基于高分辨熔解曲線技術(shù)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組及試劑盒和應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)和醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，更具體地，涉及基于高分辨熔解曲線技術(shù)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組，和包括該引物組的試劑盒，以及上述引物組和試劑盒作為遲發(fā)性耳聾基因突變檢測試劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：耳聾是導(dǎo)致交流障礙最常見的疾病，也是臨床上最為常見的遺傳性疾病之一，嚴重影響人類的生活質(zhì)量，我國耳聾人群的現(xiàn)狀尤為嚴重。據(jù)第二次(2006年)全國殘疾人抽樣調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果，我國現(xiàn)有聽力語言殘疾人數(shù)高達2780萬人，占殘疾人總數(shù)的34％，其中單純聽力殘疾人數(shù)約2004萬人；耳聾在新生兒中發(fā)病率高達1～3‰，7歲以下耳聾患者超過70萬人，并且以每年新增2-3萬人的速度增長。所有耳聾患者中，一半以上為遺傳性耳聾。遺傳性耳聾可以分為先天性耳聾，藥物性耳聾和遲發(fā)性耳聾。遺傳性耳聾的致病基因目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多個。國內(nèi)外大樣本的流行病學(xué)研究表明，約70％耳聾患者除耳聾外不伴有其他癥狀，其中g(shù)jb2、slc26a4、線粒體12srrna是最常見的致病基因。slc26a4基因，又稱pds基因，是最常見的致聾基因之一，其突變導(dǎo)致大前庭水管綜合征(主要臨床特征：神經(jīng)性耳聾、前庭水管擴大，伴或不伴內(nèi)耳畸形)，是遲發(fā)性耳聾的主要致病基因。slc26a4基因主要表達在內(nèi)耳內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊，作為氯、碘等陰離子的轉(zhuǎn)運體，調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴液的離子平衡。我國漢族人群中，slc26a4基因最常見的突變?yōu)椋篿vs7-2a>g、c.2168a>g、c.1229c>t、c.1174a>t。耳聾，嚴重地影響兒童語言、認知體系的發(fā)育，而它的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是避免因聾致啞、促進患兒發(fā)育的有效措施。新生兒聽力篩查在我國已經(jīng)普遍開展，但是對于遲發(fā)性耳聾及耳聾高?；純翰荒茏龅皆绨l(fā)現(xiàn)。對新生兒開展聽力和耳聾基因聯(lián)合篩查，可以早期發(fā)現(xiàn)先天遺傳性耳聾，明確遺傳學(xué)病因，便于早期干預(yù)。并且，耳聾基因的篩查能夠?qū)m齡婚育的男女進行遺傳咨詢和婚育指導(dǎo)，減少聾兒出生，減輕家庭和社會負擔(dān)。目前現(xiàn)有的檢測基因點突變的檢測方法主要有：pcr-sanger測序法、pcr-rflp分析法、等位基因特異性pcr法、taqman探針法、基因芯片法、hrm分析法。pcr-sanger測序法是基因突變檢測的金標準，但是存在測序周期長、工作量大、成本高的缺點，不適合于做大量樣本的檢測。pcr-rflp分析法，受到序列的限制多數(shù)snp位點沒有合適的酶切序列，并且操作復(fù)雜，耗時較長，容易產(chǎn)生假陽性。等位基因特異性pcr法，根據(jù)snp位點的堿基差異設(shè)計特異性引物，方法簡便、快捷、費用低廉，缺點是假陽性率較高，對實驗條件要求嚴格。taqman探針法，是高度特異的定量pcr技術(shù)，檢測通量高，結(jié)果可靠，近年來使用較多。缺點是僅適合于檢測已知snp，不能檢測未知的snp位點；并且taqman探針的合成成本較高，對于少量或者中等通量樣本的檢測而言，不是一個經(jīng)濟的選擇；另外，該方法受到snp位點附近序列的限制，一些snp不適合采用taqman探針。基因芯片技術(shù)，與傳統(tǒng)的儀器檢測方法相比具有自動化、高通量、微型化、操作簡便等特點，缺點是需要專門的撒掃描儀器，價格昂貴，不適合于單個或者少量snp位點的檢測，且無法同時處理大量樣本?；诂F(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，亟需一種高效、靈敏、準確的檢測上述遺傳性耳聾常見突變熱點的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于高分辨熔解曲線技術(shù)(hrm)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組，以及包括該引物組的試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種基于高分辨熔解曲線技術(shù)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組，該引物組包括具有seqidno：1～seqidno：8所示堿基序列的引物：①slc26a4基因ivs7-2a>g(rs111033313)引物序列為：slc26a4-ivs7-forward：5'-gccaatggagtttttaacatctt-3'(seqidno：1)slc26a4-ivs7-reverse：5'-ccatatgaaatggcagtagcaat-3'(seqidno：2)②slc26a4基因c.2168a>g(rs121908362)引物序列為：slc26a4-2168-forward：5'-cgagaaaggacacattctttttg-3'(seqidno：3)slc26a4-2168-reverse：5'-cgcgtggttctgtagatagagtatag-3'(seqidno：4)③slc26a4基因c.1229c>t(rs111033220)引物序列為：slc26a4-1229-forward：5'-gccaccactgctctttcc-3'(seqidno：5)slc26a4-1229-reverse：5'-gttgttcctacctgtgtctttc-3'(seqidno：6)④slc26a4基因c.1174a>t(rs201562855)引物序列為：slc26a4-1174-forward：5'-gccaatggagtttttaacatctt-3'(seqidno：7)slc26a4-1174-reverse：5'-ccatatgaaatggcagtagcaat-3'(seqidno：8)。本發(fā)明還提供一種基于高分辨熔解曲線技術(shù)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測試劑盒，該試劑盒包括上述的引物組。根據(jù)本發(fā)明，上述各引物可獨立存管或部分混合存管；為便于后續(xù)pcr檢測，優(yōu)選地，每一對引物混合存管，即具有seqidno：1和seqidno：2所示堿基序列的引物混合存管；具有seqidno：3和seqidno：4所示堿基序列的引物混合存管；具有seqidno：5和seqidno：6所示堿基序列的引物混合存管；具有seqidno：7和seqidno：8所示堿基序列的引物混合存管。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該試劑盒還包括兩對內(nèi)標引物：高溫內(nèi)標正向引物：5'-gcggtcagtcggcctagcggtagccagctgcggcactgcgtgacgctcag-3'(seqidno：9)高溫內(nèi)標反向引物：5'-ctgagcgtcacgcagtgccgcagctggctaccgctaggccgactgaccgc-3'(seqidno：10)低溫內(nèi)標正向引物：5'-atcgtgatttctatagttatctaagtagttggcattaataatttcatttt-3'(seqidno：11)低溫內(nèi)標反向引物：5'-aaaatgaaattattaatgccaactacttagataactatagaaatcacgat-3'(seqidno：12)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，上述內(nèi)標引物的反向引物是與正向完全互補的序列，且3’-端堿基為磷酸修飾，不能進行擴增。根據(jù)本發(fā)明，所述兩對內(nèi)標引物可單獨存管，優(yōu)選地，當上述四組引物對各自混合存管時，所述兩對內(nèi)標引物優(yōu)選分別加入四管引物對中。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該試劑盒還包括：pcr反應(yīng)試劑和熒光染料。所述pcr反應(yīng)試劑的概念為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，即pcr反應(yīng)中所需要的試劑，包括但不限于：dna聚合酶、dntps、mgcl2、pcr反應(yīng)液。上述組分的選擇和用量可以根據(jù)需要調(diào)整。所述熒光染料例如可以為lcgreen，lcgreenplus，syto9或evagreen等飽和熒光染料。這類飽和熒光染料與sybrgreeni等非飽和熒光染料相比，與dna雙鏈有更強的結(jié)合能力、不抑制pcr反應(yīng)、在dna解鏈過程中不會發(fā)生遷移、重排，是實現(xiàn)熔解曲線分辨率的基礎(chǔ)。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還提供上述基于高分辨熔解曲線技術(shù)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組或上述基于高分辨熔解曲線技術(shù)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測試劑盒作為遲發(fā)性耳聾基因突變檢測試劑的應(yīng)用。本發(fā)明的試劑盒可用于slc26a4基因熱點突變(ivs7-2a>g、c.2168a>g、c.1229c>t、c.1174a>t)的檢測。具體方法如下：(1)合成seqidno：1～seqidno：10所示堿基序列的引物；(2)提取外周血細胞樣本的基因組dna，利用步驟(1)得到的引物進行pcr擴增；touchdownpcr擴增程序為：變性，95℃分鐘；循環(huán)擴增：變性，95℃15秒，退火，63→55℃(從63℃開始每個循環(huán)降低0.5℃，直至55℃)20sec，延伸72℃20sec，共45個循環(huán)；接著72℃繼續(xù)延伸5min；(3)利用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)對擴增后的目的基因突變位點進行檢測，通過熔解曲線偏移和曲線形狀變化區(qū)分不同的基因型。具體地，pcr結(jié)束之后，直接進行高分辨熔解曲線分析。應(yīng)用lightscanner32軟件分析hrm結(jié)果，通過高、低溫內(nèi)標對熔解曲線歸一化處理，減少樣品間的誤差；利用已知純合野生型、純合突變型、野生/突變雜合型的樣本dna為對照，根據(jù)熔解曲線的位置和峰形，完成對待測樣本基因型的判斷。hrm利用檢測體系具有極高的溫度均一性和溫度分辨率，可以用于區(qū)分檢測單個堿基差異，并且不受突變堿基位點與類型局限。hrm分析無需昂貴的設(shè)備和試劑，pcr之后，不需要經(jīng)過酶切、電泳、測序等繁雜操作步驟，在pcr結(jié)束后直接運行hrm程序制作熔解曲線，真正實現(xiàn)閉管操作。檢測不需要taqman等標記的熒光探針，僅在pcr體系中加入飽和熒光染料，顯著降低成本。利用本發(fā)明的試劑盒進行檢測，操作簡便、高特異性、結(jié)果重復(fù)性好、成本低廉。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實施方式進行更詳細的描述。圖1為本發(fā)明實施例突變熱點pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2a-圖2b為本實施例中slc26a4基因ivs7-2a>g突變的高分辨率熔解曲線圖。圖3a-圖3b為本實施例中slc26a4基因c.1174a>t突變的高分辨率熔解曲線圖。圖4a-圖4b為本實施例中slc26a4基因c.1229c>t突變的高分辨率熔解曲線圖。圖5a-圖5b為本實施例中slc26a4基因c.2168a>g突變的高分辨率熔解曲線圖。具體實施方式下面將參照附圖更詳細地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。1、引物合成委托上海生物技術(shù)有限公司合成seqidno：1～seqidno：10所示堿基序列的引物。2、提取外周血或足底血樣本的基因組dna，進行pcr擴增。pcr實驗選擇天根生化科技highaffinityhotstarttaq試劑盒(et108)。在pcr反應(yīng)體系中，加入緩沖液、dntps、dna聚合酶、引物、模板dna、h2o。為減少人為誤差，簡化操作流程，本實施例中首先將pcr擴增試劑配置成mix(包括habuffer、dntps、h2o、lcgreenplus、dnapolymerase)，然后分別與不同突變的特異性引物對混勻，分裝至每個反應(yīng)孔；最后加入不同樣本dna(各反應(yīng)組分如表1所示)。表1pcr反應(yīng)體系pcr擴增程序為：變性：95℃分鐘；pcr循環(huán)擴增：95℃變性15秒，65℃降至55℃，退火20sec，72℃延伸20sec，共45個循環(huán)；接著72℃繼續(xù)延伸5min。為了針對每一對引物摸索、優(yōu)選合適的pcr條件。pcr結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，pcr產(chǎn)物為預(yù)期大小的、明亮的單一條帶(如圖1所示)。3、根據(jù)高分辨率熔解曲線法對擴增后的目的基因突變位點進行檢測pcr后，高分辨率熔解曲線的條件(lightscanner32)如表2所示。為確保結(jié)果判讀的準確性，每一組突變的檢測，均設(shè)置純合野生型、純合突變型、野生/突變雜合型的對照樣本。表2過程溫度時間pre-melt95℃30sechrm40℃3minmelt58→94℃升溫：1℃/0.04sec，每秒檢測熒光25次冷卻40℃30sec圖2-圖5示出了本實施例中各熱點突變的高分辨率熔解曲線圖。其中，圖2a、圖2b為ivs7-2a位點的hrm熔解曲線圖；圖3a-圖3b為c.1174a位點的hrmhrm熔解曲線圖；圖4a-圖4b為c.1229位點的hrm熔解曲線圖；圖5a-圖5b為c.2168a位點的hrm熔解曲線圖。結(jié)果顯示該方法適用于slc26a4基因熱點突變的檢測，具有直觀清晰、靈敏度高，特異性好，快速簡便的特點。以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。sequencelisting<110>鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院<120>基于高分辨熔解曲線技術(shù)的遲發(fā)性耳聾基因突變檢測引物組及試劑盒和應(yīng)用<130>1700020<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1gccaatggagtttttaacatctt23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2ccatatgaaatggcagtagcaat23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3cgagaaaggacacattctttttg23<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<400>4cgcgtggttctgtagatagagtatag26<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5gccaccactgctctttcc18<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6gttgttcctacctgtgtctttc22<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7gccaatggagtttttaacatctt23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8ccatatgaaatggcagtagcaat23<210>9<211>50<212>dna<213>人工序列<400>9gcggtcagtcggcctagcggtagccagctgcggcactgcgtgacgctcag50<210>10<211>50<212>dna<213>人工序列<400>10ctgagcgtcacgcagtgccgcagctggctaccgctaggccgactgaccgc50<210>11<211>50<212>dna<213>人工序列<400>11atcgtgatttctatagttatctaagtagttggcattaataatttcatttt50<210>12<211>50<212>dna<213>人工序列<400>12aaaatgaaattattaatgccaactacttagataactatagaaatcacgat50當前第1頁12