潮的动态图| 久久 成人 亚洲| 国产欧美亚洲国产| 国产黄片视频在线免费观看| 国产乱来视频区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品久久国产蜜桃| 国产在线男女| 男女国产视频网站| av线在线观看网站| 美女国产视频在线观看| 一本一本综合久久| 中文天堂在线官网| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲av国产av综合av卡|