專利名稱：一種從禽畜血液中提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種對禽畜血液進行精深加工的生產方法，主要涉及一種以禽畜血液為原料，利用水蛭蛋白酶提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法。
背景技術：
畜禽血液含量因動物種類而異，以豬血為例，其重量約為生豬活體重的3% 5%。屠宰動物后所能收集到的血液約占總量60% 70%，其余的滯留于肝、腎、皮膚和體內。通常屠宰一頭豬,約可收集2.0 3. Okg血液。我國從70年代開始逐漸認識到禽畜血液具有較高營養(yǎng)保健價值，但受諸多因素限制，對其利用還很不完善，導致大量寶貴的畜禽血液資源浪費，并且造成環(huán)境污染。70年代末期和80年代初期，國家開始重視禽畜血液的綜合利用，將其作為重點課題進行攻關， 相繼開發(fā)研究出一些禽畜血液制品。近幾年來取得很大進展，相繼出現(xiàn)許多重大科研成果，使其經濟效益和社會效益大幅度提高，尤其是在畜禽飼料、營養(yǎng)補劑、血紅素、血卟啉衍生物、氨基酸營養(yǎng)液等項目上的研究及應用，達到國際先進水平。過去十年中，中國禽畜飼養(yǎng)的地區(qū)化趨勢日益明顯，加之各地區(qū)都在實行集中屠宰制度，禽畜血液來源集中、廣泛且安全可靠，因此充分利用禽畜血液在我國顯得尤為重要。如何合理開發(fā)利用這一寶貴資源，已經引起國內有關部門的高度重視，尤其是提取在多種行業(yè)中均起重要作用的血紅素更是眾多研究的熱點，利用禽畜血液制備高純度氯化血紅素及珠蛋白肽對于提高禽畜血液綜合利用程度有舉足輕重的地位，同時也是既有經濟價值，又有社會價值的事業(yè)。血紅素是血紅蛋白的活性部位，是一類重要的天然卟啉鐵化合物，廣泛存在于高等動物的血液、肌肉中。從動物血液中提取的血紅素產品一般是氯化高鐵血紅素簡稱氯化血紅素，即原卟啉結合一個氯離子形成的氯化血紅素。氯化血紅素用于治療缺鐵性貧血，不僅療效顯著，治愈率高而且無胃腸道副作用，服用方便，易于患者接受，是目前療效最好的補鐵劑。珠蛋白肽是血紅蛋白脫除血紅素后的蛋白部分經酶解而成的小肽，比完全的游離氨基酸更易、更快被機體吸收利用，在促進免疫細胞增生、抗腫瘤、抗氧化、增強機體免疫力等方面有一定的功效。提取氯化血紅素常見且工藝成熟的方法主要有醋酸鈉法、蒸餾法、鞣酸法、羧甲基纖維素法和冰醋酸法。但在原理上，醋酸鈉法、蒸餾法、鞣酸法都是利用丙酮進行制備。其工藝流程復雜，溶劑回收困難，不太適用于規(guī)?；I(yè)生產，并且產品中會有機溶劑的殘留，存在一定的安全隱患。采用生物酶解的方法將禽畜血液中的血紅素及蛋白質分開，是一種較為可行的技術方案。但是由于市場上購買合適的蛋白酶制劑價格較高，對工業(yè)化生產成本影響極大
發(fā)明內容
為了克服現(xiàn)有工藝的問題和缺陷，充分利用禽畜血液資源，本發(fā)明提供一種利用以水蛭提取物作為蛋白酶制劑從禽畜血液中提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法。水蛭，俗名螞蟥，在內陸淡水水域內生長繁殖，是我國傳統(tǒng)的特種藥用水生動物，其干制品炮制后中醫(yī)入藥，具有治療中風、高血壓、清瘀、閉經、跌打損傷等功效。古代醫(yī)書中記載有利用水蛭治療多種疾病，謂其“主逐惡血、瘀血、月閉、破血消積聚”，醫(yī)圣張仲景用其祛邪扶正，治療“瘀血”、“水結”之癥，顯示了其獨特的療效。成年水蛭主要以動物的血液為食物，其消化系統(tǒng)所含的蛋白酶可以高效酶解所食血液中的蛋白質，以利于消化吸收。本發(fā)明主要是利用從水蛭提取物作為 蛋白酶制劑將禽畜血液中的血紅素及蛋白質分開，并綜合采用超聲波技術及膜分離技術得到高純度氯化血紅素及珠蛋白肽共兩種產物。本發(fā)明的日的可以通過下述技術方案來實現(xiàn)利用水蛭蛋白酶從禽畜血液中提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法，其特征在于按以下步驟進行a、將水蛭洗凈，曬干，切碎；b、將a步驟中切碎后的水蛭放入濃度為0. 05% 0. 12%的檸檬酸鈉緩沖液中，料液比為I : 5，pH值為5. 0 6. 5，溫度為35 50°C，浸泡10 30分鐘，離心分離；C、將b步驟中離心分離得到的上清液中加入硫酸銨達到飽和度為30 % 50 %，進行分級沉淀，得到的上清液為水蛭蛋白酶溶液備用；d、將新鮮禽畜血液按0. 8% I. 0%的比例加入檸檬酸三鈉作抗凝劑，均勻混合10分鐘，然后離心分離，棄去上清液，收集下層血紅蛋白細胞；e、將d步驟中收集的血紅蛋白細胞按照I : I的比例與純水混合，超聲波處理15 20分鐘破碎細胞；f、將e步驟中的細胞破碎液經100目篩網過濾，留下濾液調節(jié)pH值至2.0 3.5 ;g、將f步驟中調好pH值的細胞破碎液中迅速升溫至85 95°C，保溫10 15分鐘，使蛋白質充分變性；按5%的比例加入由c步驟中得到的水蛭蛋白酶溶液進行酶解，調節(jié)PH值為5. 0 6. 5，酶解時間為100 180分鐘，保持溫度為40 60°C ;h、將g步驟得到的酶解液升溫到85 90°C滅酶，時間為5分鐘左右，調節(jié)pH值至4. 0 5. 5，離心分離得到的沉淀物經水洗后再脫水干燥即得到氯化血紅素；i、將h步驟中離心分離得到的上清液經過微濾膜裝置過濾，截留雜質、纖維和大分子蛋白等，得到微濾膜濾液，微濾膜過濾孔徑為0. I I. Oum ；j、將i步驟中得到的微濾膜濾液再經過納濾膜裝置進行濃縮，為后續(xù)脫水干燥工序減輕負擔，納濾膜過濾孔徑為0. I I. Onm ；k、再將j步驟中得到的納濾膜濃縮液脫水干燥，得到珠蛋白肽。所述步驟b中的檸檬酸鈉緩沖液濃度為0. 08% 0. 10%，pH值為5. 5 6. 0，溫度為40 45°C，浸泡15 20分鐘。所述步驟f中的細胞破碎液濾液調節(jié)pH值為2. 5 3. O。所述步驟g中的酶解過程調節(jié)pH值為5. 5 6. 0，酶解時間為120 150分鐘，保持溫度為45 50°C。所述步驟h中滅酶后的酶解液pH值調至4. 5 5. O。
本發(fā)明與已有工藝相比，具有以下優(yōu)點本發(fā)明有效利用了禽畜血液資源，采用生物酶法與超聲波技術、膜分離技術相結合，提取氯化血紅素和珠蛋白肽。本發(fā)明利用水蛭提取物作為蛋白酶制劑將禽畜血液中的蛋白質進行降解并與血紅素拆分，降低了 酶解提取工藝的生產成本。本發(fā)明工藝簡單易行，操作安全，可以得到高品質的目標產物。本發(fā)明得到的氯化血紅素的外觀為黑色粉末，純度大于90% ;珠蛋白肽的外觀為粉紅色，蛋白質純度大于90%，其分子量主要分布在200 IOOODal之間。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細的說明實施例I :取水蛭100g，洗凈后曬干；切碎；放入濃度為0. 08%的檸檬酸鈉緩沖液中，料液比為I : 5，pH值為5. 5，溫度為40°C，浸泡15分鐘；離心分離，收集上清液；將上清液加入硫酸銨達到飽和度為30%，進行分級沉淀，得到的上清液水蛭蛋白酶溶液備用。取200ml新鮮豬血，按照0. 8%的比例加入抗凝劑檸檬酸三鈉，均勻混合10分鐘后離心分離，去掉上清液，收集下層血紅蛋白細胞，約IOOml左右；再按照I : I的比例加入純水，超聲波處理15分鐘破碎細胞；將破碎液經100目篩網過濾，留下濾液，用稀鹽酸緩慢調節(jié)濾液pH值至2. 5 ；迅速升溫至85°C，保溫10分鐘，使蛋白質充分變性；按5%的比例加入制備好的水蛭蛋白酶溶液進行酶解，調節(jié)PH值至5. 5，酶解時間為120分鐘，保持溫度為45°C ;酶解完成后再升溫到85°C滅酶，時間為5分鐘左右；調節(jié)酶解液pH值至4. 5，離心分離后分別得到沉淀物和上清液。沉淀物經過水洗后再脫水干燥即可得到氯化血紅素；而上清液先經過濾孔徑為0. 2um的微濾膜進行除雜，分別得到濃縮液和濾液；濾液再用過濾孔徑為0. 2nm的納濾膜進行濃縮；最后將濃縮液進行脫水干燥，可得到珠蛋白肽。實施例2 取水蛭2kg，洗凈后曬干；切碎；放入濃度為0. 10%的檸檬酸鈉緩沖液中，料液比為I : 5，pH值為6. 0，溫度為45°C，浸泡20分鐘；離心分離，收集上清液；將上清液加入硫酸銨達到飽和度為50%，進行分級沉淀，得到的上清液水蛭蛋白酶溶液備用。取IOOkg新鮮雞血，按照I. 0%的比例加入抗凝劑檸檬酸三鈉，均勻混合10分鐘后離心分離，去掉上清液，收集下層血紅蛋白細胞，約50kg左右；再按照I : I的比例加入純水，超聲波處理20分鐘破碎細胞；將破碎液經過100目篩網過濾，留下濾液，用稀鹽酸緩慢調節(jié)濾液pH值至3. 0 ;迅速升溫至95°C，保溫15分鐘，使蛋白質充分變性；按5%的比例加入制備好的水蛭蛋白酶溶液進行酶解，調節(jié)PH值至6. 0，酶解時間為150分鐘，保持溫度為50°C ;酶解完成后再升溫到90°C滅酶，時間為5分鐘左右；調節(jié)酶解液pH值至5. 0，離心分離后分別得到沉淀物和上清液。沉淀物經過水洗后再脫水干燥即可得到氯化血紅素；而上清液先經過濾孔徑為0. 5um的微濾膜進行除雜，分別得到濃縮液和濾液；濾液再用過濾孔徑為0. 5nm的納濾膜進行濃縮；最后將濃縮液進行脫水干燥，可得到珠蛋白肽。
權利要求
1.一種從禽畜血液中提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法，其特征在于按以下步驟進行 a、將水蛭洗凈，曬干，切碎； b、將a步驟中切碎后的水蛭放入濃度為O.05% O. 12%的檸檬酸鈉緩沖液中，料液比為I : 5，pH值為5. O 6. 5，溫度為35 50°C，浸泡10 30分鐘，離心分離； C、將b步驟中離心分離得到的上清液中加入硫酸銨達到飽和度為30% 50%，進行分級沉淀，得到的上清液為水蛭蛋白酶溶液備用； d、將新鮮禽畜血液按O.8% I. O %的比例加入檸檬酸三鈉作抗凝劑，均勻混合10分鐘，然后離心分離，棄去上清液，收集下層血紅蛋白細胞； e、將d步驟中收集的血紅蛋白細胞按照I: I的比例與純水混合，超聲波處理15 20分鐘破碎細胞； f、將e步驟中的細胞破碎液經100目篩網過濾，留下濾液調節(jié)pH值至2.O 3. 5 ; g、將f步驟中調好pH值的細胞破碎液中迅速升溫至85 95°C，保溫10 15分鐘，使蛋白質充分變性；按5%的比例加入由c步驟中得到的水蛭蛋白酶溶液進行酶解，調節(jié)pH值為5. O 6. 5，酶解時間為100 180分鐘，保持溫度為40 60°C ; h、將g步驟得到的酶解液升溫到85 90°C滅酶，時間為5分鐘左右，調節(jié)pH值至4.O 5. 5，離心分離得到的沉淀物經水洗后再脫水干燥即得到氯化血紅素； i、將h步驟中離心分離得到的上清液經過微濾膜裝置過濾，截留雜質、纖維和大分子蛋白等，得到微濾膜濾液，微濾膜過濾孔徑為O. I I. Oum ； j、將i步驟中得到的微濾膜濾液再經過納濾膜裝置進行濃縮，為后續(xù)脫水干燥工序減輕負擔，納濾膜過濾孔徑為O. I I. Onm ； k、再將j步驟中得到的納濾膜濃縮液脫水干燥，得到珠蛋白肽。
2.根據權利要求I所述的一種從禽畜血液中提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法，其特征在于所述步驟a中的檸檬酸鈉緩沖液濃度為O. 08% O. 10%，pH值為5. 5 6. 0，溫度為40 45°C，浸泡15 20分鐘。
3.根據權利要求I所述的一種從禽畜血液中提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法，其特征在于所述步驟f中的細胞破碎液濾液調節(jié)pH值為2. 5 3. O。
4.根據權利要求I所述的一種從禽畜血液中提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法，其特征在于所述步驟g中的酶解過程調節(jié)pH值為5. 5 6.0，酶解時間為120 150分鐘，保持溫度為45 50°C。
5.根據權利要求I所述的一種從禽畜血液中提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法，其特征在于所述步驟h中滅酶后的酶解液pH值調至4. 5 5. O。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以禽畜血液為原料，利用水蛭蛋白酶提取氯化血紅素和珠蛋白肽的方法。主要步驟是1.中溫浸提制備水蛭蛋白酶備用；2.取新鮮禽畜血液抗凝處理后離心收集血紅蛋白細胞；3.加入一倍純水，超聲波處理破碎細胞；4.篩網過濾，留下濾液調節(jié)pH值；5.加入水蛭蛋白酶進行酶解；6.調節(jié)酶解液pH值離心分離；7.離心后的沉淀物經水洗后再脫水干燥即得到氯化血紅素；離心后的上清液進行微濾膜除雜，納濾膜濃縮，其濃縮液再脫水干燥可得到珠蛋白肽。本發(fā)明充分利用禽畜血液資源，并以水蛭提取物為酶制劑生產具有高附加值的氯化血紅素及珠蛋白肽，工藝簡單易行，生產成本較低，適合于工業(yè)化生產。
文檔編號C07D487/22GK102659791SQ20121010604
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權日2012年4月12日
發(fā)明者萬端極, 司佳, 吳堯, 吳正奇, 廖宇杰, 徐國念, 徐禮鵬, 李猷, 楊濤, 王雄, 肖詩英, 蔡君, 鄒華蓉, 馬超 申請人:武漢普賽特膜技術循環(huán)利用有限公司