一種磷脂酶d及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種磷脂酶D及其應(yīng)用，本發(fā)明的磷脂酶D，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。該磷脂酶D能夠催化卵磷脂和帶有羥基的化合物發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，生產(chǎn)稀有磷脂，包括磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等。本發(fā)明的磷脂酶D能夠催化磷脂酰膽堿(PC)和絲氨酸反應(yīng)高效合成磷脂酰絲氨酸，所有的底物PC被利用，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％；產(chǎn)物中磷脂酰絲氨酸(PS)的選擇性高達(dá)97.6％，只有2.4％的底物PC轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物磷脂酸(PA)。
【專利說(shuō)明】
一種磷脂酶D及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于功能酶篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷脂酶D及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷脂酶D(PLD;EC3.1.4.4)可催化磷脂水解為磷脂酸，同時(shí)還可催化自然界中含量 豐富的磷脂酸膽堿轉(zhuǎn)化為自然界中含量稀少甚至不存在的磷脂或磷脂衍生物。該轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 對(duì)于合成稀有天然磷脂組分及人工合成磷脂具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。到目前為止，不少生產(chǎn) PLD的菌株已經(jīng)被成功分離出來(lái)，大約有500種PLD能夠在NCBI GenBank中發(fā)現(xiàn)。已報(bào)導(dǎo)的產(chǎn) 磷脂酶D的微生物主要有鏈霉菌（Streptomyces)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、沙門(mén)氏桿 菌(Salmonella)、假單胞菌(Pseudomonad)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、錯(cuò)狀芽抱桿菌 (Bacillus cereus)、無(wú)色桿菌(Achromobacter)、米曲霉(Aspergillus oryzae)。但對(duì)于工 業(yè)化生產(chǎn)來(lái)講，獲取更多性能穩(wěn)定的酶源是必要的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種磷脂酶D及其應(yīng)用，即一種具有高轉(zhuǎn)酯活力的磷脂酶D， 從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004] 本發(fā)明的磷脂酶D，包含有：
[0005] 1)氨基酸序列為SEQ ID N0:1的酶；
[0006] 2)在1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有1)中 酶活性的，由1)所衍生的酶。
[0007] 編碼上述磷脂酶D的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:2;
[0008] 上述的磷脂酶D能夠催化卵磷脂和帶有羥基的化合物發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，生產(chǎn)稀有磷 月旨，包括磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等。
[0009] 上述磷脂酶D能夠催化磷脂酰膽堿(PC)和絲氨酸反應(yīng)高效合成磷脂酰絲氨酸，所 有的底物PC被利用，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100 % ;產(chǎn)物中磷脂酰絲氨酸(PS)的選擇性高達(dá)97.6 %，只 有2.4%的底物PC轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物磷脂酸(PA)。
[0010] 上述磷脂酶D能夠催化蝦油中的DHA-磷脂酰膽堿(DHA-PC)和絲氨酸反應(yīng)高效合成 DHA-磷脂酰絲氨酸（DHA-PS)，底物蝦油中的DHA-PC部分被利用，轉(zhuǎn)化為DHA-PS，轉(zhuǎn)化率 52.6 %，除此之外，DHA-PS的選擇性為100 %，沒(méi)有DHA-PC轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物DHA-磷脂酸(DHA-PA)〇
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1:本發(fā)明的磷脂酶D表達(dá)SDS-PAGE電泳圖。第一個(gè)泳道是marker，第二個(gè)泳道 是表達(dá)產(chǎn)物，第三個(gè)泳道是未表達(dá)產(chǎn)物(對(duì)照）；
[0012] 圖2:本發(fā)明的磷脂酶D最適pH及pH穩(wěn)定性示意圖；
[0013] 圖3:本發(fā)明的磷脂酶D最適溫度及溫度穩(wěn)定性示意圖；
[0014] 圖4:本發(fā)明的磷脂酶D合成磷脂酰絲氨酸核磁示意圖。
[0015] 圖5:本發(fā)明的磷脂酶D合成DHA-PS液相示意圖。 圖6:本發(fā)明的磷脂酶D在反應(yīng)12h之后，生成了新的化合物磷脂酰葡萄糖的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY(Ausubel，2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn) 提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明所記載 的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，而不限于本發(fā)明具體 實(shí)施例的限定。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述
[0017] 實(shí)施例1:產(chǎn)磷脂酶D微生物Acinetobacter radioresistens a2序列分析
[0018] 本發(fā)明的酶是對(duì)抗輻射不動(dòng)桿菌的基因序列分析獲得的，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。該磷脂酶D基因與NCBI中參考序列相比較具 有明顯的序列上的差異，表明本發(fā)明的磷脂酶D(PLD517)是一種新酶。
[0019] 實(shí)施例2:本專利磷脂酶D克隆表達(dá)
[0020] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因信息設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)蛋白基因的全序列引物，上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAATTAGATAATCATCTGAAAGG-3 ,，Tl5i^l^：5,-CCGCTCGAGTTACATCATCCATTCAATAGGCA-S'JCR 如下：98°C 變性 30s，55°C 退火 10s，72°C 延伸 60s，循環(huán)35次，之后4°C保存。BamHI和EcoRI雙酶切的目的基因與同樣雙酶切的pET28a并且 按照1:5的摩爾比進(jìn)行連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，其條件是16°C連接12h。使用熱激的方法轉(zhuǎn)化，重 組質(zhì)粒導(dǎo)入到BL21來(lái)表達(dá)。表達(dá)是在ZYP-5052培養(yǎng)基中進(jìn)行，溫度是20°C，時(shí)間是48h。
[0021] 上述的磷脂酶D凝膠電泳如圖1所示，其分子量大小為60Kda。
[0022] 實(shí)施例3:本發(fā)明磷脂酶D的酶學(xué)性質(zhì)
[0023] (1)磷脂酶D的最適pH及pH穩(wěn)定性
[0024]磷脂酶D在不同的pH下進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。磷脂酶D的pH適用范圍為4_ 9，pH6.2為其最適反應(yīng)plpH穩(wěn)定性是將酶液在不同的pH緩沖液中進(jìn)行10倍稀釋，4°C放置 24h，然后再標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定殘余酶活。結(jié)果顯示在pH 4-9的范圍內(nèi)其能夠保持60%以上的 活力。具有較好的pH穩(wěn)定性。
[0025]上述的磷脂酶D，其最適的pH為6.2;在pH 4~9的范圍內(nèi)4°C放置24h能夠保持60% 以上的活力。
[0026] (2)磷脂酶D最適溫度及溫度穩(wěn)定性
[0027] 磷脂酶D在不同的溫度(20、30、40、50、60 °C)下測(cè)定酶活，結(jié)果如圖3所示。磷脂酶D 最適反應(yīng)溫度為40°C，在50°C時(shí)能夠保持80%的最大活力，但是當(dāng)溫度達(dá)到60°C時(shí)，只保持 20 %的活力。酶的溫度穩(wěn)定性是將酶在不同的溫度(20、30、40、50、60 °C)中保溫lh。磷脂酶D 在20-60°C時(shí)具有很好的溫度性，保溫lh能夠維持80%以上的活力。
[0028]上述的磷脂酶D，其最適的反應(yīng)溫度為40°C;在20~60°C范圍內(nèi)放置1小時(shí)能夠維 持80%以上的活力。
[0029] (3)金屬離子及有機(jī)試劑對(duì)磷脂酶D的影響
[0030] 將合成反應(yīng)中添加有機(jī)試劑和金屬離子，然后計(jì)算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果詳見(jiàn)表UCa2+、Ni +、Na+和K+對(duì)酶活有促進(jìn)作用，1%2+及2^+、2112+能夠部分抑制酶活。1^切1^-100對(duì)轉(zhuǎn)酯 活力具有完全的抑制作用。
[0031] 上述的磷脂酶0,0&2+、附+、似+和1( +對(duì)酶活有促進(jìn)作用^2+、？62+、？63+、211 2+能夠部 分抑制酶活。
[0032]
[0033] 實(shí)施例3:本專利磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸(PS)
[0034]催化反應(yīng)發(fā)生在兩相體系，其中，pH 6 0.2M醋酸緩沖液溶解1M絲氨酸和0.05M CaCl2,95%的大豆卵磷脂溶解在20mg/ml乙醚中，反應(yīng)體積比1:1。準(zhǔn)確稱取50mg本專利磷 脂酶D干粉，40°C水浴振蕩反應(yīng)12h。
[0035] 液相檢測(cè)方法:HPLC-ELSD定量檢測(cè)分析磷脂組成（diol-120-np)。流動(dòng)相A:正己 烷:異丙醇:醋酸:三乙胺= 81.42:17:1.5:0.08, v/v/v/v;流動(dòng)相B:異丙醇:水:醋酸:三乙 胺= 84.42:14:1 ?διΟ.Οβ,v/v/v/v- Ν?^?] 反應(yīng)結(jié)果如圖4所示。本專利的磷脂酶D在反應(yīng)12h之后，所有的底物PC被利用，均 被轉(zhuǎn)化成PS和PA，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，除此之外，PS的選擇性97.6%，只有2.4%的PC轉(zhuǎn)化為 副產(chǎn)物PA。
[0037] 實(shí)施例4:本專利磷脂酶D催化蝦油中DHA-PC合成DHA-PS
[0038] 具體實(shí)施方案如下:催化反應(yīng)發(fā)生在兩相體系，其中，pH 6 0.2M醋酸緩沖液溶解 1M絲氨酸和0.05M CaCl2,含有50%的DHA-PC蝦油lml，反應(yīng)體積比1:1。準(zhǔn)確稱取50mg本專 利磷脂酶D干粉，pH 6 0.2M醋酸緩沖液（含有1M絲氨酸和0.05M CaCl2)lml，含有50%的 DHA-PC蝦油lml，40 °C水浴振蕩反應(yīng)12h。
[0039] 反應(yīng)結(jié)果如圖5所示。本專利的磷脂酶D在反應(yīng)12h之后，底物蝦油中的DHA-PC部分 被利用，轉(zhuǎn)化為DHA-PS，轉(zhuǎn)化率52.6 %，除此之外，DHA-PS的選擇性為100 %，沒(méi)有DHA-PC轉(zhuǎn) 化為副產(chǎn)物DHA-PA。
[0040]實(shí)施例5:磷脂酶D催化合成磷脂酰葡萄糖
[00411催化反應(yīng)發(fā)生在兩相體系，其中，pH 5.6的20mmol/L醋酸緩沖液溶解1M葡萄糖和 0.05M CaCl2，95%的大豆卵磷脂溶解在20mg/ml乙醚中，反應(yīng)體積比1:1。準(zhǔn)確稱取10mg磷 脂酶D干粉，50°C水浴振蕩反應(yīng)12h。
[0042] TLC薄層層析法分析:利用磷脂各組分極性大小的不同，在硅膠板上展開(kāi)的時(shí)候迀 移速率不同，從而將各物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。使用的展開(kāi)劑為三氯甲烷：甲醇:水= 65:2 5:4(v/v/ v);染色方法為碘蒸氣染色。
[0043] 反應(yīng)結(jié)果如圖6所示，本專利的磷脂酶D在反應(yīng)12h之后，生成了新的化合物磷脂酰 葡萄糖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種磷脂酶D，其特征在于，所述的磷脂酶D包含有： 1) 氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的酶； 2) 在1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有1)中酶活 性的，由1)所衍生的酶。2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的磷脂酶D。3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。4. 一種轉(zhuǎn)酯的方法，其特征在于，所述的方法是用權(quán)利要求1所述的磷脂酶D催化卵磷 脂和帶有羥基的化合物發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。5. -種生產(chǎn)稀有磷脂的方法，其特征在于，所述的方法是用權(quán)利要求1所述的磷脂酶D 催化卵磷脂和帶有羥基的化合物發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的稀有磷脂為磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘 油，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰葡萄糖或磷脂酰肌醇。7. 權(quán)利要求1所述的磷脂酶D在生產(chǎn)DHA-磷脂酰絲氨酸中的應(yīng)用。8. -種生產(chǎn)DHA-磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于，所述的方法是用權(quán)利要求1所述的 磷脂酶D催化DHA-磷脂酰膽堿和絲氨酸反應(yīng)合成DHA-磷脂酰絲氨酸。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的DHA-磷脂酰膽堿來(lái)源于蝦油。
【文檔編號(hào)】C12N15/55GK105950584SQ201610563095
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月18日
【發(fā)明人】毛相朝, 劉倩倩, 邱永乾, 劉炎峻, 薛長(zhǎng)湖
【申請(qǐng)人】中國(guó)海洋大學(xué)