一種光輝霉素納米顆粒懸浮液及其制備方法與流程

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于藥物遞送技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種光輝霉素納米顆粒懸浮液，還涉及所述光輝霉素納米顆粒懸浮液的制備方法。

背景技術(shù)：

光輝霉素(mithramycina，mit)，又名普卡霉素，是一種天然生成的聚酮類抗腫瘤抗生素，屬于金霉酸家族。光輝霉素被批準(zhǔn)臨床應(yīng)用以來，其作為一種化療藥物先后被用于治療睪丸胚胎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤。光輝霉素能夠通過與dna上gc富集區(qū)的小溝結(jié)合，最主要的作用機(jī)制是競爭性抑制轉(zhuǎn)錄因子sp1與基因調(diào)控元件的結(jié)合，繼而影響dna-蛋白復(fù)合物的形成，并調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。sp1是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)并且參與調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展過程中多個方面的基因表達(dá)，包括擴(kuò)增、分化、dna損傷修復(fù)、凋亡、血管生成、癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。光輝霉素能夠通過抑制sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，調(diào)控下游基因的表達(dá)，如啟動子中包含sp1結(jié)合位點(diǎn)的癌基因c-myc和c-src在光輝霉素處理后表達(dá)量明顯下降。同時(shí)，光輝霉素還能夠下調(diào)p53負(fù)調(diào)控因子mdm2的轉(zhuǎn)錄水平，從而激活p53通路并引起細(xì)胞周期阻滯和凋亡過程。光輝霉素也被證明能夠通過多個途徑逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的藥物阻抗，比如降低異元生物質(zhì)泵abcg2和多藥耐藥基因mdr1的表達(dá)量。已有研究表明，光輝霉素能夠通過抑制dna甲基化轉(zhuǎn)移酶dnmt和組蛋白乙?；竓dac影響表觀遺傳。臨床前研究已經(jīng)證明，光輝霉素能夠抑制肺癌、肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、胃癌和前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近些年，光輝霉素的臨床前研究成果也促使其用于治療癌癥的多個i/ii期臨床試驗(yàn)相繼開展。由此可見，光輝霉素在腫瘤治療方面的臨床應(yīng)用可能會有一個更大的發(fā)展。然而，光輝霉素在臨床用于腫瘤治療時(shí)需要較高劑量，而其產(chǎn)生的系統(tǒng)性毒性限制了治療效果。為了增強(qiáng)其安全性和療效，開發(fā)新的光輝霉素遞送系統(tǒng)是一種可行的方法。

納米技術(shù)依靠其獨(dú)有的特性已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)，特別是在癌癥治療方面。使用納米顆粒作為載體靶向輸送化療藥物被認(rèn)為能夠很好地改善生物利用度以及減少系統(tǒng)毒性。與小分子藥物本身相比，載藥納米顆粒能夠避免腎清除繼而延長在血漿中的半衰期。同時(shí)，由于腫瘤組織中異常的微血管壁以及被抑制的淋巴管外排功能，使得納米尺度的物質(zhì)能夠依靠epr效應(yīng)(enhancedpermeabilityandretention)在腫瘤部位積累。由機(jī)體內(nèi)天然分子共聚形成的多聚物材料均有生物可降解和生物相容的特性，并且已被用于多種方式的臨床治療。多聚物能夠保護(hù)包載物不被降解并可控釋放，廣泛用于制備多種藥物遞送系統(tǒng)。其所制備的藥物載體中藥物釋放速度受到多聚物在體內(nèi)降解速度以及藥物在基質(zhì)中擴(kuò)散速度影響，從而發(fā)揮控制釋放的作用。納米顆粒能夠通過修飾表面延長血漿半衰期，從而更好的發(fā)揮被動靶向作用。

基于以上現(xiàn)有技術(shù)狀況，本發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)研究與總結(jié)分析，終于完成了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

[要解決的技術(shù)問題]

本發(fā)明的目的是提供一種光輝霉素納米顆粒懸浮液。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述光輝霉素納米顆粒懸浮液的制備方法。

[技術(shù)方案]

本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明涉及一種光輝霉素納米顆粒懸浮液的制備方法。

本發(fā)明光輝霉素納米顆粒懸浮液的制備方法步驟如下：

a、制備二嵌段共聚物溶液

將二嵌段共聚物溶于乙酸乙酯溶劑中，得到濃度為30～40mg/ml的二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液；

b、制備光輝霉素有機(jī)相

按照以毫升計(jì)乙酸乙酯溶液與以毫克計(jì)光輝霉素的比1：1.0～3.0，把光輝霉素加到上述二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液中，振蕩溶解，得到一種含有光輝霉素的有機(jī)相；

c、制備乳化劑溶液

將乳化劑溶于水中，得到濃度為以重量計(jì)0.5～5％的乳化劑溶液；

d、混合

在使用剪切力均質(zhì)機(jī)對步驟c制備的乳化劑溶液進(jìn)行均質(zhì)的條件下，滴加在步驟b得到的有機(jī)相，滴加結(jié)束后立即將混合液置于冰浴中，繼續(xù)使用探頭超聲儀進(jìn)行超聲乳化；

e、后處理

步驟d得到的乳化液使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫下除去其中含有的有機(jī)溶劑；接著使用millipore公司截留分子量為30000da的超濾管除去其中含有的未包載游離藥物，使用雙蒸水對懸液進(jìn)行連續(xù)超濾清洗，然后通過0.22μm針頭濾器過濾，得到光輝霉素納米顆粒懸浮液。

根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟a中，所述的二嵌段共聚物是由兩種選自聚乳酸乙醇酸共聚物、聚乙二醇、左旋聚乳酸、右旋聚乳酸、外消旋聚乳酸、聚酰胺、聚異丙基丙烯酰胺、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚己內(nèi)酯、聚氨基幾丁聚糖、聚氧化乙烯、醋酸纖維素、聚[(r)-3-羥基丁酸]、聚多糖或聚2-羥乙基甲基丙烯酸的生物相容性聚合物組成的。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟a中，所述的乙酸乙酯由選自二氯甲烷、三氯甲烷或乙醚的有機(jī)溶劑代替。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟b中，光輝霉素由選自光輝霉素sk、光輝霉素sdk或ec-8042的光輝霉素結(jié)構(gòu)改造化合物代替。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟c中，所述的乳化劑選自泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、pva、聚氧乙烯蓖麻油、維生素e聚乙二醇琥珀酸酯、聚乙烯馬來酸酐、膽酸鈉、磺基琥珀酸二辛酯鈉、十六烷基三甲基溴化銨、皂苷、糖酯、吐溫20或吐溫80。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟d中，所述的混合液在30～50％振幅的條件下超聲乳化2～6min。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟d中，所述的光輝霉素納米顆粒懸浮液在溫度4℃下儲存。

本發(fā)明還涉及所述制備方法制備得到的光輝霉素納米顆粒懸浮液。

根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，光輝霉素納米顆粒具有下述物理特性：

平均粒徑為20.4～29.6nm；多聚物分散性指數(shù)為0.252～0.282；表面電荷為-15.0～24.2mv。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述光輝霉素納米顆粒具有下述化學(xué)特性：

該光輝霉素納米顆粒的載藥量為1.60～2.62％；包封率為22.28～36.68％；在透析管中，在100mlph7.4pbs溶液中，在溫度37℃與轉(zhuǎn)速150rpm的磁力攪拌下5天總釋放率為59.4～65.4％。

下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

本發(fā)明涉及一種光輝霉素納米顆粒懸浮液的制備方法。

本發(fā)明光輝霉素納米顆粒懸浮液的制備方法步驟如下：

a、制備二嵌段共聚物溶液

將二嵌段共聚物溶于乙酸乙酯溶劑中，得到濃度為30～40mg/ml的二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液；

在本發(fā)明中，二嵌段共聚物的主要作用是作為載體材料包載藥物并且控制藥物釋放，延長藥物的血漿半衰期。

根據(jù)本發(fā)明，所述的二嵌段共聚物是由兩種選自聚乳酸乙醇酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)，plga]、聚乙二醇[poly(ethyleneglycol)，peg]、左旋聚乳酸[poly(l-lacticacid),plla]、右旋聚乳酸[poly(d-lacticacid)，pdla]、外消旋聚乳酸[poly(d,l-lacticacid)，pdlla]、聚酰胺(polyamide，pa)、聚異丙基丙烯酰胺[poly(n-isopropylacrylamide)，pnipa]、聚乙烯亞胺(polyethylenimine，pei)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol，pva)、聚乙酸乙烯酯(polyvinylacetate，pvac)、聚己內(nèi)酯[poly(e-caprolactone)，pcl]、聚氨基幾丁聚糖(chitosan)、聚氧化乙烯[poly(ethyleneoxide)，peo]、醋酸纖維素(celluloseacetate，ca)、聚[(r)-3-羥基丁酸]{poly[(r)-3-hydroxybutyricacid]，phb}、聚多糖(polysaccharide)、聚2-羥乙基甲基丙烯酸[poly(2-hydroxyethylmethacrylate)，phema]的生物相容性聚合物組成的。例如，本發(fā)明使用的二嵌段共聚物都是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由濟(jì)南岱罡生物工程有限公司以商品名聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物銷售的peg-plga二嵌段共聚物、由濟(jì)南岱罡生物工程有限公司公司以商品名聚乙二醇聚己內(nèi)酯二嵌段共聚物銷售的peg-pcl二嵌段共聚物、由濟(jì)南岱罡生物工程有限公司以商品名聚乙二醇左旋聚乳酸銷售的peg-plla二嵌段共聚物、由濟(jì)南岱罡生物工程有限公司以商品名聚乙二醇右旋聚乳酸銷售的peg-pdla二嵌段共聚物。

根據(jù)本發(fā)明，使用的乙酸乙酯溶劑可以由選自二氯甲烷、三氯甲烷或乙醚的有機(jī)溶劑代替。本發(fā)明使用的溶劑可以是其中一種上述溶劑或多種上述溶劑的混合物，這些溶劑都是目前市場上銷售的產(chǎn)品。當(dāng)然，凡是具有與所述有機(jī)溶劑相近性能，同時(shí)對光輝霉素納米顆粒懸浮液沒有不利影響的其它有機(jī)溶劑也可以應(yīng)用于本發(fā)明，這些溶劑也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

根據(jù)本發(fā)明，如果二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液的濃度小于30mg/ml，則包封率下降；如果二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液的濃度大于40mg/ml，則粒徑增加并且載藥量下降；因此，二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液的濃度為30～40mg/ml是合理的；優(yōu)選地是32～38mg/ml。

b、制備光輝霉素有機(jī)相

按照以毫升計(jì)乙酸乙酯溶液與以毫克計(jì)光輝霉素的比1：1.0～3.0，把光輝霉素加到上述二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液中，振蕩溶解，得到一種含有光輝霉素的有機(jī)相；

本發(fā)明使用的光輝霉素是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由sigma-aldrich公司以商品名mithramycin銷售的光輝霉素。

本發(fā)明使用的光輝霉素可以由選自光輝霉素sk、光輝霉素sdk或ec-8042的光輝霉素結(jié)構(gòu)改造化合物代替。這些光輝霉素結(jié)構(gòu)改造化合物是光輝霉素糖鏈以及糖配基基團(tuán)修飾和改造產(chǎn)物，它們是與光輝霉素具有相似結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的化合物。例如光輝霉素sk、光輝霉素sdk是由文獻(xiàn)jamchemsoc.2003may14；125(19):5745-53報(bào)道的與光輝霉素具有相似作用的衍生物；光輝霉素ec-8042是由clincancerres.2016aug15；22(16):4105-18報(bào)道的與光輝霉素具有相似作用的衍生物。

在本發(fā)明中，如果乙酸乙酯溶液與光輝霉素的比大于1：1.0，則載藥量降低；如果乙酸乙酯溶液與光輝霉素的比小于1：3.0，則包封率降低；因此，乙酸乙酯溶液與光輝霉素的比為1：1.0～3.0是恰當(dāng)?shù)?，?yōu)選地是1：1.4～2.6；更優(yōu)選地是1：1.8～2.2。

c、制備乳化劑溶液

將乳化劑溶于水中，得到濃度為以重量計(jì)0.5～5％的乳化劑溶液；

在本發(fā)明中，乳化劑的主要作用是降低有機(jī)相與水相之間的表面張力并降低有機(jī)相在水相中所形成液滴的大小，因此，本發(fā)明使用的乳化劑是水包油類型的乳化劑。在本發(fā)明中，凡是具有這些作用，同時(shí)對光輝霉素納米顆粒懸浮液不會產(chǎn)生不良影響的乳化劑都可以應(yīng)用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

根據(jù)本發(fā)明，所述的乳化劑選自泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、pva、聚氧乙烯蓖麻油(cremophorel)、維生素e聚乙二醇琥珀酸酯(vitamine-tpgs)、聚乙烯馬來酸酐[poly(ethylene-alt-maleicanhydride)，pema]、膽酸鈉(cholicacidsodiumsalt，cha)、磺基琥珀酸二辛酯鈉(dioctylsulfosuccinatesodium，dss)、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammoniumbromide，ctab)、皂苷(saponin)、糖酯(sugaresterd1216)、吐溫20或吐溫80。

本發(fā)明使用的這些乳化劑都是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由gibco公司以普朗尼克f-68商品名銷售的泊洛沙姆188、由百靈威公司以聚乙烯醇商品名銷售的pva、由medchemexpress公司以維生素e聚乙二醇琥珀酸酯商品名銷售的vitamine-tpgs、由德國巴斯夫公司銷售的cremophorel。

d、混合

在使用剪切力均質(zhì)機(jī)對步驟c制備的乳化劑溶液進(jìn)行均質(zhì)的條件下，滴加在步驟b得到的有機(jī)相，滴加結(jié)束后立即將混合液置于冰浴中，繼續(xù)使用探頭超聲儀進(jìn)行超聲乳化；

本發(fā)明首先使用剪切力均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)的作用是使有機(jī)相初步形成乳滴；然后使用探頭超聲儀進(jìn)行超聲乳化的作用是進(jìn)一步乳化并使乳滴減小并均一化；

使用剪切力均質(zhì)機(jī)在22000rpm條件下對步驟c制備的乳化劑進(jìn)行均質(zhì)。本發(fā)明使用的剪切力均質(zhì)機(jī)例如是由大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司以商品名手持式均質(zhì)機(jī)銷售的產(chǎn)品。

優(yōu)選地，使用探頭超聲儀讓所述的混合液在30～50％振幅的條件下超聲乳化2～6min。本發(fā)明使用的探頭超聲儀例如是由sonics&materials公司以商品名探頭超聲儀銷售的產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明，所述的光輝霉素納米顆粒懸浮液在溫度4℃下儲存，這是因?yàn)楸苊馑幬镌趦Υ孢^程中釋放并且該納米顆?；鞈覄┰?℃下穩(wěn)定。

e、后處理

步驟d得到的乳化液使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫下除去其中含有的有機(jī)溶劑；接著使用millipore公司截留分子量為30000da的超濾管除去其中含有的未包載游離藥物，使用雙蒸水對懸液進(jìn)行連續(xù)超濾清洗，然后通過0.22μm針頭濾器過濾，得到光輝霉素納米顆粒懸浮液。

使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫減壓條件下除去有機(jī)溶劑，以達(dá)到乳化液中的有機(jī)溶劑含量為以重量計(jì)0.01％以下。

本發(fā)明使用的真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀例如是由上海亞榮生化儀器廠以商品名旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器銷售的產(chǎn)品。

本發(fā)明使用超濾管除去未包載游離藥物時(shí)，乳化液中未包載游離藥物的含量為以重量計(jì)0.01％以下。

本發(fā)明使用雙蒸水連續(xù)超濾清洗的目的是去除游離藥物以及過量的乳化劑。

本發(fā)明還涉及所述制備方法制備得到的光輝霉素納米顆粒懸浮液。

按照下述方法檢測本發(fā)明光輝霉素納米顆粒的粒徑、表面電位與形態(tài)：

將制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液使用雙蒸水稀釋十倍，加到樣品池中，再置于由布魯克海文公司銷售的zetaplus粒度儀中，在溫度25℃下采用動態(tài)光散射法檢測顆粒粒徑和表面電位。

為了觀察顆粒形態(tài)，取50ul10μg/ml光輝霉素納米顆粒懸浮液滴加在鋁箔上，在室溫下?lián)]干，然后固定于銅塊上并噴金膜，然后使用掃描電鏡檢測。

另將10μg/ml光輝霉素納米顆粒懸浮液滴加至覆蓋碳膜的200目銅網(wǎng)上，用濾紙吸取多余液體，在銅網(wǎng)上保留一層液膜，自然干燥。使用以重量計(jì)2％磷鎢酸溶液負(fù)染樣品15min，然后用蒸餾水洗去游離磷鎢酸并晾干，置于透射電鏡檢測。檢測結(jié)果顯示(參見附圖2)，本發(fā)明方法制備的光輝霉素納米顆粒平均粒徑為20.4～29.6nm；多聚物分散性指數(shù)為0.252～0.282；表面電荷為-15.0～24.2mv。電鏡照片顯示納米顆粒為近球形。

按照下述方法檢測本發(fā)明光輝霉素納米顆粒的載藥量和包封率：

取1ml光輝霉素納米顆粒懸液置于溫度-70℃預(yù)凍，然后凍干24h。凍干納米顆粒稱重，并加入1ml二甲基亞砜溶解。使用超聲浴處理30min，再在12000xg條件下離心15min，上清液采用hplc檢測，并由光輝霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算納米顆粒中所包藥物含量。載藥量和包封率計(jì)算公式如下：

檢測結(jié)果顯示，光輝霉素納米顆粒的載藥量為1.60～2.62％；包封率為22.28～36.68％。

光輝霉素納米顆粒體外藥物釋放速率檢測：

取1ml超濾的光輝霉素納米顆粒懸液置于透析管中，然后將透析管放入100mlpbs(ph7.4)中，在溫度37℃下以150rpm低速磁力攪拌pbs。在多個時(shí)間點(diǎn)取出1ml透析管外側(cè)液體進(jìn)行hplc檢測其光輝霉素濃度，同時(shí)再補(bǔ)充1ml新鮮pbs。檢測結(jié)果列于圖3。

圖3結(jié)果顯示，所制備的光輝霉素納米顆粒在初始的48h內(nèi)，有一個較快地釋放速度，而后光輝霉素保持一個相對持續(xù)地緩慢釋放，5天后總釋放率為59.4～65.4％。

本發(fā)明通過乳化溶劑揮發(fā)技術(shù)建立了一種制備光輝霉素納米顆粒的方法，該方法能夠有效地提高兩性化合物光輝霉素的載藥量和包封率，并具有粒徑小的特點(diǎn)，有效改善了靜脈給藥問題。目前，尚未見有利用相似方式制備光輝霉素納米顆粒的報(bào)道。

[有益效果]

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明光輝霉素納米顆粒的平均粒徑為20.4～29.6nm；多聚物分散性指數(shù)為0.252～0.282；表面電荷為-15.0～24.2mv。該光輝霉素納米顆粒的載藥量為1.60～2.62％；包封率為22.28～36.68％；在透析管中，在100mlph7.4pbs溶液中，在溫度37℃與轉(zhuǎn)速150rpm的磁力攪拌下5天總釋放率為59.4～65.4％。

本發(fā)明通過乳化溶劑揮發(fā)法制備包載光輝霉素的納米顆粒，改善藥物的釋放動力學(xué)，減緩藥物的體內(nèi)降解過程，改變藥物循環(huán)時(shí)間，增加藥物在腫瘤部位富集，以及避免機(jī)體的藥物阻抗機(jī)制。本發(fā)明制備的光輝霉素納米顆粒能夠較好地保留光輝霉素的藥理學(xué)活性，而且本發(fā)明使用的材料為生物相容性材料，具有應(yīng)用安全性特點(diǎn)，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。同時(shí)，所述光輝霉素納米顆粒能夠有效在裸鼠移植瘤部位富集，并展現(xiàn)了對人胰腺癌細(xì)胞bxpc-3裸鼠移植瘤顯著地治療效果。

【附圖說明】

圖1是本發(fā)明光輝霉素納米顆粒懸浮液制備流程圖；

圖2是本發(fā)明光輝霉素納米顆粒形態(tài)電鏡觀察圖；

圖3是本發(fā)明光輝霉素納米顆粒體外藥物釋放檢測結(jié)果圖；

圖4是腫瘤細(xì)胞攝取本發(fā)明光輝霉素納米顆粒的激光共聚焦顯微鏡觀察圖；

圖5是腫瘤細(xì)胞攝取本發(fā)明光輝霉素納米顆粒的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果圖；

圖中：

5a-相對熒光強(qiáng)度-細(xì)胞數(shù)曲線圖；5b-時(shí)間-相對熒光強(qiáng)度柱狀圖。

圖6是采用srb法檢測光輝霉素(mit)和本發(fā)明光輝霉素納米顆粒(mit-np)抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用結(jié)果圖；

圖7是活體成像實(shí)驗(yàn)觀察本發(fā)明光輝霉素納米顆粒在裸鼠移植瘤模型中的體內(nèi)分布情況；

圖中：

7a-不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤小鼠的熒光圖像；

7b-注射168h后離體瘤塊以及多種器官(1-瘤塊；2-肝；3-心；4-肺；

5-胃；6-小腸；7-結(jié)腸；8-腎；9-胰腺；10-脾；11-股骨)的熒光圖像；

圖7a中bxpc-3欄右側(cè)標(biāo)尺自下而上的數(shù)值分別是1.0、1.2、1.4、1.6

(×10¹⁰)

圖7a中miapaca-2欄右側(cè)標(biāo)尺自下而上的數(shù)值分別是2.0、2.5、3.0、

3.5、4.0(×10¹⁰)

圖7b中bxpc-3欄右側(cè)標(biāo)尺自下而上的數(shù)值分別是4.0、4.5、5.0、5.5、

6.0、6.5、7.0(×10¹⁰)

圖7b中miapaca-2欄右側(cè)標(biāo)尺自下而上的數(shù)值分別是0.8、1.0、1.2、

1.4、1.6、1.8、2.0(×10¹⁰)；

圖8是本發(fā)明光輝霉素納米顆粒抑制人胰腺癌bxpc-3裸鼠移植瘤的生長情況；

圖中：

8a-移植瘤生長曲線圖；8b-荷瘤小鼠體重曲線圖。

圖9是本發(fā)明光輝霉素納米顆粒組(2mg/kg)和對照組裸鼠多種器官切片的h&e染色圖(胰腺、骨髓、脾、肝、肺、心、腎、小腸)。

圖10是免疫組化檢測腫瘤組織中ki-67表達(dá)狀況圖。

【具體實(shí)施方式】

通過下述實(shí)施例將能夠更好地理解本發(fā)明。

實(shí)施例1：制備光輝霉素納米顆粒懸浮液

利用乳化溶劑揮發(fā)法制備光輝霉素納米顆?；具^程參見附圖1。

該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下：

a、制備二嵌段共聚物溶液

將由濟(jì)南岱罡生物工程有限公司銷售的mpeg-plga二嵌段共聚物(peg分子量5000da；plga分子量15000da；乳酸與乙醇酸摩爾比：50/50)溶于乙酸乙酯溶劑中，得到濃度為30mg/ml的二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液；

b、制備光輝霉素有機(jī)相

按照以毫升計(jì)乙酸乙酯溶液與以毫克計(jì)光輝霉素的比1：2.2，把由sigma-aldrich公司以商品名mithramycin銷售的光輝霉素加到上述二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液中，振蕩溶解，得到一種含有光輝霉素的有機(jī)相；

c、制備乳化劑溶液

將泊洛沙姆188乳化劑溶于水中，得到濃度為以重量計(jì)2.0％的泊洛沙姆188乳化劑溶液；

d、混合

在使用由大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司以商品名手持式均質(zhì)機(jī)銷售的剪切力均質(zhì)機(jī)在5檔(22000rpm)條件下對步驟c制備的乳化劑溶液進(jìn)行均質(zhì)的條件下，滴加在步驟b得到的有機(jī)相，滴加結(jié)束后立即將混合液置于冰浴中，繼續(xù)使用由sonics&materials公司銷售的探頭超聲儀在30％振幅的條件下進(jìn)行超聲乳化2min；

e、后處理

步驟d得到的乳化液使用上海亞榮生化儀器廠銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在室溫下除去其中含有的有機(jī)溶劑；接著使用millipore公司截留分子量為30000da的超濾管除去其中含有的未包載游離藥物，使用雙蒸水對懸液進(jìn)行連續(xù)超濾清洗，然后通過0.22μm針頭濾器過濾，得到光輝霉素納米顆粒懸浮液。所述的光輝霉素納米顆粒懸浮液在溫度4℃下儲存。

按照本說明書描述的方法檢測了該實(shí)施例制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液的物理與化學(xué)性能。

在該實(shí)施例制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液中，光輝霉素納米顆粒的平均粒徑為27.3nm；多聚物分散性指數(shù)為0.252；表面電荷為-21.9mv。該光輝霉素納米顆粒的載藥量為1.83％；包封率為36.68％；在透析管中，在100mlph7.4pbs溶液中，在溫度37℃與轉(zhuǎn)速150rpm的磁力攪拌下5天總釋放率為59.4％。

實(shí)施例2：制備光輝霉素納米顆粒懸浮液

該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下：

a、制備二嵌段共聚物溶液

將由濟(jì)南岱罡生物工程有限公司銷售的peg-plla二嵌段共聚物(peg分子量3000da；plla分子量15000da)溶于二氯甲烷溶劑中，得到濃度為40mg/ml的二嵌段共聚物二氯甲烷溶液；

b、制備光輝霉素有機(jī)相

按照以毫升計(jì)二氯甲烷溶液與以毫克計(jì)光輝霉素sk的比1：1.0，把由.由文獻(xiàn)jamchemsoc.2003may14；125(19):5745-53報(bào)道的光輝霉素sk加到上述二嵌段共聚物二氯甲烷溶液中，振蕩溶解，得到一種含有光輝霉素sk的有機(jī)相；

c、制備乳化劑溶液

將乳化劑pva溶于水中，得到濃度為以重量計(jì)5％的pva乳化劑溶液；

d、混合

在使用由大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司以商品名手持式均質(zhì)機(jī)銷售的剪切力均質(zhì)機(jī)在6檔(30000rpm)條件下對步驟c制備的乳化劑溶液進(jìn)行均質(zhì)的條件下，滴加在步驟b得到的有機(jī)相，滴加結(jié)束后立即將混合液置于冰浴中，繼續(xù)使用由sonics&materials公司銷售的探頭超聲儀在50％振幅的條件下進(jìn)行超聲乳化4min；

e、后處理

步驟d得到的乳化液使用上海亞榮生化儀器廠銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在室溫下除去其中含有的有機(jī)溶劑；接著使用millipore公司截留分子量為30000da的超濾管除去其中含有的未包載游離藥物，使用雙蒸水對懸液進(jìn)行連續(xù)超濾清洗，然后通過0.22μm針頭濾器過濾，得到光輝霉素納米顆粒懸浮液。所述的光輝霉素納米顆粒懸浮液在溫度4℃下儲存。

按照本說明書描述的方法檢測了該實(shí)施例制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液的物理與化學(xué)性能。

在該實(shí)施例制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液中，光輝霉素納米顆粒的平均粒徑為20.4nm；多聚物分散性指數(shù)為0.282；表面電荷為-15.0mv。該光輝霉素納米顆粒的載藥量為1.60％；包封率為33.08％；在透析管中，在100mlph7.4pbs溶液中，在溫度37℃與轉(zhuǎn)速150rpm的磁力攪拌下5天總釋放率為63.9％。

實(shí)施例3：制備光輝霉素納米顆粒懸浮液

該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下：

a、制備二嵌段共聚物溶液

將由濟(jì)南岱罡生物工程有限公司銷售的peg-pdla二嵌段共聚物(peg分子量5000da；pdla分子量20000da)溶于三氯甲烷溶劑中，得到濃度為34mg/ml的二嵌段共聚物三氯甲烷溶液；

b、制備光輝霉素有機(jī)相

按照以毫升計(jì)三氯甲烷溶液與以毫克計(jì)光輝霉素sdk的比1：1.6，把由文獻(xiàn)jamchemsoc.2003may14；125(19):5745-53報(bào)道的光輝霉素sdk加到上述二嵌段共聚物三氯甲烷溶液中，振蕩溶解，得到一種含有光輝霉素sdk的有機(jī)相；

c、制備乳化劑溶液

將乳化劑膽酸鈉溶于水中，得到濃度為以重量計(jì)1.0％的膽酸鈉乳化劑溶液；

d、混合

在使用由大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司以商品名手持式均質(zhì)機(jī)銷售的剪切力均質(zhì)機(jī)在4檔(18000rpm)條件下對步驟c制備的乳化劑溶液進(jìn)行均質(zhì)的條件下，滴加在步驟b得到的有機(jī)相，滴加結(jié)束后立即將混合液置于冰浴中，繼續(xù)使用由.sonics&materials公司銷售的探頭超聲儀在36％振幅的條件下進(jìn)行超聲乳化6min；

e、后處理

步驟d得到的乳化液使用上海亞榮生化儀器廠銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在室溫下除去其中含有的有機(jī)溶劑；接著使用millipore公司截留分子量為30000da的超濾管除去其中含有的未包載游離藥物，使用雙蒸水對懸液進(jìn)行連續(xù)超濾清洗，然后通過0.22μm針頭濾器過濾，得到光輝霉素納米顆粒懸浮液。所述的光輝霉素納米顆粒懸浮液在溫度4℃下儲存。

按照本說明書描述的方法檢測了該實(shí)施例制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液的物理與化學(xué)性能。

在該實(shí)施例制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液中，光輝霉素納米顆粒的平均粒徑為29.6nm；多聚物分散性指數(shù)為0.274；表面電荷為-24.2mv。該光輝霉素納米顆粒的載藥量為2.62％；包封率為25.88％；在透析管中，在100mlph7.4pbs溶液中，在溫度37℃與轉(zhuǎn)速150rpm的磁力攪拌下5天總釋放率為65.4％。

實(shí)施例4：制備光輝霉素納米顆粒懸浮液

該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下：

a、制備二嵌段共聚物溶液

將濟(jì)南岱罡生物工程有限公司公司銷售的peg-pcl二嵌段共聚物(peg分子量5000da；pcl分子量10000da)溶于乙醚溶劑中，得到濃度為38mg/ml的二嵌段共聚物乙醚溶液；

b、制備光輝霉素有機(jī)相

按照以毫升計(jì)乙醚溶液與以毫克計(jì)光輝霉素ec-8042的比1：3.0，把由clincancerres.2016aug15；22(16):4105-18報(bào)道的光輝霉素ec-8042加到上述二嵌段共聚物乙醚溶液中，振蕩溶解，得到一種含有光輝霉素的有機(jī)相；

c、制備乳化劑溶液

將聚乙烯馬來酸酐乳化劑溶于水中，得到濃度為以重量計(jì)3.5％聚乙烯馬來酸酐乳化劑溶液；

d、混合

在使用由大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司以商品名手持式均質(zhì)機(jī)銷售的剪切力均質(zhì)機(jī)在5檔(22000rpm)條件下對步驟c制備的乳化劑溶液進(jìn)行均質(zhì)的條件下，滴加在步驟b得到的有機(jī)相，滴加結(jié)束后立即將混合液置于冰浴中，繼續(xù)使用由sonics&materials公司以商品名探頭超聲儀銷售的探頭超聲儀在在42％振幅的條件下進(jìn)行超聲乳化4min；

e、后處理

步驟d得到的乳化液使用由上海亞榮生化儀器廠以商品名旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器銷售的真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫下除去其中含有的有機(jī)溶劑；接著使用millipore公司截留分子量為30000da的超濾管除去其中含有的未包載游離藥物，使用雙蒸水對懸液進(jìn)行連續(xù)超濾清洗，然后通過0.22μm針頭濾器過濾，得到光輝霉素納米顆粒懸浮液。所述的光輝霉素納米顆粒懸浮液在溫度4℃下儲存。

按照本說明書描述的方法檢測了該實(shí)施例制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液的物理與化學(xué)性能。

在該實(shí)施例制備的光輝霉素納米顆粒懸浮液中，光輝霉素納米顆粒的平均粒徑為25.0nm；多聚物分散性指數(shù)為0.259；表面電荷為-17.3mv。該光輝霉素納米顆粒的載藥量為1.86％；包封率為22.28％；在透析管中，在100mlph7.4pbs溶液中，在溫度37℃與轉(zhuǎn)速150rpm的磁力攪拌下5天總釋放率為60.9％。

試驗(yàn)實(shí)施例1：本發(fā)明光輝霉素納米顆粒的體外細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)

i、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取光輝霉素納米顆粒的能力

采取激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞在體外對熒光染料cy5標(biāo)記的光輝霉素納米顆粒的內(nèi)吞過程。其步驟如下：將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞系bxpc-3和miapaca-2細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整其濃度，按每孔2×10⁴細(xì)胞的密度接種于8孔腔室蓋玻片(thermofisher公司)。在溫度37℃下培養(yǎng)24h，吸棄培養(yǎng)基，并加入300μl用培養(yǎng)基稀釋的本發(fā)明光輝霉素納米顆粒(1mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-2h時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用pbs潤洗3次，每次5min。再加入dii(細(xì)胞膜紅色熒光探針，碧云天生物技術(shù)研究所)于室溫下避光處理15min，再用pbs潤洗3次，每次5min。使用以重量計(jì)4％多聚甲醛固定30min，用pbs潤洗3次，每次5min，接著加入包含dapi的抗淬滅封片劑。使用激光共聚焦顯微鏡觀察。其觀察結(jié)果表明，bxpc-3和miapaca-2細(xì)胞均能快速攝取本方法制備的光輝霉素納米顆粒(參見附圖4)。

ii、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞攝取本發(fā)明光輝霉素納米顆粒的能力

取對數(shù)生長期的bxpc-3和miapaca-2細(xì)胞，消化并計(jì)數(shù)，配制成單細(xì)胞懸液，以每孔3×10⁵細(xì)胞加入6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約70％。吸棄培養(yǎng)基，加入2ml包含1mg/mlcy5標(biāo)記光輝霉素納米顆粒的新鮮培養(yǎng)基。避光處理0.25-2h，再使用胰酶消化并收集，用pbs洗3次。然后使用facscalibur流式細(xì)胞儀檢測。檢測結(jié)果顯示，處理15min后本發(fā)明光輝霉素納米顆粒即可進(jìn)入細(xì)胞，隨時(shí)間延長細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度快速增加，說明腫瘤細(xì)胞能快速攝取納米顆粒(參見附圖5)。

試驗(yàn)實(shí)施例2：本發(fā)明光輝霉素納米顆粒對腫瘤細(xì)胞的體外抑制活性

采用srb法檢測光輝霉素及其納米顆粒在體外對于腫瘤細(xì)胞的抑制作用。其步驟如下：取對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞系bxpc-3、miapaca-2、aspc-1和panc-1細(xì)胞，胰酶消化并計(jì)數(shù)，以3000-7000/孔接種于96孔板中，于溫度37℃下培養(yǎng)24h。然后，加入不同濃度的光輝霉素和本發(fā)明光輝霉素納米顆粒，每個藥物濃度設(shè)置5個平行孔。于溫度37℃下孵育24-72h，吸棄培養(yǎng)基并加入100μl濃度為以重量計(jì)10％的三氯乙酸溶液。在溫度4℃固定1h，用蒸餾水沖洗5次，自然晾干。加入100μl濃度以重量計(jì)0.4％的srb溶液(含1％乙酸)，染色5min，用蒸餾水沖洗5次，自然晾干。最后，每孔加入100μl10mmtris溶液(ph10.5)溶解結(jié)合的srb，使用酶標(biāo)儀測量570nm的吸光度值。

按照下述公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：

細(xì)胞存活率＝(加藥組a570值-空白組a570值)/(對照組a570值-空白組a570值)×100％

式中：

加藥組a570值表示測量加藥組的570nm吸光度值；

對照組a570值表示測量對照組的570nm吸光度值；

空白組a570值表示測量空白組的570nm吸光度值；

這些試驗(yàn)結(jié)果顯示，光輝霉素和本發(fā)明光輝霉素納米顆粒對于4種腫瘤細(xì)胞均具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性的抑制作用(參見附圖6)。而且對比同等藥物劑量的光輝霉素和本發(fā)明光輝霉素納米顆粒對細(xì)胞存活率的影響可以看出兩者的抑制作用并無明顯差別，表明納米顆粒制備過程并未影響光輝霉素的腫瘤抑制活性。

試驗(yàn)實(shí)施例3：cy5標(biāo)記的光輝霉素納米顆粒在活體中靶向腫瘤組織的能力

將人胰腺癌bxpc-3和miapaca-2細(xì)胞以1×10⁷/只皮下接種至balb/c裸鼠右側(cè)腋下。當(dāng)腫瘤體積至300-400mm³，將cy5標(biāo)記的納米顆粒通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)。利用ivis活體成像系統(tǒng)(perkinelmer公司)進(jìn)行觀察。于不同時(shí)間點(diǎn)，采用醫(yī)用麻醉劑異氟烷進(jìn)行處理，然后觀測荷瘤小鼠體內(nèi)光輝霉素納米顆粒靶向腫瘤組織的情況。

附圖7顯示，本發(fā)明制備的光輝霉素納米顆粒能較好地靶向bxpc-3和miapaca-2裸鼠移植瘤部位。從注射后2h，腫瘤部位即出現(xiàn)應(yīng)激信號，12h左右熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，其后逐漸減弱，直至168h在腫瘤部位仍有高于其他位置的熒光信號。于注射后168h將小鼠處死并分離出主要器官進(jìn)行熒光成像顯示，腫瘤組織具有明顯強(qiáng)于其他器官的熒光信號。因此，以上結(jié)果說明本發(fā)明所制備的光輝霉素納米顆粒能夠在腫瘤部位富集。

試驗(yàn)實(shí)施例4：本發(fā)明光輝霉素納米顆粒對裸鼠移植瘤bxpc-3的生長抑制作用

將處于對數(shù)生長期的bxpc-3細(xì)胞胰酶消化并計(jì)數(shù)，配制成1×10⁸/ml細(xì)胞懸液。取體重為18-20g的雌性balb/c裸鼠建立移植瘤模型，每只接種1×10⁷個細(xì)胞。待瘤塊達(dá)到約100mm³時(shí)，按照裸鼠的瘤體積進(jìn)行分組，每組6只。按照下述給藥方案處理：生理鹽水組，空白納米顆粒(未含藥物)組，光輝霉素組(1mg/kg)和光輝霉素納米顆粒組(1mg/kg和2mg/kg)。尾靜脈注射，每周一次，連續(xù)4周給藥。第一針給藥后，每4天對裸鼠體重和腫瘤體積進(jìn)行測量。根據(jù)公式v＝ab²/2計(jì)算腫瘤體積(a：腫瘤長徑，b：腫瘤短徑)。于接種腫瘤后29天，處死小鼠并解剖取出瘤塊、胰腺、股骨、脾、肝、肺、心、腎以及小腸。然后采用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，然后分別進(jìn)行蘇木精-伊紅(h&e)染色，以及對瘤組織進(jìn)行核增值抗原ki-67的免疫組化檢測。結(jié)果表明：光輝霉素對bxpc-3移植瘤生長的抑制能力較弱，抑制率為51％，而等劑量的本發(fā)明光輝霉素納米顆粒組(1mg/kg)的抑制率為86％(圖8)。同時(shí)，2mg/kg本發(fā)明光輝霉素納米顆粒組抑制率為96％，并未見小鼠主要臟器出現(xiàn)損傷(參見附圖9)。免疫組化結(jié)果顯示，本發(fā)明光輝霉素納米顆粒能夠降低瘤組織中核增值抗原ki-67的表達(dá)(參見附圖10)。