血小板生成素模擬肽二聯(lián)體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法

專利名稱：血小板生成素模擬肽二聯(lián)體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與基因工程制藥領(lǐng)域，具體涉及血小板生成素模擬肽二聯(lián)體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在臨床上常會遇到由各種原因引起的原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥，如原發(fā)性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血以及腫瘤化/放療造成的血小板減少等。對于這類疾病， 比較適合應(yīng)用長效升血小板藥物進(jìn)行救治，一方面，可以減少用藥次數(shù)，使病人的針痛之苦減少；另一方面，可以減少藥物用量，降低治療費(fèi)用。血小板由巨核細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)巨核細(xì)胞的增殖、分化是提高血小板水平的主要手段。血小板生成素(Thrombopoietin，ΤΡ0)，又稱巨核細(xì)胞生長發(fā)育因子(MGDF)，是骨髓巨核細(xì)胞增殖、分化和血小板生成的最重要調(diào)控因子。1994年TPO基因被首次成功克隆后不久，人們即研制出一種聚乙二醇化的重組功能型TPO基因工程產(chǎn)品-PEG-rHuMGDF。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG-rHuMGDF不僅具有突出的促血小板生成活性，而且在體內(nèi)具有較長的半衰期，單次應(yīng)用即可達(dá)到顯著升高血小板的效果。然而，在臨床試驗(yàn)過程中人們發(fā)現(xiàn)，一些健康受試者在接受該藥物治療后所產(chǎn)生的抗體與內(nèi)源性TPO存在交差中和反應(yīng)，導(dǎo)致受試者出現(xiàn)血小板減少，從而使得PEG-rHuMGDF乃至重組人TPO的研制在1998年時(shí)即被美國FDA 叫停。受其影響，在美、歐、日本等國家至今重組人TPO都未被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床。鑒于此，人們轉(zhuǎn)而尋找和開發(fā)TPO的模擬物或類似物，以期研制出新一代的升血小板藥物。所謂TPO的模擬物或類似物是指與TPO —樣具有結(jié)合并激活TPO受體、促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖、分化和血小板生成的功能，但又與TPO完全不同源的多肽或化合物。1997 年 Cwirla 等(Cwirla SE et al.，Science，1997，276 :1696-1699)通過噬菌體展示技術(shù)篩選到一種可特異性結(jié)合并激活TPO受體的短肽，該短肽由14個(gè)氨基酸殘基組成，其化學(xué)合成的二聯(lián)體多肽與TPO受體的親和力以及促巨核細(xì)胞增殖活性都與重組人TPO相當(dāng)，但其氨基酸序列又與天然TPO完全不同源，所以不會誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生TPO中和性抗體，因此稱之為 TPO 模擬肽(Thrombopoietin mimetic peptide, TMP)。然而，由于 TMP 二聯(lián)體多肽分子量小，在體內(nèi)的生物半衰期非常短，因此體內(nèi)應(yīng)用效果并不理想。為了增大分子量以促進(jìn)體內(nèi)應(yīng)用效果，有研究者嘗試將TMP 二聯(lián)體的氨基末端共價(jià)結(jié)合聚乙二醇 (Serres M et al. ,Stem Cells, 1999,17 :203-209)，也有研究者將TMP與免疫球蛋白(IgG) 的Fc段進(jìn)行了融合(EP1144454B1)。人血清白蛋白(HSA)是血漿中的主要蛋白成分，約占血漿總蛋白的50-60%。HSA 是一種非糖基化單鏈蛋白，共由585個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量為66. 5kDa(A. Dugaiczyk et al.，PNAS，1982，79 :71-75)，血漿半衰期長達(dá)兩周以上。HSA在宿主細(xì)胞中是以一種原肽形式合成的，其中含M個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽和前肽，在轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過程中信號肽和前肽被切除。HSA是一個(gè)穩(wěn)定的惰性蛋白，并能作為藥物載體。HSA已成功地在多種宿主中表達(dá)(EP330451和EP361991)，尤其在酵母細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)HSA較高水平的穩(wěn)定表達(dá)。當(dāng)目的多肽與HSA融合表達(dá)時(shí)不僅可以提高多肽藥物的穩(wěn)定性，還可以增加多肽藥物在體內(nèi)的半衰期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種血小板生成素模擬肽二聯(lián)體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體與人血清白蛋白HSA的融合蛋白， 包含1個(gè)人血清白蛋白HSA和2個(gè)血小板生成素模擬肽TMP。人血清白蛋白HSA存在天然多態(tài)性，本發(fā)明融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括這些多態(tài)型。優(yōu)選地，所述血小板生成素模擬肽TMP具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列， 或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述血小板生成素模擬肽 TMP的活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列。 優(yōu)選地，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，2個(gè)所述血小板生成素模擬肽TMP串聯(lián)成二聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)血小板生成素模擬肽TMP之間均設(shè)有連接肽L，所述融合蛋白用結(jié)構(gòu)式表示為HSA-L-(TMP)2，具體地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 5所示。優(yōu)選地，所述2個(gè)血小板生成素模擬肽TMP串聯(lián)成二聯(lián)體位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)血小板生成素模擬肽TMP之間均設(shè)有連接肽L，所述融合蛋白用結(jié)構(gòu)式表示為(TMP)2-L-HSA,具體地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 6所示。優(yōu)選地，所述人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)血小板生成素模擬肽TMP之間的連接肽L均由1-50個(gè)氨基酸殘基組成。更優(yōu)選地，所述人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體之間的連接肽L由1-30個(gè)氨基酸殘基組成，兩個(gè)血小板生成素模擬肽TMP之間的連接肽L由1-15個(gè)氨基酸殘基組成。優(yōu)選地，組成所述連接肽L的氨基酸主要是Gly、Ser, Pro, Tyr或Ala。本發(fā)明還提供上述融合蛋白的制備方法，主要包含步驟1)獲取人血清白蛋白HSA的基因，并將該基因克隆至載體質(zhì)粒1中，獲得含HSA基因的質(zhì)粒2 ；2)以步驟1)獲得的質(zhì)粒2為模板，通過PCR擴(kuò)增得到加載了編碼TMP 二聯(lián)體序列的PCR產(chǎn)物，將所述PCR產(chǎn)物克隆至載體質(zhì)粒3然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得含編碼HSA與TMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因的質(zhì)粒4 ；
3)通過限制性內(nèi)切酶酶切、連接、轉(zhuǎn)化，將編碼HSA與TMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因從質(zhì)粒4亞克隆至表達(dá)載體質(zhì)粒5中，獲得含編碼HSA與TMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒6 ；4)將步驟幻所述的重組表達(dá)質(zhì)粒6轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，再轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，即得所述融合蛋白。其中步驟1)的質(zhì)粒1和步驟2)的質(zhì)粒3均為可用于基因克隆的常見質(zhì)粒載體， 優(yōu)選的是PUC57質(zhì)粒。其中步驟幻的質(zhì)粒5為可用于重組基因表達(dá)的常見質(zhì)粒載體，優(yōu)選酵母表達(dá)質(zhì)粒載體，更優(yōu)選的是pPICZa質(zhì)粒。其中步驟4)所述宿主是酵母。本發(fā)明還涉及含有上述融合蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體?？捎糜跀y帶編碼本發(fā)明融合蛋白的基因的表達(dá)載體包括但不局限于原核、真核表達(dá)系統(tǒng)常用的質(zhì)粒。本發(fā)明還涉及含有上述重組表達(dá)載體的宿主表達(dá)系統(tǒng)。宿主可以是細(xì)菌、酵母及哺乳動物細(xì)胞等，其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的是畢赤酵母；對于重組表達(dá)的本發(fā)明融合蛋白可以通過多種方法從相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行提取、純化，這些方法包括離心、超濾及液相層析等技術(shù)，其中液相層析又包括了離子交換、疏水和分子篩等層析技術(shù)。本發(fā)明所述的融合蛋白可用于制備治療原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥的藥物。本發(fā)明所述融合蛋白可以與藥物載體一起組成藥物制劑使用，這些藥物載體包括水、鹽水、糖類、醇類及氨基酸等。由本發(fā)明融合蛋白制成的藥物制劑優(yōu)選的是含水量低于3%或不含水的凍干制劑。這些藥物制劑可以用于多種原發(fā)性和繼發(fā)性血小板減少癥的治療，給藥方式包括靜脈輸注、注射(包括皮下和肌肉注射)、鼻內(nèi)、呼吸道等，其中優(yōu)選的是皮下或肌肉注射。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)，將兩個(gè)血小板生成素模擬肽TMP序列的二聯(lián)體和人血清白蛋白HSA融合，HSA和TMP 二聯(lián)體之間及兩個(gè)TMP之間設(shè)置有合適長度的連接肽，所產(chǎn)生的融合蛋白在保持TMP 二聯(lián)體具有突出促巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成特性的基礎(chǔ)上顯著延長其在體內(nèi)的半衰期，可用于制備治療原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥的藥物。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1為pPICZ α /HSA-L- (TMP) 2重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程；圖2Α-2Β為HSA-L-(TMP)2編碼序列的5’末端和3’末端測序結(jié)果，其中圖2Α為 5’末端的測定序列(包含了部分載體序列，以及編碼HSA信號肽、前肽和N端成熟肽的序列)，圖2Β為3’末端的測定序列(包含HSA的C末端氨基酸的編碼序列，以及編碼連接肽和TMP 二聯(lián)體的序列)；圖3為純化所得HSA-L-(TMP)2融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果，其中M為蛋白 Marker, 1為純化后的HSA-L-(TMP)2融合蛋白；圖4為HSA-L-(TMP)2融合蛋白的體外促巨核細(xì)胞增殖分化活性分析，其中1為空白對照組，2為TMP 二聯(lián)多肽處理組，3為HSA處理組，4為HSA-L-(TMP)2融合蛋白處理組；
圖5為HSA-L-(TMP)2融合蛋白的體內(nèi)藥代動力學(xué)分析。
具體實(shí)施例方式主要實(shí)驗(yàn)材料1. Pyrobest DNA Polymerase 試劑盒(TaKara 公司產(chǎn)品，中國大連)2.限制性核酸內(nèi)切酶Asu II、Not I.Sac I (TaKara公司產(chǎn)品，中國大連)3. QIAprep Spin質(zhì)粒提取試劑盒OiIAGEN公司，美國)4. DNA膠回收試劑盒(Omega公司，美國)5. T4 DNA連接酶試劑盒(Takara公司產(chǎn)品，中國大連)6.質(zhì)粒載體pPICZa、畢赤酵母菌株X-33(InVitrogen公司產(chǎn)品，美國)
7.大腸桿菌DH5 a (本室保存)8. M07e細(xì)胞(本室保存)9. Zeocin(Invitrogen 公司產(chǎn)品，美國)10. SP陽離子層介質(zhì)、Q陰離子層析介質(zhì)、疏水和分子篩等層析介質(zhì)及層析柱(GE 公司產(chǎn)品，美國)11.酵母提取物、胰蛋白胨(Oxford公司產(chǎn)品，美國)12.磷酸鹽緩沖液
NaClSgKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g溶于1000ml去離子水中，并用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至7. 4，高壓蒸氣滅菌。13. LB 培養(yǎng)基酵母提取物 5g胰蛋白胨 IOgNaClIOg溶于1000ml去離子水中，并用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 0，高壓蒸氣滅菌。14. YPD 培養(yǎng)基酵母提取物 IOg胰蛋白胨20gAgar20g溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻后加入100ml經(jīng)濾器除菌后的20%的右旋糖和適當(dāng)濃度的kocin。15. YPDS 培養(yǎng)基酵母提取物 IOg胰蛋白胨 20g
山梨糖醇 182. 2g溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻后加入IOOml經(jīng)濾器除菌后的20 %的右旋糖和適當(dāng)濃度的kocin。16. BMGY液體培養(yǎng)基
酵母提取物IOg
胰蛋白胨20g
無氨基酸酵母氮源134g 甘油IOg
磷酸鉀26.631g溶于IOOOml雙蒸水中高壓滅菌，冷至室溫，調(diào)節(jié)pH至6. 0，4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例1 人血清白蛋白HSA的全基因合成1、首先根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子對編碼HSA (包括M個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽和前肽)的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的HSA的全長基因序列如SEQ ID NO 10所示，其中 5’端1-72個(gè)bp為編碼HSA信號肽和前肽的堿基序列。信號肽和前肽在酵母細(xì)胞中表達(dá)分泌過程中會自動切除。2、委托上海生工生物工程公司合成優(yōu)化后的HSA的全長基因并將其裝載到PUC57 質(zhì)粒中(pUC57質(zhì)粒載體由上海生工生物公司提供)，獲得PUC57-HSA。實(shí)施例2 :pPICZ α /HSA-L- (TMP) 2重組表達(dá)載體的構(gòu)建
1、編碼HSA-L- (TMP) 2的cDNA片段的獲得(1)設(shè)計(jì)合成PCR引物Pl (SEQ ID NO 7) -age ttc gaa acg—atg aag tgg gta acc ttt att tcc ctt c 3'P2 (SEQ ID NO :8) :5' -ggc tct age age caa cca ttg tct caa agt tgg acc ctc aat acc aga tcc acc gcc tcc aga tcc acc tcc gcc gga tcc taa gcc taa ggc age ttg ac~3'P3 (SEQ ID NO :9) :5' -at cgc ggc cgc tta tgc tct age tgc aag cca ctg tct cag ggt agg tcc ctc gat tgg acc aga tgg ggc tct age age caa cca ttg-3'其中Pl中下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶Asu II識別位點(diǎn)序列；P2中5'端為編碼TMP的序列，中間斜體部分為HSA與TMP之間的Linker序列，3'端為HSA基因C-末端的特異性識別序列；P3中下劃線部分堿基為限制性內(nèi)切酶Not I識別位點(diǎn)序列，斜體部分為兩個(gè)TMP之間的Linker序列。(2)PCR擴(kuò)增以實(shí)施例1所得的pUC57-HSA質(zhì)粒DNA為模版，以Pl和P2分別作為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下①變性94°C，5min ；②變性94°C，lmin ；③ 復(fù)性:55°C,lmin ；④延伸72°C，2min ；⑤返回步驟“②”，35循環(huán)；⑥延伸:72°C，lOmin，總循環(huán)次數(shù)為35次。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出約1. 9kb大小的 DNA條帶。然后，以所得PCR產(chǎn)物為模版，再以Pl和P3分別作為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同前，擴(kuò)增獲得約2. Okb大小的DNA片段。(3) HSA-L-(TMP) 2的cDNA片段克隆與測序?qū)⒉襟E(2)所得PCR產(chǎn)物與載體pUC57 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂于氨芐抗性LB板37°C培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照T載體克隆試劑盒操作說明(TaKara公司產(chǎn)品)。所得克隆送上海生工生物工程公司測序，序列正確的克隆命名為pUC57/HSA-L- (TMP) 2。2、酵母表達(dá)載體pPICZ α /HSA-L-(TMP)2的構(gòu)建提取測序正確pUC57/HSA-L-(TMP)2的質(zhì)粒DNA，Asu II和Not I雙酶切質(zhì)粒DNA， 膠回收HSA-L- (TMP) 2對應(yīng)的DNA片段。同時(shí)，Asu II 和 Not I 雙酶切pPICZ α-A (Invitrogen 公司產(chǎn)品)質(zhì)粒DNA，膠回收pPICZ α -A載體片段。T4DNA酶連接兩個(gè)膠回收的DNA片段， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂于kocin抗性LB板37°C培養(yǎng)過夜，次日挑取細(xì)菌克隆，LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，再用Asu II和Not I雙酶切鑒定，將能夠切下約2. 01Λ 大小DNA片段的質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測序，測序正確的克隆即命名為pPICZ α / HSA-L-(TMP) 2。pPICZ α /HSA-L-(TMP)2 的構(gòu)建流程如圖 1 所示，HSA-L-(TMP)2 編碼序列的測序結(jié)果如圖2Α-2Β所示，由于編碼HSA-L-(TMP)2的序列較長，為了清楚顯示測定序列的正確性，特別選擇了關(guān)鍵部位的測序結(jié)果在圖2中進(jìn)行展示，其中圖2Α為5’末端的部分測定序列(包含了部分載體序列，以及編碼HSA信號肽、前肽和成熟肽N端數(shù)個(gè)氨基酸的序列)，圖2Β為3’末端的部分測定序列(包含HSA的C末端數(shù)個(gè)氨基酸的編碼序列，以及編碼連接肽和TMP 二聯(lián)體的序列)。將測序正確的pPICZ α /HSA-L-(TMP) 2質(zhì)粒DNA用&ic I酶切回收后，轉(zhuǎn)化X-33 感受態(tài)細(xì)胞。電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)為1500V，200 Ω，25 μ F。然后將轉(zhuǎn)化菌液接種于kocin抗性 YPDS平板，30°C培養(yǎng)3-4天，挑取克隆，采用Pl和P3作為引物對所挑取克隆的基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，對能夠擴(kuò)增出約2. 01Λ大小DNA片段的克隆進(jìn)行編號登記。將得到陽性克隆分別接種BMGY液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)M小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)， 7500rpm低溫離心15分鐘，取上清，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況，并用TMP 二聯(lián)多肽的抗體(第三軍醫(yī)大學(xué)全軍復(fù)合傷研究所研制)進(jìn)行Western blot分析，顯色陽性且分子量約70kD蛋白條帶即為HSA-L-(TMP)2融合蛋白，選擇表達(dá)水平最高的菌株作為工程菌，凍存于-70°C保種。實(shí)施例3 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的表達(dá)與純化取-70°C凍存的整合有pPICZ α /HSA-L-(TMP)2的酵母工程菌種接種于YPDS平板 30°C過夜培養(yǎng)活化，挑選外觀優(yōu)良的單個(gè)菌落接種于BMGY培養(yǎng)基，30°C恒溫?fù)u床220rpm振蕩培養(yǎng)16 18h至OD6tltl ^ 3 5，然后按1 10轉(zhuǎn)種1次培養(yǎng)至OD6tltl約為4，以此菌液為種子液。然后將種子液移種于裝有7L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐(比歐公司，瑞士)進(jìn)行高密度培養(yǎng)發(fā)酵。每1升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有甘油50g、濃磷酸laiil，KOH 2. 6g，CaSO4 · 2H20 0. 6g, K2SO4 9. 5g，MgSO4 ·7Η20 7. 8g，生物素 0. 3ang，YTB 溶液(內(nèi)含有 65g/L 的!^eSO4 ·7Η20， 6g/L 的 CuSO4 · 5H20, 20g/L 的 ZnSO4 · 7H20,6g/L 的 MnSO4 · 5H20 和 0. 5 % 的濃硫酸)2ml。發(fā)酵溫度控制在30°C (開始甲醇誘導(dǎo)后控制為)，溶解氧控制在30% 40%之間，pH值控制在6.0以下，培養(yǎng)至甘油耗盡后開始流加甘油，繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl 150時(shí)開始流加甲醇誘導(dǎo)，甲醇流加速率控制在1 %左右。誘導(dǎo)表達(dá)60h后停止發(fā)酵，低溫離心取上清，隨后進(jìn)行純化。
首先將上清進(jìn)行超濾層析，以去除部分色素和降低高強(qiáng)度的鹽離子濃度，并將目的多肽濃縮，同時(shí)用20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7. 0)更換緩沖體系。接著過SP Sepharose Fast Flow柱進(jìn)行陽離子交換層析，去除絕大部分殘留色素和雜蛋白，收集含有目的多肽的組分，再上Phenyl Sepharose Fast Flow柱進(jìn)行疏水層析，最后再過Supdex 200層析柱，將收集分離組分即為純化的融合蛋白，分子量約為70KD (如圖3所示)，HPLC測定其純度大于98%。實(shí)施例4 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的體外生物活性測性采用CCK-8法(改良MTT法)檢測HSA_L_ (TMP) 2融合蛋白對人巨核細(xì)胞株M07e 細(xì)胞的促增殖活性，具體操作如下取對數(shù)生長期的M07e細(xì)胞，離心洗滌，再用僅含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)18-24h后收集進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并按5 X 105/ml轉(zhuǎn)接至96孔U型板中，每孔lOOul。分別設(shè)立空白對照組(培養(yǎng)液中不含任何細(xì)胞因子)、 HSA對照組(IOnM)、TMP 二聯(lián)肽處理組(IOnM)及等摩爾濃度的HSA-L-(TMP)2融合蛋白處理組(IOnM)，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37°C、5% CO2孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)7 后每孔加入CCK-8試劑 10ul,37°C,5% CO2孵箱培養(yǎng)Mi后于酶標(biāo)儀490nm波長檢測細(xì)胞光密度值并分析細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，把44-01^)2可以顯著促進(jìn)巨核細(xì)胞的增殖(如圖4所示)，說明本發(fā)明融合蛋白保留了 TMP 二聯(lián)肽的促巨核細(xì)胞增殖活性。實(shí)施例5 =HSA-L- (TMP) 2融合蛋白的體內(nèi)半衰期測定給小鼠體內(nèi)皮下注射HSA-L-(TMP)2融合蛋白O00ug/kg)，于給藥后1、4、對、48、 96、144、192h時(shí)間點(diǎn)取樣采血，采用自行制備的TMP 二聯(lián)肽抗體，通過酶連免疫吸附方法 (ELISA)檢測小鼠血清中的HSA-L- (TMP) 2融合蛋白濃度，并計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)，求出融合蛋白在血液中的半衰期。結(jié)果顯示HSA-L-(TMP)2融合蛋白的半衰期約為120h(如圖5所示)，而文獻(xiàn)報(bào)道皮下注射TMP 二聯(lián)肽在小鼠體內(nèi)的半衰期約為lh，說明通過于HSA融合顯著延長了 TMP 二聯(lián)肽在體內(nèi)的半衰期。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的更動與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種血小板生成素模擬肽TMP的二聯(lián)體與人血清白蛋白HSA的融合蛋白，其特征在于，包含1個(gè)人血清白蛋白HSA和2個(gè)血小板生成素模擬肽TMP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述血小板生成素模擬肽TMP具有 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述血小板生成素模擬肽TMP的活性的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列，或在該氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸殘基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA的活性的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端，所述2個(gè)血小板生成素模擬肽TMP串聯(lián)成二聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)血小板生成素模擬肽TMP 之間均設(shè)有連接肽L，所述融合蛋白用結(jié)構(gòu)式表示為HSA-L-(TMP)2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO :5所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述2個(gè)血小板生成素模擬肽TMP串聯(lián)成二聯(lián)體位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)血小板生成素模擬肽TMP 之間均設(shè)有連接肽L，所述融合蛋白用結(jié)構(gòu)式表示為(TMP)2-L-HSA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示，編碼所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO 6所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA 與血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體之間以及兩個(gè)血小板生成素模擬肽TMP之間的連接肽L 均由1-50個(gè)氨基酸殘基組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白HSA與血小板生成素模擬肽TMP 二聯(lián)體之間的連接肽L由1-30個(gè)氨基酸殘基組成，兩個(gè)血小板生成素模擬肽 TMP之間的連接肽L由1-15個(gè)氨基酸殘基組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，組成所述連接肽L的氨基酸主要是 Gly、Ser> Pro、Tyr 或 Ala。
11.一種權(quán)利要求1所述的融合蛋白的制備方法，其特征在于，包含步驟1)獲取人血清白蛋白HSA的基因，并將該基因克隆至載體質(zhì)粒1中，獲得含HSA基因的質(zhì)粒2 ；2)以步驟1)獲得的質(zhì)粒2為模板，通過PCR擴(kuò)增得到加載了編碼TMP二聯(lián)體序列的 PCR產(chǎn)物，將所述PCR產(chǎn)物克隆至載體質(zhì)粒3并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得含編碼HSA與TMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因的質(zhì)粒4;3)通過限制性內(nèi)切酶酶切、連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將編碼HSA與TMP二聯(lián)體的融合蛋白的基因從質(zhì)粒4亞克隆至表達(dá)載體質(zhì)粒5中，獲得含編碼HSA與TMP 二聯(lián)體的融合蛋白的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒6;4)將步驟幻所述的重組表達(dá)質(zhì)粒6轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，再轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，即得所述融合蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，步驟1)的質(zhì)粒1和步驟幻的質(zhì)粒 3均為pUC57質(zhì)粒；步驟3中的質(zhì)粒5為pPICZ α質(zhì)粒。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，步驟4)所述宿主是酵母。
14.一種含有權(quán)利要求1所述的融合蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體。
15.一種含有權(quán)利要求14所述的重組表達(dá)載體的宿主表達(dá)系統(tǒng)。
16.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備治療原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血小板生成素模擬肽TMP的二聯(lián)體與人血清白蛋白HSA的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。所述融合蛋包含1個(gè)HSA和2個(gè)TMP，其中HSA位于融合蛋白的N-末端，2個(gè)TMP序列串聯(lián)成二聯(lián)體位于融合蛋白的C-末端，或HSA位于融合蛋白的C-末端，2個(gè)TMP序列串聯(lián)成二聯(lián)體位于融合蛋白的N-末端；在HSA與TMP二聯(lián)體之間以及兩個(gè)TMP之間均設(shè)有連接肽。所述融合蛋白具有顯著促進(jìn)血小板生成的特性，且在體內(nèi)具有較長的半衰期，可用于制備治療多種原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥等疾病的藥物。
文檔編號C12N1/21GK102408485SQ201110420870
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者王軍平, 王崧, 王艾平, 申明強(qiáng), 粟永萍, 許楊, 陳芳, 陳默 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)