本發(fā)明涉及高分子藥物領(lǐng)域,尤其涉及一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性聚合物藥物載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
兩親性嵌段聚合物可在水溶液中自組裝成膠束,并已被廣泛應(yīng)用于包封疏水性抗癌藥物。與小分子抗癌藥相比,聚合物載藥膠束能夠改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和提高藥物在腫瘤部位的富集從而顯著提高藥物的生物利用度,減少毒副作用。具有生物相容性的可降解聚合物膠束在藥物運(yùn)載方面取得了巨大的成功,有些已被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用或者正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。例如,相比于溶劑型紫杉醇(ptx),genexol-pm(聚乙二醇-b-聚d,l-丙交酯)(peg-pdlla)聚合物負(fù)載的ptx制劑顯示出了更好的療效和較低的毒性,在韓國(guó)已被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌。此外,還有其他的兩親性嵌段聚合物膠束正在臨床試驗(yàn)中,如nk105,nk911,nk012,sp1049c,bind014。
然而,另一方面,聚合物膠束的血液長(zhǎng)循環(huán)和較高的腫瘤富集(例如peg-覆蓋的表面)也阻礙了腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞作用。這對(duì)于大多數(shù)需要被細(xì)胞內(nèi)吞才能起作用的抗癌藥物來(lái)講是個(gè)不利的方面。為了解決這個(gè)問(wèn)題,各種響應(yīng)性的智能聚合物藥物遞送系統(tǒng)被設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)一步提高療效,但目前為止進(jìn)入臨床階段的聚合物藥物遞送系統(tǒng)仍然十分稀少。聚合物本身復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和未知的系統(tǒng)毒性限制了其進(jìn)一步的臨床化。因此,提供一種毒性小,易得且療效好的聚合物藥物是目前需要解決的技術(shù)問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
有鑒于此,本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供了一種基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)響應(yīng)性聚合物藥物載體及其制備方法和應(yīng)用,本發(fā)明提供的聚合物藥物載體不僅易得,而且擔(dān)載藥物后得到的聚合物藥物療效高且毒性小。
本發(fā)明提供了一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性高分子藥物載體,具有式(i)所示結(jié)構(gòu),
其中,m為40~230,n為30~120;
所述pep的氨基酸序列為gplgvrgdg或gplgvrg。
優(yōu)選的,所述m為80~150。
優(yōu)選的,所述n為50~100。
本發(fā)明還提供了一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)性高分子藥物載體的制備方法,包括:
1)將peg-n3與alkynyl-pep反應(yīng),得到末端為氨基的peg-pep,
所述pep的氨基酸序列為gplgvrgdg或gplgvrg;
2)將末端為氨基的peg-pep與d,l-丙交酯反應(yīng),得到具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體;
其中,m為40~230,n為30~120。
優(yōu)選的,所述步驟1)反應(yīng)的催化劑為溴化亞銅和n,n,n′,n,′n″-五甲基二亞乙基三胺(pmdeta)。
優(yōu)選的,所述步驟2)反應(yīng)的催化劑為辛酸亞錫、乙酸亞錫、二氧化鈦和氯化鋁中的一種或幾種。
本發(fā)明還提供了一種高分子藥物,包括高分子藥物載體和抗腫瘤藥物;
其中,所述高分子藥物載體為本發(fā)明所述的高分子藥物載體。
優(yōu)選的,所述抗腫瘤藥物為紫杉醇、喜樹(shù)堿、順鉑、氮芥和阿霉素中的一種或幾種。
本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明所述的高分子藥物的制備方法,包括:
將本發(fā)明所述的高分子藥物載體、抗腫瘤藥物、溶劑和緩沖溶液反應(yīng),得到高分子藥物。
優(yōu)選的,所述緩沖溶液為ph為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(pbs)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明提供了一種具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體,本發(fā)明提供的聚合物藥物載體用于擔(dān)載藥物,得到的高分子藥物能夠增加腫瘤藥物對(duì)于藥物的內(nèi)吞,提高藥效,而且生物安全性較高;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本發(fā)明提供的高分子藥物與現(xiàn)有的該分子藥物相比,療效提高了16倍;且藥物安全。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明所述的聚合物載體的合成路線圖;
圖2為實(shí)施例制備得到的peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的gpc圖;
圖3為peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的1hnmr圖;
圖4為以芘作為熒光探針,高分子藥物濃度與其在激發(fā)光光譜中波長(zhǎng)在339nm和332nm處的強(qiáng)度的比值(i339/i332)的相關(guān)圖;
圖5為本發(fā)明提供的聚合物藥物的粒子尺寸表征結(jié)果;
圖6為用1μg/ml的mmp-2和p1共同培養(yǎng)不同時(shí)間的凝膠滲透色譜(gpc)結(jié)果;
圖7為p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子與mmp-2分別共同培養(yǎng)后的peg釋放結(jié)果;
圖8為在mmp-2的存在下p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子的大小的變化圖;
圖9為mmp-2處理之前和之后的p1納米粒子的透射電子顯微鏡(tem)圖像;
圖10為mmp-2不存在下的ptx釋放曲線;
圖11為mmp-2存在下的ptx釋放曲線;
圖12為4t1細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果;
圖13為本發(fā)明所述的高分子藥物的激光共聚焦顯微鏡(clsm)圖像;
圖14為空白膠束的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果;
圖15為在不同ptx濃度的不同高分子藥物的細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià);
圖16為靜脈注射ptx負(fù)載的p1,p2或p3后,在血液中與ptx含量在不同時(shí)間下的變化;
圖17為12和24小時(shí)靜脈注射后ptx在主要器官和腫瘤內(nèi)的定量分析結(jié)果;
圖18為負(fù)載1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanineiodide(dir)熒光分子的納米粒子靜脈注射后在體內(nèi)生物分布圖;
圖19為靜脈注射ptx負(fù)載的納米粒子和小分子ptx后腫瘤大小的變化結(jié)果;
圖20為在第24天從不同處理組收集的典型腫瘤的照片;
圖21為腫瘤切片的蘇木精-伊紅(h&e)染色的結(jié)果和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶染色(tunel)熒光圖像;
圖22為小鼠體重變化;
圖23為心臟,肝,脾,肺,腎h&e染色,分別對(duì)應(yīng)于pbs,ptx,p1,p2和p3的靜脈注射。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種高分子藥物載體,具有式(i)所示結(jié)構(gòu),
其中,m為40~230,n為30~120;
所述pep的氨基酸序列為gplgvrgdg(甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-甘氨酸)或gplgvrg(甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-精氨酸-甘氨酸)。
按照本發(fā)明,所述pep的氨基酸序列為gplgvrg或gplgvrgdg;所述m優(yōu)選為80~150,更優(yōu)選為100~140,最優(yōu)選為110~130,最優(yōu)選為113~120;所述n優(yōu)選為50~110,更優(yōu)選為60~100。
本發(fā)明還提供了一種高分子藥物載體的制備方法,包括:
1)將端基疊氮化化的聚乙二醇與炔基功能化的多肽反應(yīng),得到末端為氨基的peg-pep;
所述pep的氨基酸序列為gplgvrgdg或gplgvrg;
2)將末端為氨基的peg-pep與d,l-丙交酯反應(yīng),得到具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體;
其中,m為40~230,n為30~120。
按照本發(fā)明,本發(fā)明還將端基疊氮化化的聚乙二醇(peg-n3)與炔基功能化的多肽(alkynyl-pep,其中炔基連接在初始的甘氨酸上)反應(yīng),得到末端為氨基的peg-pep,;本發(fā)明對(duì)反應(yīng)的條件沒(méi)有特殊要求,本領(lǐng)域公知的方法均可;其中,所述反應(yīng)的催化劑優(yōu)選為溴化亞銅和n,n,n′,n,′n″-五甲基二亞乙基三胺(pmdeta);所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為dmf;所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為30~60℃;更優(yōu)選為40~50℃;此外,本發(fā)明中,pep的氨基酸序列為gplgvrgdg或gplgvrg。
本發(fā)明還將末端為氨基的peg-pep與d,l-丙交酯反應(yīng),得到具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體;其中,所述反應(yīng)的催化劑優(yōu)選為辛酸亞錫;所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為四氫呋喃;所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為60~100℃,更優(yōu)選為80~90℃。
本發(fā)明還提供了一種高分子藥物,包括高分子藥物載體和抗腫瘤藥物;
其中,所述高分子藥物載體為本發(fā)明所述的高分子藥物載體;所述抗腫瘤藥物優(yōu)選為紫杉醇、喜樹(shù)堿、疏水性鉑類(lèi)藥物、氮芥和阿霉素中的一種或幾種;更優(yōu)選為紫杉醇。
本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明所述的高分子藥物的制備方法,包括:
將本發(fā)明所述的高分子藥物載體、抗腫瘤藥物、溶劑和緩沖溶液反應(yīng),得到高分子藥物。其中,所述緩沖溶液為ph為7.4的磷酸鹽緩沖溶液;所述溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯;所述反應(yīng)優(yōu)選為超聲反應(yīng);所述超聲的功率優(yōu)選為90~120w;所述超聲的時(shí)間優(yōu)選為60~100秒。
本發(fā)明提供了一種具有式(i)所示結(jié)構(gòu)的高分子藥物載體,本發(fā)明提供的聚合物藥物載體用于擔(dān)載藥物,得到的高分子藥物能夠在mmp高表達(dá)的腫瘤組織中增加腫瘤藥物對(duì)于藥物的內(nèi)吞,提高藥效,而且生物安全性較高,具有很好的應(yīng)用前景。
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例?;诒景l(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例,都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例中式(i)化合物用縮寫(xiě)peg-pep-pdlla表示。
實(shí)施例
一、高分子藥物的制備及表征
1)聚合物載體的制備方法
peg-gplgvrgdg-nh2的制備
將peg-n3(0.3g,0.06mmol),alkynyl-pep(0.062g,0.072mmol),dmf(3ml)和pmdeta(31mg,0.18mmol)一起至于5ml的封管中,冷凍-循環(huán)抽氣三次后在氮?dú)獾谋Wo(hù)下加入溴化亞銅(26mg,0.18mmol),再次冷凍-循環(huán)抽氣兩次,在真空下封住,置于40℃下反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完成后將反應(yīng)物加入50ml乙醚中沉淀,得到的產(chǎn)物干燥后溶解在去離子水中,加入到分子量為3500的透析膜內(nèi),在流動(dòng)的去離子水中透析24小時(shí)。凍干后得到白色粉末狀產(chǎn)物,即為peg-gplgvrgdg-nh2;產(chǎn)量為0.22g,產(chǎn)率為62.7%。
將peg-gplgvrgdg-nh2引發(fā)劑溶解在約0.5ml的ch2cl2中,然后加入過(guò)量的苯。凍干后得到無(wú)水白色粉末。然后,凍干的peg-gplgvrgdg-nh2(0.117g,0.02mmol),d,l-丙交酯(0.288g,2mmol),辛酸亞錫(30μl,10mg/ml苯溶液)溶于1ml無(wú)水四氫呋喃和4ml無(wú)水苯中,加入10ml封管中,凍干后加入4ml無(wú)水四氫呋喃,封住封管,在80℃下反應(yīng)18小時(shí)。然后將得到的聚合物沉淀到50ml冷乙醚中。產(chǎn)品通過(guò)離心收集。重復(fù)上述溶解-沉淀循環(huán)兩次。將最終產(chǎn)物干燥,得到白色固體粉末,即為聚合物載體peg-gplgvrgdg-pdlla,產(chǎn)量為0.26g,產(chǎn)率為64%。
同樣,用類(lèi)似的合成方法合成peg-gplgvrg-pdlla和peg-pdlla聚合物載體。
聚合物載體的具體制備方法見(jiàn)圖1,圖1為本發(fā)明所述的聚合物載體的合成路線圖。
對(duì)得到的聚合物載體進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖2~圖3,圖2為實(shí)施例制備得到的peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的gpc圖;圖3為peg-gplgvrgdg-nh2和peg-gplgvrgdg-pdlla的1hnmr圖。
2)高分子藥物(載藥膠束)的制備
將peg-gplgvrgdg-pdlla(10mg)和紫杉醇(1mg)溶解在乙酸乙酯(0.2ml)中,然后加入磷酸鹽緩沖溶液(ph7.4)1ml,在90w的功率下超聲乳化60秒,減壓出去有機(jī)溶劑,在離心除去未包埋的紫杉醇后得到載藥的納米粒子,即高分子藥物(又稱(chēng)p1納米粒子或p1)。
同樣,用類(lèi)似的合成方法在peg-gplgvrg-pdlla和peg-pdlla上擔(dān)載紫杉醇,分別得到高分子藥物p2和p3。此外,尼羅紅和dir包埋的納米粒子(高分子藥物)的制備是通過(guò)將上述ptx換成相應(yīng)的分子實(shí)現(xiàn)的。
通過(guò)以芘作為熒光探針,溶液中芘的濃度為1×10-7m,熒光測(cè)試的發(fā)射波長(zhǎng)為475nm,測(cè)試高分子藥物在339nm和332nm激發(fā)光強(qiáng)度的比值對(duì)聚合物濃度作圖,結(jié)果見(jiàn)圖4,圖4為以芘作為熒光探針,高分子藥物濃度與其在激發(fā)光光譜中波長(zhǎng)在339nm和332nm處的強(qiáng)度的比值(i339/i332)的相關(guān)圖;從同種可以看出,本發(fā)明所述的高分子藥物的臨界膠束濃度分別為2.1×10-3mg/ml(p1).2.5×10-3mg/ml(p2)和3.3×10-3mg/ml(p3)。
通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射表征聚合物藥物,結(jié)果見(jiàn)圖5,圖5為本發(fā)明提供的聚合物藥物的粒子尺寸表征結(jié)果;從圖中可以看出,本發(fā)明得到的納米粒子的平均粒徑均為80nm左右,該尺寸便于納米粒子在腫瘤組織部位富集。而且測(cè)得p1,p2和p3納米粒子的載藥率和包封率都是差不多的。這說(shuō)明在嵌段聚合物中間引入多肽的序列后對(duì)于聚合物藥物的相關(guān)性質(zhì)沒(méi)有產(chǎn)生大的影響。
3)聚合物藥物對(duì)于mmp-2的響應(yīng)性評(píng)估。
本發(fā)明所用的多肽(gplgvrgdg)已經(jīng)證實(shí)會(huì)被活化的mmp-2在g和v之間的位點(diǎn)被切斷。將p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子分別和mmp-2共培養(yǎng)不同時(shí)間后,進(jìn)行了gpc表征,結(jié)果見(jiàn)圖6~圖7,圖6為用1μg/ml的mmp-2和p1共同培養(yǎng)不同時(shí)間的凝膠滲透色譜(gpc)結(jié)果;圖7為p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子與mmp-2分別共同培養(yǎng)后的peg釋放結(jié)果;從圖6可以看出,培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)后gpc曲線顯示一個(gè)新的肩峰,位于16.08分鐘,這對(duì)應(yīng)于peg峰。這一結(jié)果證明了mmp-2導(dǎo)致peg的從納米粒子的去除。隨著mmp-2處理時(shí)間的增加,肩峰變得越來(lái)越強(qiáng),且從圖7可以看出超過(guò)70%peg在8個(gè)小時(shí)內(nèi)脫離,最后,大約20%peg仍然在納米粒子表面上。
在mmp-2培養(yǎng)的同時(shí),我們也采用動(dòng)態(tài)光散射(dls)來(lái)研究納米粒子的尺寸變化,結(jié)果見(jiàn)圖8~圖9,圖8為在mmp-2的存在下p1納米粒子、p2納米粒子、p3納米粒子的大小的變化圖;圖9為mmp-2處理之前和之后的p1納米粒子的透射電子顯微鏡(tem)圖像;從圖8中可以看出,納米粒子尺寸在24小時(shí)內(nèi)沒(méi)有顯著的變化;tem測(cè)量進(jìn)一步證實(shí),如圖9所示,除了極少數(shù)相對(duì)大的顆粒外,去peg化后的納米粒子依然保持著較為均一的尺寸。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)閙mp-2培養(yǎng)24小時(shí)仍然有20%peg留在納米粒子的表面上足以穩(wěn)定納米粒子。對(duì)照組p2也顯示出peg的脫離,而p3沒(méi)有對(duì)mmp-2的響應(yīng)性(圖7)。上述結(jié)果表明,mmp-2能夠有效地切斷肽鍵,但不會(huì)導(dǎo)致顯著的聚集??梢酝茰y(cè),殘留的肽vrgdg是保留在納米粒子的表面的,這對(duì)于腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞具有極大的優(yōu)勢(shì)。
此外,為了評(píng)估m(xù)mp-2的存在對(duì)于藥物釋放的影響,我們研究了在mmp-2存在和不存在下ptx的釋放行為。如圖10和圖11,圖10為mmp-2不存在下的ptx釋放曲線;圖11為mmp-2存在下的ptx釋放曲線;從圖中可以看出,負(fù)載ptx的p1,p2,和p3無(wú)論有沒(méi)有mmp-2的存在都表現(xiàn)出類(lèi)似的釋放行為,在72小時(shí)內(nèi)約80%的ptx釋放。
4)微弱的尺寸變化和有效mmp-2導(dǎo)致的peg脫離有可能促進(jìn)細(xì)胞攝取。此外,殘留的肽vrgdg殘留在納米粒子表面上能夠作為一種靶向配體,進(jìn)一步促進(jìn)納米粒子和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用。為了研究在mmp-2存下納米粒子的細(xì)胞攝取行為,等量的負(fù)載尼羅紅的納米粒子和4t1細(xì)胞在mmp-2存在下共培養(yǎng)。然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量以研究納米粒子的內(nèi)吞。結(jié)果見(jiàn)圖12~圖13,圖12為4t1細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果;圖13為本發(fā)明所述的高分子藥物的激光共聚焦顯微鏡(clsm)圖像;從圖12中可以看出,p1的納米粒子相比p3的納米粒子表現(xiàn)出幾乎高三倍的細(xì)胞攝取,而p2的納米粒子僅表現(xiàn)出1.2倍攝取增加,在mmp-2作用下,p2的納米粒子雖然顯示出去聚乙二醇化而p1的納米粒子不僅表現(xiàn)出去聚乙二醇化,而且rgd殘基被留下納米粒子的表面上。因此,p1的納米粒子顯示的最高的細(xì)胞攝取。此外,從圖13可以看出,相比于p2和p3納米粒子,p1納米粒子顯著更強(qiáng)尼羅紅的熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出更有效的細(xì)胞內(nèi)化,因此,mmp-2導(dǎo)致的peg去除和p1納米粒子表面上殘余的vrgdg肽協(xié)同促進(jìn)了細(xì)胞攝取。
5)有效的細(xì)胞攝取對(duì)抗癌藥物療效提高具有關(guān)鍵作用。通過(guò)mtt法,測(cè)定了不同的藥物治療后4t1細(xì)胞的細(xì)胞活性。具體方法如下:
將4t1細(xì)胞以在1×104/孔的密度種在96孔板中,含有fbs(10%)dmem培養(yǎng)基100μl,在37℃下,co2氣氛中(5%)培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。然后,用100μl新鮮培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基,空白或負(fù)載ptx的納米粒子以不同的濃度加入,并加入酶活化劑apma活化的mmp-2,培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)后將培養(yǎng)基完全吸出,加入100μl新鮮培養(yǎng)基,再通過(guò)另外48小時(shí)的培養(yǎng)。細(xì)胞活性通過(guò)3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide(mtt)測(cè)定。20μlmtt溶液(5mg/mlpbs溶液)加入到每個(gè)孔中并培養(yǎng)在37℃下在黑暗放置4小時(shí)。再吸取培養(yǎng)基加入dmso(200μl)放置30分鐘使得所形成的紫色甲臜晶體溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)量在490nm處的吸光度。半數(shù)最大抑制濃度(ic50)值根據(jù)mtt結(jié)果的通過(guò)graphpadprism軟件計(jì)算。
結(jié)果見(jiàn)圖14~圖15,圖14為空白膠束的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果;圖15為在不同ptx濃度的不同高分子藥物的細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià),其中,*p<0.05。從圖14可以看出,在mmp-2的存在下,空白的納米粒子即使在相當(dāng)高的濃度下也幾乎沒(méi)有顯示出毒性,表明這些嵌段共聚物良好的生物相容性。從圖15可以看出,相比負(fù)載ptx的p2和p3的納米粒子以及小分子ptx,負(fù)載ptx的p1納米粒子表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。負(fù)載ptx的p1半抑制濃度(ic50)值是85ng/ml,小分子ptx為(147ng/ml),負(fù)載ptx的p2納米粒子(560ng/ml),或p3納米粒子(1080ng/ml)。
二、藥代動(dòng)力學(xué)的評(píng)價(jià)
高分子藥物的藥代動(dòng)力學(xué)在雌性6周齡的cd-1(icr)小鼠體內(nèi)進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體的:
雌性6周齡cd-1(icr)小鼠隨機(jī)分成三組(n=3)。ptx負(fù)載的p1,p2,或p3納米粒子通過(guò)尾靜脈注射,ptx劑量為10mg/kg。在不同的時(shí)間間隔,從小鼠眶收集100μl血液樣品裝入肝素化的試管中并加入10ml乙酸乙酯。隨后在10000×g下離心5分鐘,分離有機(jī)溶劑并在n2下干燥。通過(guò)反相高效液相色譜(rp-hplc)測(cè)定紫杉醇的含量,(流動(dòng)相為:乙腈/h2o(3∶7v/v),流速1ml/min,uv-vis檢測(cè)波長(zhǎng)固定在217nm)。
結(jié)果如圖16所示,圖16為靜脈注射ptx負(fù)載的p1,p2或p3后,在血液中與ptx含量在不同時(shí)間下的變化;從圖16可以看出,靜脈注射后,負(fù)載ptx的p1,p2和p3的納米粒子顯示了類(lèi)似的相對(duì)較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間。p1,p2和p3的半衰期t1/2分別為3.36h,4.82h和3.92h。長(zhǎng)血液循環(huán)能夠提高腫瘤位置抗癌藥物的富集。
三、h22小鼠腫瘤模型的構(gòu)建
考慮到mmp酶在各種腫瘤的發(fā)展過(guò)程中的重要性,我們選擇雌性cd-1(icr)小鼠的h22腫瘤模型進(jìn)行抗腫瘤效果的研究。為了定量ptx量在腫瘤部位和主要器官的分布,靜脈注射不同的藥物制劑后,腫瘤組織和主要器官內(nèi)ptx被萃取出來(lái),用hplc系統(tǒng)進(jìn)行分析。具體的,懸浮于200μlpbs中的h22細(xì)胞(3×106)通過(guò)皮下注射到雌性6周齡cd-1(icr)小鼠的右下肢腋窩。使用數(shù)字游標(biāo)卡尺監(jiān)測(cè)腫瘤的大小,而且腫瘤體積(v)從方程v=a×b2/2計(jì)算,其中a和b分別表示腫瘤的最長(zhǎng)和最短直徑。
此外,h22荷瘤小鼠用于研究的納米粒子的體內(nèi)分布。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100mm3時(shí),dir負(fù)載的p1,p2或p3納米粒子通過(guò)靜脈注射,劑量為1mg/kg。在不同的時(shí)間間隔(1,12,24,48和72小時(shí)),將小鼠麻醉并用ivis小動(dòng)物成像系統(tǒng)來(lái)獲取圖像。
結(jié)果見(jiàn)圖17和圖18,圖17為12和24小時(shí)靜脈注射后ptx在主要器官和腫瘤內(nèi)的定量分析結(jié)果;圖18為負(fù)載dir熒光分子的納米粒子靜脈注射后在體內(nèi)生物分布圖;從圖17可以看出,在24個(gè)小時(shí)腫瘤部位p1納米粒子的藥物富集顯著得到加強(qiáng),比p2的納米粒子增加1.47倍,p3納米粒子2.01倍(*p<0.05),而藥物在主要器官的分布顯示沒(méi)有顯著的差別。為了能夠看到體內(nèi)納米粒子的情況,疏水性的近紅外熒光發(fā)射染料(dir)被包埋到的納米粒子內(nèi)進(jìn)行從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控。如圖18所示,從圖18可以看出,三個(gè)dir負(fù)載的納米粒子的靜脈注射1個(gè)小時(shí)后,腫瘤位置表現(xiàn)出明顯的dir的熒光,24個(gè)小時(shí)達(dá)到最大值。而且,對(duì)于dir負(fù)載的p1納米粒子在48小時(shí)顯示出稍強(qiáng)的熒光。
四、體內(nèi)的分布
同時(shí)使用h22荷瘤小鼠對(duì)負(fù)載ptx的納米粒子的療效進(jìn)行了評(píng)價(jià)。將25只小鼠分為5組,包括pbs,小分子ptx,ptx負(fù)載的p1,p2,和p3納米粒子。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至約100mm3時(shí),將不同的藥物制劑每?jī)商祆o脈注射一次,劑量為10mg/kg,總共三次注射。
為了量化ptx在主要器官和腫瘤的積累,靜脈注射10mg/kg劑量的ptx后,收集相應(yīng)的器官和腫瘤組織。然后將樣品用pbs洗滌,之后干燥稱(chēng)重,加入0.5毫升ch3cn,并在10000×g離心10分鐘,然后,將上清液進(jìn)一步用1mlchcl3萃取。將有機(jī)相在氮?dú)饬飨赂稍?,并將殘余物溶解?00μl甲醇中,通過(guò)rp-hplc確定ptx的量。
結(jié)果見(jiàn)圖19~圖20,圖19為靜脈注射ptx負(fù)載的納米粒子和小分子ptx后腫瘤大小的變化結(jié)果;數(shù)據(jù)表示為平均值±sd,n=5,*p<0.05。圖20為在第24天從不同處理組收集的典型腫瘤的照片。從圖19和圖20可以看出,24天后用pbs處理的腫瘤顯示出近40倍體積增加,小分子ptx為25倍,p3的納米粒子為16倍,p2的納米粒子為10倍。對(duì)比鮮明的是,負(fù)載ptx的p1納米粒子有效地抑制了腫瘤生長(zhǎng),腫瘤大小只是增加了1.9倍。
五、動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)
h22荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組(n=5)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100mm3時(shí),小分子ptx,負(fù)載ptx的p1,p2和p3納米粒子通過(guò)尾靜脈注射,ptx劑量為10mg/kg。每?jī)商熳⑸湟淮危踩巫⑸?。腫瘤大小通過(guò)使用數(shù)字游標(biāo)卡尺測(cè)量監(jiān)測(cè)。同時(shí),每?jī)商煊涗浺淮涡∈蟮捏w重。在治療(24天)結(jié)束后,所有的小鼠處死,并收集主要臟器(心臟,肝,脾,肺,腎)和腫瘤。記錄腫瘤的重量,然后將腫瘤和器官包埋在石蠟中,并制備5μm的石蠟切片。將切片用蘇木精和伊紅(h&e)進(jìn)行染色。此外,腫瘤切片進(jìn)一步用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dutp缺口末端標(biāo)記(tunel)測(cè)定試劑盒染色以鑒定凋亡細(xì)胞。
腫瘤切片用h&e和tunel進(jìn)行染色評(píng)價(jià)凋亡細(xì)胞。
結(jié)果見(jiàn)圖21~圖23,圖21為腫瘤切片的蘇木精-伊紅(h&e)染色的結(jié)果和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶染色(tunel)熒光圖像;圖22為的小鼠體重變化;圖23為心臟,肝,脾,肺,腎h&e染色,分別對(duì)應(yīng)于pbs,ptx,p1,p2和p3的靜脈注射;其中,白色箭頭指示肝臟損傷。從圖中可以看出,與ptx負(fù)載的p1納米粒子治療的腫瘤表現(xiàn)出最強(qiáng)的綠色熒光,這表明最多的細(xì)胞凋亡。h&e染色也證實(shí)了最顯著的療效是通過(guò)注射負(fù)載ptx的p1納米粒子實(shí)現(xiàn)的。此外,五組小鼠的體重在治療期間沒(méi)有顯著改變;而且,從圖13可以看出,器官的h&e染色的結(jié)果主要表現(xiàn)出小分子ptx導(dǎo)致的肝損傷,而負(fù)載ptx的納米粒子治療組無(wú)明顯器官損傷;這些結(jié)果顯示p1,p2和p3納米粒子的生物安全性較高。
以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾,這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。