脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測定試劑盒及制作方法與流程

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)中熒光免疫層析技術(shù)領(lǐng)域，包括蛋白交聯(lián)技術(shù)、膜層析技術(shù)、標(biāo)記免疫分析技術(shù)等。具體地說是一種能夠快速準確的對血清、血漿和全血等樣品中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2進行定量分析的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測定試劑盒及制作方法。

背景技術(shù)：
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隨著對動脈粥樣硬化發(fā)病機制的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的演變過程中，始終都有各種炎癥細胞核大量炎癥介質(zhì)的參與，炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的核心因素。Lp-PLA2是近年來引起廣泛關(guān)注的一種與動脈粥樣硬化心、腦血管疾病密切相關(guān)的磷脂酶A2超家族，越來越多的研究表明Lp-PLA2與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)腦卒中事件的發(fā)生關(guān)系密切。Lp-PLA2是針對血管內(nèi)皮炎癥即AS嚴重程度的特異性炎癥標(biāo)記物，可以有效預(yù)警、評估心腦血管栓塞性疾病的發(fā)生風(fēng)險，降低心腦血管患者或高危人群突發(fā)心梗/腦梗等嚴重不良事件的發(fā)生率，為生命保駕護航。

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)是目前國際上公認的一種新的炎性反應(yīng)標(biāo)志物。血液中的Lp-PLA2主要由巨噬細胞產(chǎn)生，能水解低密度脂蛋白(LDL)中氧化的磷脂，其水解產(chǎn)物可促進動脈粥樣硬化過程，為反映血管炎癥的特異性標(biāo)志物。Lp-PLA2水平升高還與動脈粥樣硬化斑塊的破潰相關(guān)，因而可用于動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定性評價。Lp-PLA2水平升高是預(yù)測冠心病、心血管事件和卒中風(fēng)險的一種獨立危險因素和預(yù)測因子。

免疫分析技術(shù)是利用微量抗原與相應(yīng)的高特異性抗體之間的免疫反應(yīng)，來檢測如激素、藥物、蛋白質(zhì)、多肽、酶、腫瘤相關(guān)抗原、微生素、病毒、細菌及金屬元素等生物體內(nèi)活性物質(zhì)。免疫分析技術(shù)包括標(biāo)記免疫分析、非標(biāo)記免疫分析和儀器免疫分析。本試劑盒利用的含有稀土元素的羧基乳膠微球標(biāo)記免疫分析技術(shù)是屬于標(biāo)記免疫分析之一種。

熒光免疫分析(FIA)和放射免疫分析(RIA)自問世以來，經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展，但是人們越來越感覺到FIA因自然本地太高，干擾檢測結(jié)果；RIA采用同位素標(biāo)記，對人體有極大危害并給實驗帶來不便。酶免疫分析(EIA)也因酶本身不穩(wěn)定，受其他影響因素較大，推廣應(yīng)用受到限制。80年代初，人們開始研究用稀土元素代替熒光物質(zhì)和同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)或抗體，將時間分辨技術(shù)引入到生物檢測領(lǐng)域，建立了新型的超微量時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(Time resolved Fluoroimmunoassay，簡稱TrFIA)。該技術(shù)采用多學(xué)科先進技術(shù)，集結(jié)了其他免疫分析的特點，在免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細胞學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，取得長足的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

TrFIA利用了具有獨特?zé)晒馓匦缘?價稀土離子及螯合物為示蹤物代替熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細胞，待反應(yīng)體系(如抗原抗體反應(yīng)、核酸探針雜交、生物素親和素反應(yīng)以及靶細胞對效應(yīng)細胞的殺傷效應(yīng)等)發(fā)生后，用TrFIA檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強度。根據(jù)產(chǎn)物熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。在通常的熒光測定中，由于測試樣品中含有多種熒光成分，背景熒光(來自樣品中的膠體顆粒和溶劑分子引起的散射光以及血清中蛋白質(zhì)和其他化合物發(fā)出的非特異性熒光)強度大、干擾強，成為熒光分析法大范圍推廣的瓶頸。TrFIA之所以能夠成為繼EIA、RIA之后一種新的靈敏的檢測方法，主要取決于鑭系元素獨特的熒光特點、檢測中采用的波長分辨和時間延遲技術(shù)以及解離-增強技術(shù)。

鑭系元素(lanthanide,Ln)屬于稀土元素，共有17中，常用于TrFIA主要有銪(Eu)、釤(Sm)、鋱(Tb)、鏑(Dy)。鑭系元素具有獨特的熒光發(fā)光特點，與普通熒光相比，鑭系離子螯合物熒光衰變時間長，為傳統(tǒng)熒光的10³-10⁶倍。如鑭系離子螯合物的熒光衰變時間在60-900μs，常用的Eu³⁺熒光衰變時間為714μs，普通熒光免疫分析中熒光團的熒光衰變時間只有1-100μs，樣品中一些蛋白質(zhì)的熒光衰變時間僅為1-10μs，因此利用時間分辨技術(shù)，延遲一定時間后測量，便可獲得Eu³⁺特異性熒光信號。同時由于衰變時間長，Eu³⁺標(biāo)記物在測量時間里可以反復(fù)被激發(fā)，每次激發(fā)后由激發(fā)態(tài)很快躍遷到基態(tài)，就有熒光發(fā)出，然后又可被重新激發(fā)，如此每秒可有1000次激發(fā)，使得TrFIA熒光標(biāo)記物的相對比活性很高。鑭系元素?zé)晒夤庾V的最大特征是激發(fā)光與發(fā)射光之間的Stokes位移較大，Eu³⁺激發(fā)波長為337nm，發(fā)射波長為615nm，Stokes位移可達278nm；同時Eu³⁺被激發(fā)的熒光光帶極窄，熒光的發(fā)射峰非常尖銳，可使儀器調(diào)整在極窄的波長范圍內(nèi)測定，這樣就幾乎完全消除了背景熒光的干擾，繼而通過時間延遲和波長分辨，將強特異性熒光和背景熒光辨開(故稱為時間分辨)，使干擾達到幾乎為零。

鑒于以上標(biāo)記方法及檢測技術(shù)的應(yīng)用，本試劑盒具有良好的檢測特異性、較高的靈敏度、操作的簡便性以及穩(wěn)定的熒光標(biāo)記物保證了檢測的準確性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，提出了一種利用熒光免疫層析的靈敏性，結(jié)合熒光免疫層析分析儀實現(xiàn)的靈敏度高、快捷簡便，可以準確定量的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測定試劑盒及制作方法。

本發(fā)明可以通過以下措施達到：

一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測定試劑盒，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：PVC板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為100-250nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素中的一種或幾種，在基態(tài)下穩(wěn)定，在300-400nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長范圍為550-650nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原表位的單克隆抗體細胞株。

本發(fā)明所述結(jié)合墊的稀土熒光微球的直徑優(yōu)選是120-200nm；所述稀土熒光微球優(yōu)選含有一種或幾種稀土鑭系元素；結(jié)合墊上稀土熒光微球標(biāo)記的抗體優(yōu)選來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

本發(fā)明所述結(jié)合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于150mMTris-HCL處理液中(含1.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用，將玻璃纖維膜放在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體偶聯(lián)復(fù)合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時后制得。

本發(fā)明中結(jié)合墊上的所述稀土熒光微球標(biāo)記的抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體采用如下步驟制得：

步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：用脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2純品免疫小鼠，采用標(biāo)準的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，對所獲得的單抗細胞株進行配對篩選，根據(jù)配對結(jié)果和親和力數(shù)據(jù)優(yōu)選出用于試劑盒的單抗細胞株；

步驟2：單克隆抗體的制備：采用標(biāo)準的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟3：稀土熒光微球的醛基化：取5mg稀土熒光微球，用20mM，pH 9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟4：稀土熒光微球標(biāo)記的抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體的制備：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的單克隆抗體，按照質(zhì)量比1:1將2mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mM，4℃反應(yīng)4小時；再加入等體積的封閉液(50mM Tris-HCL，pH7.4，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mM Tris-HCL緩沖液中(含1.2％NaCL，0.5％BSA，0.1％Tween 20)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明所述包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜通過以下步驟制得：

步驟1：采用與結(jié)合墊上所用抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體細胞株不同的細胞株，采用標(biāo)準的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體，保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟2：分別用包被稀釋液將上述鼠源抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到1-3mg/ml，膜液量為1-3μl/cm，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質(zhì)控線間隔為3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

本發(fā)明所述樣品墊通過以下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％TritonX-100，2.5％BSA，0.15M Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

本發(fā)明還提供了一種如上所述試劑盒實現(xiàn)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2制作方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：將IC卡放置在干式熒光免疫分析儀標(biāo)注位置，讀取相關(guān)信息，所述熒光免疫層析分析儀是一種光學(xué)檢測系統(tǒng)，對脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的測定范圍為10.0-1000ng/mL；

步驟3：加樣：血清/血漿：取100μL血清/血漿樣本垂直滴加至測試卡加樣處，全血：取150μL全血樣本垂直滴加至測試卡加樣處，取樣時注意不要吸入氣泡；

步驟4：檢測，可采用自動測試或即時測試兩種模式進行檢測，自動測試：將測試卡插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，按測試鍵，儀器將自動對測試卡進行掃描分析檢測，即時測試：測試卡室溫放置15min后，插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，點擊即時測試。

本發(fā)明提供一種利用稀土羧基乳膠微球標(biāo)記的熒光免疫層析技術(shù)制備的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測定試劑盒，同時適合血清、血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測，相對于脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2定性膠體金試劑，能定量檢測樣本中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量，具有更明確的臨床指導(dǎo)意義，具有操作簡便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。

附圖說明：

附圖1是本發(fā)明中試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖2是本發(fā)明中實施例2的準確度分析結(jié)果示意圖。

附圖3是本發(fā)明中實施例2的準確度分析結(jié)果示意圖。

附圖4是本發(fā)明中實施例2的準確度分析結(jié)果示意圖。

附圖標(biāo)記：PVC板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5。

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明：

如附圖1所示，本發(fā)明首先提出了一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測定試劑盒，盒內(nèi)設(shè)有試紙卡，所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：PVC板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5，其中結(jié)合墊上吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素Eu³⁺，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原表位的單克隆抗體細胞株。

所述結(jié)合墊3的稀土熒光微球的直徑優(yōu)選是150nm；所述稀土熒光微球優(yōu)選含有稀土鑭系元素銪(Eu³⁺)；結(jié)合墊上稀土熒光微球標(biāo)記的抗體優(yōu)選來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

實施例1：

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2測定試劑盒中試紙卡的各組成部分可以通過以下措施制得：

1、樣品墊2的制備：

將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％Triton X-100，2.5％BSA，0.15M Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。2、吸附熒光微球標(biāo)記抗體的結(jié)合墊3的制備：

將玻璃纖維膜浸泡于150mM Tris-HCL處理液中(含1.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用，將玻璃纖維膜放在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土Eu³⁺熒光微球標(biāo)記的抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體偶聯(lián)復(fù)合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時后制得。

稀土熒光納米微球的醛基化：取5mg稀土熒光納米微球，用20mM，pH9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

稀土Eu³⁺熒光微球標(biāo)記的抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體的制備：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的單克隆抗體，按照質(zhì)量比1:1將2mg抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mM，4℃反應(yīng)4小時；再加入等體積的封閉液(50mM Tris-HCL，pH7.4，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mM Tris-HCL緩沖液中(含1.2％NaCL，0.5％BSA，0.1％Tween 20)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

3、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜4的制備：

采用與結(jié)合墊上所用抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體細胞株不同的細胞株，采用標(biāo)準的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體，保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

分別用包被稀釋液將上述鼠源抗脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到1mg/ml，膜液量為1μl/cm，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質(zhì)控線間隔為4mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

試紙卡的組裝：在PVC板1上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊2、吸附有稀土熒光標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊3、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜4和吸水墊5，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。

上述各步驟中選用的設(shè)備及原料優(yōu)選以下原料：

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2特異性配對抗體；脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2質(zhì)控品：英國朗道實驗診斷有限公司；稀土熒光微球：上海甄準生物科技有限公司；硝酸纖維素(NC)膜：Millipore公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma產(chǎn)品，其它常用試劑均為分析純試劑。

實施例2：準確度試驗

選用上述試紙卡以及熒光免疫層析分析儀(型號：NEO-007)，熒光免疫分析儀參數(shù)的設(shè)定：在熒光免疫分析儀上設(shè)定好試紙卡工藝參數(shù)后，取上述組裝好的試紙卡，分別用10、100、200、400、600、800、1000ng/mL的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2校準品，用試紙卡進行測定，得到各校準品的熒光強度值，將結(jié)果輸入到分析儀的參數(shù)中，完成分析儀的參數(shù)的設(shè)定。

主要檢測材料：臨床樣本由相關(guān)醫(yī)院獲得，共300份膠乳增強免疫比濁法定值樣本，其中血清樣本100份，血漿樣本100份，全血樣本100份，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量分布區(qū)間為10.0-1000ng/mL之間。

檢測時：先將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；然后讀卡：將IC卡放置在干式熒光免疫分析儀標(biāo)注位置，讀取相關(guān)信息，步驟3：加樣：血清/血漿：取100μL血清/血漿樣本垂直滴加至測試卡加樣處；全血：取150μL全血樣本垂直滴加至測試卡加樣處，取樣時注意不要吸入氣泡，檢測，可采用自動測試或即時測試兩種模式進行檢測；自動測試：將測試卡插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，按測試鍵，儀器將自動對測試卡進行掃描分析檢測，即時測試：測試卡室溫放置15min后，插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，點擊即時測試。試驗結(jié)果分析：

臨床樣本檢測試劑制備完成后，按檢測方法對所有臨床樣本進行檢測，并分析檢測結(jié)果。

試驗結(jié)果：

如附圖2所示，以實驗系統(tǒng)的檢測值為Y軸，以對照系統(tǒng)的測驗值為X軸，繪制散點圖，并進行相關(guān)性分析。臨床樣本檢測對200份臨床定值樣本檢測，樣本平均偏差值小于10％，最大偏差小于20％，R2>0.98，一致性系數(shù)>0.90。檢測結(jié)果表明制備的檢測試劑盒性能良好，適合用于臨床檢測，滿足不同客戶不同檢測場合的差異化需要。

本發(fā)明提供一種利用稀土熒光免疫層析技術(shù)制備的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2快速定量免疫層析檢測試劑盒，同時適合血清/血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測，相對于脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2定性膠體金試劑，能定量檢測樣本中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量，具有更明確的臨床指導(dǎo)意義，具有操作簡便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。