一種化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)DNA的方法與流程

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)dna的方法。
背景技術(shù)：
：魯米諾是常用的化學(xué)發(fā)光試劑，廣泛應(yīng)用于各種化學(xué)發(fā)光分析檢測(cè)中。然而，魯米諾化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生較高的背景信號(hào)，故其應(yīng)用受到一定的限制。近年來(lái)，功能化的膠體金受到了研究者的青睞，可以使用釕配合物、魯米諾及其衍生物還原氯金酸的方法合成膠體金(cuih,wangw,duancf,etal.synthesis,characterization,andelectrochemiluminescenceofluminol-reducedgoldnanoparticlesandtheirapplicationinahydrogenperoxidesensor[j].chemistry,2007,13(24):6975-6984；gaow,qiw,laij,etal.thioureadioxideasauniqueeco-friendlycoreactantforluminolchemiluminescenceinthesensitivedetectionofluminol,thioureadioxideandcobaltions[j].chemicalcommunications,2014,51(9):1620-1623.)，其中，采用魯米諾還原氯金酸得到的膠體金稱為lumaunps，在雙氧水存在時(shí)得到較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。由于雙氧水不穩(wěn)定而且可與很多金屬離子反應(yīng)，所以它的選擇性不好。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明利用lumaunps—羥胺-o-磺酸化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系實(shí)現(xiàn)了dna的測(cè)定，具有靈敏度高、方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在發(fā)明一種方法簡(jiǎn)單、靈敏度高的測(cè)定dna的方法。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)dna的方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)方案是：一種化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)dna的方法，其原理是以魯米諾還原氯金酸，得到魯米諾膠體金納米粒子lumaunps，以探針dna修飾lumaunps，得化學(xué)發(fā)光探針；然后以磁珠為載體固定發(fā)卡結(jié)構(gòu)的捕獲dna，在目標(biāo)物dna存在時(shí)，捕獲dna的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，并在化學(xué)發(fā)光探針上的探針dna的雜交作用下，通過(guò)催化發(fā)卡自組裝技術(shù)將化學(xué)發(fā)光探針連接在磁珠表面；經(jīng)過(guò)磁分離后，再加入羥胺-o-磺酸，以lumaunps—羥胺-o-磺酸為化學(xué)發(fā)光體系，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定，根據(jù)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光實(shí)現(xiàn)目標(biāo)dna的測(cè)定。本發(fā)明是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)dna的方法，其特征是包括以下步驟：(1)魯米諾膠體金納米粒子的制備；(2)捕獲dna修飾磁珠的制備；(3)探針dna修飾lumaunps的制備；(4)目標(biāo)dna的檢測(cè)。優(yōu)選的，所述的魯米諾膠體金納米粒子的制備包括以下步驟：實(shí)驗(yàn)開始前，將所用的玻璃儀器用hno3/hcl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸餾水沖洗，放入烘箱烘干。取一定量的1％的氯金酸溶液加去離子水稀釋成0.02％的氯金酸溶液并置于三口燒瓶中，在磁力攪拌下加熱回流煮沸；待溶液沸騰后，快速加入0.01ml～5ml0.01m的魯米諾溶液，繼續(xù)加熱煮沸，溶液的顏色由淺黃色變?yōu)楹谏?，最后變成酒紅色，40min后停止加熱，并在繼續(xù)攪拌下冷卻至室溫，得魯米諾膠體金納米粒子，即lumaunps，將制得的lumaunps轉(zhuǎn)移到棕色廣口瓶中，4℃下保存?zhèn)溆?。?yōu)選的，所述的捕獲dna修飾磁珠的制備包括以下步驟：取10μl～100μl羧基化磁珠溶液放入1.5ml離心管中，用10μl～200μl濃度為0.1m咪唑緩沖液洗滌三次，然后分散到0.01ml～2ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑緩沖液的中，在37℃條件下，振蕩反應(yīng)30min；然后向離心管中加入10μl～200μl濃度為5.0×10-8m捕獲dna，在37℃條件下振蕩過(guò)夜，得到捕獲dna修飾磁珠，然后再用2.0ml0.1mpbs緩沖溶液清洗三次，最后分散到2.0mlpbs緩沖溶液中，4℃保存。優(yōu)選的，所述的探針dna修飾lumaunps的制備包括以下步驟：將1μl～20μl的tcep加到10μl～200μl濃度為1.0×10-6m的探針dna溶液中，37℃振蕩活化1小時(shí)，再取100μl～1000μl合成好的lumaunps加入到該溶液中，在37℃條件下震蕩過(guò)夜，然后再加入10μl～200μl含0.3mnaclph8.2的10mmtris-hcl緩沖液；繼續(xù)震蕩48h后，在12000rpm的條件下離心30min后，將紅色沉淀用1mlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液清洗，再次離心，如此重復(fù)三次，得探針dna修飾lumaunps，即化學(xué)發(fā)光探針。最后得到的化學(xué)發(fā)光探針?lè)稚⒌?000μlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆?。?yōu)選的，所述的目標(biāo)dna的檢測(cè)包括以下步驟：取10μl～200μl捕獲dna修飾磁珠溶液置于離心管中，然后取10μl～100μl含目標(biāo)dna的溶液加入到此離心管中，37℃條件下震蕩反應(yīng)40min，然后再加入10μl～100μl探針dna修飾lumaunps溶液，37℃條件下震蕩反應(yīng)40min，通過(guò)目標(biāo)dna與捕獲dna的作用、探針dna與目標(biāo)dna和捕獲dna的作用，化學(xué)發(fā)光探針連接在磁珠表面；經(jīng)過(guò)磁分離后，將磁性分離物分散在50μlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液中，然后再加入羥胺-o-磺酸溶液，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度定量，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)dna的測(cè)定。所述的dna序列為：捕獲dna：5`-atatacgccatgtagcattcggttaggcgtatatttgctt-nh2-3`；目標(biāo)dna：5`-aatatacgcctaaccg-3`；探針dna：5`-sh-tatacgcctaaccgaatgcttaccacgcgtatagcatccga-3`本發(fā)明研究了不同濃度目標(biāo)dna與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系，得到了檢測(cè)目標(biāo)dna的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及線性方程。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果當(dāng)目標(biāo)dna的濃度在80pm到10nm之間時(shí)，隨著目標(biāo)dna濃度的變化，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有明顯變化。經(jīng)計(jì)算得到檢測(cè)目標(biāo)dna的非線性方程為y＝3663.39648+332.34823x(y：化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；x：目標(biāo)dna濃度的對(duì)數(shù)，單位為m)，線性相關(guān)系數(shù)為0.9987，檢測(cè)限為30pm(3σ)(圖2)。該測(cè)定方法的精密度通過(guò)對(duì)濃度為500pm的目標(biāo)dna進(jìn)行11次平行測(cè)定而計(jì)算得出，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6％，表明本發(fā)明的測(cè)定方法有較好的重現(xiàn)性。另外，利用lumaunps-h2o2為檢測(cè)體系，在其他步驟相同時(shí)，按本發(fā)明的方法對(duì)目標(biāo)dna進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定的檢測(cè)限為500pm。表明本發(fā)明提出的一種化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)dna的方法具有高的靈敏度。附圖說(shuō)明圖1檢測(cè)目標(biāo)dna的原理示意圖。圖2目標(biāo)dna的濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度關(guān)系圖。具體實(shí)施方式下面的實(shí)例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的操作方法，但不構(gòu)成對(duì)發(fā)明的進(jìn)一步限制。實(shí)例1：一種化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)dna的方法1.實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑1.1.1儀器設(shè)備dhg鼓風(fēng)干燥箱(善志儀器設(shè)備有限公司，上海)；ar224cn型奧豪斯分析天平(青島中和恒信電子有限公司，青島)；thz型恒溫振蕩箱(佳源興業(yè)科技有限公司，北京)；rfl-1型超微弱化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(瑞邁分析儀器有限公司，西安)；anke-tgl-16c飛翁牌高速離心機(jī)(安亭科學(xué)儀器廠，上海)。1.1.2試劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)、n-羥基丁二酰亞胺(nhs)、氯金酸(haucl4)從sigma公司購(gòu)買；粒徑為0.5μm，濃度為10mg/ml的羧基磁珠從天津倍思樂(lè)色譜技術(shù)開發(fā)中心購(gòu)買；魯米諾(luminol)、羥胺-o-磺酸(hosa)和tcep(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)購(gòu)買于aladdin公司；0.01m的魯米諾用0.1mnaoh溶解，在棕色瓶中保存在4℃冰箱中；取1g氯金酸加100ml水配成1％的氯金酸溶液，用棕色瓶保存，使用前用二次蒸餾水稀釋。pbs緩沖溶液是0.10m，ph7.4，其配制方法是稱取0.1gkh2po4、4.0gnacl、1.45gna2hpo4·12h2o及0.1gkcl溶解于1l水中，即得。本實(shí)驗(yàn)所用到的單鏈dna和發(fā)卡dna(由上海生工生物工程有限公司合成)的序列如下：捕獲dna：5`-atatacgccatgtagcattcggttaggcgtatatttgctt-nh2-3`；目標(biāo)dna：5`-aatatacgcctaaccg-3`；探針dna：5`-sh-tatacgcctaaccgaatgcttaccacgcgtatagcatccga-3`。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的dna進(jìn)行孵育處理后再使用。1.2lumaunps的合成實(shí)驗(yàn)開始前，所用的玻璃儀器均用hno3/hcl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸餾水沖洗，放入烘箱烘干。取100μl1％的氯金酸溶液加去離子水稀釋成50ml0.02％的氯金酸溶液并置于三口燒瓶中，在三口燒瓶中加磁子，并將其放入磁力攪拌器中，磁力攪拌下加熱回流煮沸。待溶液沸騰后，快速加入1ml0.01m的魯米諾溶液，繼續(xù)加熱煮沸40min，溶液的顏色由淺黃色變?yōu)楹谏?，最后變成酒紅色，40min后停止加熱并在繼續(xù)攪拌下冷卻至室溫。將制得的lumaunps轉(zhuǎn)移到棕色廣口瓶中，4℃下保存?zhèn)溆谩?.3捕獲dna修飾磁珠的制備取50μl羧基化磁珠溶液放入1.5ml離心管中，用100μl濃度為0.1m咪唑緩沖液洗滌三次，然后分散到1ml含有0.1medc和0.05mnhs的0.1m咪唑緩沖液中，在37℃條件下，振蕩反應(yīng)30min；然后在離心管中加入100μl濃度為5.0×10-8m捕獲dna，在37℃條件下振蕩過(guò)夜，得到捕獲dna修飾的磁珠，然后再用2.0ml0.1mpbs緩沖溶液清洗三次，最后分散到2.0mlpbs緩沖溶液中，4℃保存。1.4探針dna修飾lumaunps的制備將5μl的tcep加到100μl濃度為1.0×10-6m的探針dna溶液中，37℃振蕩活化1小時(shí)，再取600μl合成好的lumaunps加入到該溶液中，在37℃條件下震蕩過(guò)夜，然后再加入50μl含0.3mnaclph8.2的10mmtris-hcl緩沖液；繼續(xù)震蕩48h后，在12000rpm的條件下離心30min后，將紅色沉淀用1mlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液清洗，再次離心，如此重復(fù)三次，得探針dna修飾lumaunps，即化學(xué)發(fā)光探針。最后得到的化學(xué)發(fā)光探針?lè)稚⒌?000μlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?.5目標(biāo)dna的檢測(cè)取50μl捕獲dna修飾磁珠溶液置于離心管中，然后再取50μl含目標(biāo)dna的溶液加入到離心管中，37℃震蕩反應(yīng)40min，然后再加入50μl探針dna修飾lumaunps溶液，37℃條件下震蕩反應(yīng)40min，通過(guò)目標(biāo)dna與捕獲dna的作用以及探針dna與目標(biāo)dna和捕獲dna的作用，化學(xué)發(fā)光探針連接在磁珠表面；經(jīng)過(guò)磁分離后，將磁性分離物分散在50μlph7.4的0.1mpbs緩沖溶液中，然后再加入羥胺-o-磺酸溶液，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度關(guān)系作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)例2：樣品分析將含目標(biāo)dna的樣品溶液按實(shí)例1中步驟1.5方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和實(shí)例1中步驟1.5所得標(biāo)準(zhǔn)曲線可以獲取目標(biāo)dna含量。根據(jù)發(fā)明的方法對(duì)目標(biāo)dna含量進(jìn)行了測(cè)定，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，樣品測(cè)定回收率為96.00–102.2％，測(cè)定結(jié)果見表1，本發(fā)明的方法在目標(biāo)dna檢測(cè)中具有精密度高的特點(diǎn)。表1.樣品分析測(cè)定結(jié)果編號(hào)含量a,b標(biāo)準(zhǔn)加入量測(cè)得量回收率11.221.002.1896.0％23.595.008.67103.4％34.705.009.81102.2％a7次測(cè)量結(jié)果b單位：nm。sequencelisting<110>青島科技大學(xué)<120>一種化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)dna的方法<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>40<212>dna<213>人工序列<400>1atatacgccatgtagcattcggttaggcgtatatttgctt40<210>2<211>16<212>dna<213>人工系列<400>2aatatacgcctaaccg16<210>3<211>41<212>dna<213>人工序列<400>1tatacgcctaaccgaatgcttaccacgcgtatagcatccga41當(dāng)前第1頁(yè)12