一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架及其制備方法，屬于骨組織工程支架制備領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

骨損傷疾病是在臨床醫(yī)學(xué)中較為普遍的損傷。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，改善了傳統(tǒng)骨修復(fù)手段所存在的弊端。其中，支架材料在骨組織工程領(lǐng)域中具有相對重要的地位，利用三維支架為細(xì)胞的生長、繁殖和骨骼組織的修復(fù)提供了良好的根本和條件。單純的一種物質(zhì)并沒有辦法滿足組織工程對支架材料的需求，因此就需要將具有多元特性的不同材料進(jìn)行復(fù)合，通過將這些材料的特性進(jìn)行相互混合形成全新的、能夠滿足實際應(yīng)用的復(fù)合材料，這也是當(dāng)前支架材料研究中的熱點。

隨著組織工程領(lǐng)域的飛速發(fā)展，羥基磷灰石是現(xiàn)如今被認(rèn)為最具潛力和有醫(yī)學(xué)應(yīng)用可能性的骨組織代替材料，但由于缺乏抗疲勞性能與生物活性不足等因素，應(yīng)用有一定的限制。

絲素是一種源于蠶絲的天然高分子材料，隨著對其獨特氨基酸組成及結(jié)晶結(jié)構(gòu)等理化特性研究的深入，尤其是近年來蠶絲多用途開發(fā)向高新技術(shù)的滲透，國內(nèi)外對絲素的應(yīng)用正從傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域積極向化妝品、食品等領(lǐng)域擴(kuò)展，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的探索，如利用絲素蛋白來制造藥物緩釋劑、生物傳感器、隱形眼鏡及皮膚、血管等人工器官等，受到廣泛關(guān)注，已取得了一系列的基礎(chǔ)研究成果，顯示了巨大的應(yīng)用潛力，可是未見有將其用于骨支架的報道。

將絲素蛋白與羥基磷灰石機(jī)械混合形成的復(fù)合支架已有報道，但所用的絲素蛋白與羥基磷灰石機(jī)械混合形成的復(fù)合材料是通過粒濾、發(fā)泡、冷凍干燥等方法制備而成，該復(fù)合材料存在結(jié)構(gòu)單一，孔徑不均等技術(shù)問題，因此用該復(fù)合材料制備復(fù)合支架存在很大問題，包括支架形狀結(jié)構(gòu)難以控制、支架孔隙連通率低、造孔材料難以清除等。

而本發(fā)明首先由原位礦化過程在絲素蛋白分子上沉積羥基磷灰石獲得有機(jī)無機(jī)復(fù)合的均一粉體材料，接著利用三維打印技術(shù)有效成型該復(fù)合的均一粉體形成具有可定制形狀結(jié)構(gòu)的支架，從而滿足骨組織工程支架的要求。

綜上，三維打印技術(shù)可以通過改變切層的網(wǎng)格填充方式和孔隙大小來調(diào)節(jié)支架材料的孔隙率和孔結(jié)構(gòu)，制備出具有高孔隙率、較好的孔連通性，可控的力學(xué)性能的骨修復(fù)復(fù)合材料支架，從而有利于成骨誘導(dǎo)、分化，細(xì)胞黏附、遷移、增殖，創(chuàng)建適應(yīng)成骨相關(guān)細(xì)胞生長需要的微環(huán)境。

因此，與現(xiàn)有技術(shù)的同類產(chǎn)品進(jìn)行對比，本發(fā)明利用的三維打印技術(shù)能夠更好的滿足骨組織工程支架“一結(jié)構(gòu)，一支架”的要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是為了解決上述絲素蛋白與羥基磷灰石機(jī)械混合形成的復(fù)合材料存在的結(jié)構(gòu)單一，孔徑不均等技術(shù)問題，首先提供一種絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，該絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體具有粒徑均一等特點。

本發(fā)明的目的之二是為了解決傳統(tǒng)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架形狀結(jié)構(gòu)難以控制、支架孔隙連通率低、造孔材料難以清除等技術(shù)問題，而利用上述的絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體制備一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，該具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，由于利用三維打印技術(shù)，有效地控制最終所得的復(fù)合支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，得到具有高孔隙率、較好的孔連通性，可控的力學(xué)性能的骨修復(fù)復(fù)合材料支架，即最終所得的復(fù)合支架具有孔徑可調(diào)，形貌可控，“一結(jié)構(gòu)，一支架”的優(yōu)點，從而提高復(fù)合支架的生物學(xué)性能，從而有利于成骨誘導(dǎo)、分化，細(xì)胞黏附、遷移、增殖?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)中存在的結(jié)構(gòu)問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案

一種絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將蠶繭浸入濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進(jìn)行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

蠶繭和濃度為0.5g/l的na2co3水溶液的用量，按蠶繭：濃度為0.5g/l的na2co3水溶液為4.3g：500ml的比例計算；

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將cacl2、ch3ch2oh和去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進(jìn)行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分?jǐn)嚢柚敝列Q絲完全溶解，得到絲素溶液，溶解蠶絲所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

或?qū)⒉襟E（1）所得的蠶絲溶于9.3mol/l的libr水溶液，75℃水浴加熱，充分?jǐn)嚢柚敝列Q絲完全溶解，然后利用透析袋（截留分子量：8000-14000）進(jìn)行透析得到絲素溶液；

溶解所用的9.3mol/l的libr水溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：9.3mol/l的libr水溶液為1g:15ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將(nh4)2hpo4溶于去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，滴加過程中通過滴加質(zhì)量百分比濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為400rpm進(jìn)行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進(jìn)行冷凍干燥，過400-800目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑在19-38微米之間，然后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

利用上述的絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體制備一種絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體復(fù)合支架，具體包括如下步驟：

（1）、在上述所得的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，攪拌均勻后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為3.0~10.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為聚乙烯醇、海藻酸鈉、聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚酯或泊洛沙姆的水溶液，優(yōu)選為質(zhì)量百分比濃度為10-15%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量為146000-186000，或優(yōu)選為質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液，所述的海藻酸鈉的分子量為216；

或所述的粘結(jié)劑為聚己內(nèi)酯溶于三氯甲烷而得的有機(jī)溶液，聚己內(nèi)酯和三氯甲烷的用量，按質(zhì)量比體積計算，聚己內(nèi)酯：三氯甲烷為1：3的比例計算，其中聚己內(nèi)酯的平均分子量為8000；

（2）、將步驟（1）得到的打印墨水裝進(jìn)三維打印機(jī)的料筒中，針頭直徑為100~1000微米，優(yōu)選為400微米，啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.5~4.0bar，打印速度為3.0~8.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為0°~180°，孔徑為50~1200微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后控制溫度為-90℃進(jìn)行冷凍干燥，得到絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

本發(fā)明的各實施例中僅以45°~190°，孔徑為400微米進(jìn)行舉例說明，但并不限制墨水相鄰兩層走向夾角為0°~180°，孔徑為50~1200微米的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的制備；

所述的三位打印程序是通過cad、ug或solidworks等三維繪圖軟件繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，首先通過原位礦化過程在絲素蛋白分子上沉積羥基磷灰石，獲得有機(jī)無機(jī)復(fù)合的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體，所得復(fù)合粉體材料的粒徑均一，通過控制絲素蛋白、氯化鈣和磷酸氫二銨在分散相中的比例，可以調(diào)控所得復(fù)合粉體的微觀結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步，通過三維打印技術(shù)將該粒徑均一的復(fù)合粉體材料制備成具有特定結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架，因此所得的復(fù)合支架具有“一結(jié)構(gòu)，一支架”的技術(shù)效果。

進(jìn)一步，本發(fā)明的一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的制備方法，由于可以通過三維打印技術(shù)改變切層的網(wǎng)格填充方式和孔隙大小，因此可以方便的調(diào)節(jié)復(fù)合支架的孔隙率和孔結(jié)構(gòu)，從而制備出具有高孔隙率、較好的孔連通性，可控的力學(xué)性能的骨修復(fù)復(fù)合材料支架，從而有利于成骨誘導(dǎo)、分化，細(xì)胞黏附、遷移、增殖，創(chuàng)建適應(yīng)成骨相關(guān)細(xì)胞生長需要的微環(huán)境。

附圖說明

圖1a、實施例1所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架掃描電鏡照片；

圖1b、實施例2所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架掃描電鏡照片；

圖1c、實施例3所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架掃描電鏡照片；

圖2、實施例1所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的光學(xué)照片；

圖3、實施例2所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的光學(xué)照片；

圖4a、圖4b、實施例6所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的光學(xué)照片。

具體實施方式

為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例做詳細(xì)說明，但并不限制本發(fā)明。

本發(fā)明的實施例中所用的三維打印機(jī)是第四代3-dbioplotter?(envisiontecgmbh,germany)，本發(fā)明所用的三維打印程序可由autocad、ug、solidworks等三維繪圖軟件繪制。

實施例1

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進(jìn)行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進(jìn)行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為400rpm進(jìn)行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進(jìn)行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為3.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為15%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量為146000-186000；

質(zhì)量百分比濃度為15%的聚乙烯醇水溶液的配制：即將7.5g分子量為146000-186000的聚乙烯醇溶于42.5g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為15%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進(jìn)三維打印機(jī)的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.5~3.0bar,打印速度為4.0~6.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為60°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過solidworks制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

采用feiquanta450型場發(fā)射掃描電鏡，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進(jìn)行掃描，所得的sem圖如圖1a所示，從圖1a中可以看出通過三維打印技術(shù)制備的復(fù)合支架層與層之間，線與線之間均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于細(xì)胞的黏附、遷移、增殖。

采用華為手機(jī)加外置魚眼鏡頭，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進(jìn)行拍攝，所得的光學(xué)照片如圖2所示，從圖2中可以看出支架結(jié)構(gòu)完好，線與線之間間距均勻，孔徑分布良好。由此表明了支架孔隙率高，支架結(jié)構(gòu)完整。

實施例2

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進(jìn)行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進(jìn)行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進(jìn)行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后控制，控制溫度為-90℃進(jìn)行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為5.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量為146000-186000；

質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液的配制：即將5g分子量為146000-186000的聚乙烯醇溶于45g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進(jìn)三維打印機(jī)的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.5~3.5bar,打印速度為3.0~5.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為60°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過solidworks制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

采用feiquanta450型場發(fā)射掃描電鏡，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進(jìn)行掃描，所得的sem圖如圖1b所示，從圖1b中可以看出通過三維打印技術(shù)制備的復(fù)合支架層與層之間，線與線之間均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于細(xì)胞的黏附、遷移、增殖，且不同比例的支架表面粗糙度、孔隙率存在差異。

采用華為手機(jī)加外置魚眼鏡頭，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進(jìn)行拍攝，所得的光學(xué)照片如圖3所示，從圖3中可以看出支架結(jié)構(gòu)完好，線與線之間間距均勻，層與層呈90度堆疊孔徑分布良好。由此表明了支架孔隙率高，支架結(jié)構(gòu)完整，利用三維打印技術(shù)能夠靈活的控制打印參數(shù)。

實施例3

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進(jìn)行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進(jìn)行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓玫浇z素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進(jìn)行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進(jìn)行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為10.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量為146000-186000；

質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液的配制：即將5g分子量為146000-186000的聚乙烯醇溶于45g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為10%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進(jìn)三維打印機(jī)的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為3.5~4.0bar,打印速度為4.0~6.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為60°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過solidworks制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

采用feiquanta450型場發(fā)射掃描電鏡，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進(jìn)行掃描，所得的sem圖如圖1c所示，從圖1c中可以看出通過三維打印技術(shù)制備的復(fù)合支架層與層之間，線與線之間均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于細(xì)胞的黏附、遷移、增殖，且不同比例的支架表面粗糙度、孔隙率均存在差異。

實施例4

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進(jìn)行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進(jìn)行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進(jìn)行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進(jìn)行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為5.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液，所述的海藻酸鈉的分子量為216；

質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液的配制：即將2g分子量為216的海藻酸鈉溶于18g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進(jìn)三維打印機(jī)的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.5~3.0bar,打印速度為6.0~8.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為45°，孔徑為600微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過solidworks制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

實施例5

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進(jìn)行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

首先，將11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去離子水按摩爾比計算，即cacl2：ch3ch2oh：去離子水為1：2：8的比例進(jìn)行混合均勻，得到三元混合溶液；

然后將步驟（1）所得的蠶絲全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加熱，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，得到絲素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：三元混合溶液為1g:8ml的比例計算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進(jìn)行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進(jìn)行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h攪拌均勻后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為5.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為1g聚己內(nèi)酯溶于3ml三氯甲烷而得的有機(jī)溶液，聚己內(nèi)酯和三氯甲烷的用量，按質(zhì)量比體積計算，聚己內(nèi)酯：三氯甲烷為1：3的比例計算，其中聚己內(nèi)酯的平均分子量為8000；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進(jìn)三維打印機(jī)的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為2.8~3.5bar,打印速度為3.0~5.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為90°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過ug制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

實施例6

一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架，通過包括如下步驟的方法制備而成：

（1）、蠶繭去除蠶蛹，清理蠶繭表面雜物

將4.3g蠶繭浸入500ml的濃度為0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min進(jìn)行脫膠，取出脫膠后所得的蠶絲，用去離子水洗滌3次，然后60℃真空干燥24h，得到蠶絲，室溫下干燥保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）、蠶絲溶液的制備

濃度為9.3mol/l的libr水溶液的配制：即取40glibr溶于50ml去離子水，得到濃度為9.3mol/l的libr水溶液；

將步驟（1）所得的蠶絲溶于上述所得的濃度為9.3mol/l的libr水溶液，75℃水浴加熱，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓缓罄猛肝龃ń亓舴肿恿浚?000-14000）進(jìn)行透析，得到絲素溶液；

溶解所用的9.3mol/l的libr水溶液的量，按制備蠶絲所用的蠶繭：9.3mol/l的libr水溶液為1g:15ml的比例計算

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先將7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去離子水中，得到濃度為0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率為0.5ml/min的速率將上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步驟（2）所得絲素溶液中，滴加過程控制轉(zhuǎn)速為800rpm，溫度為75℃，過程中通過滴加濃度為26%的氨水維持絲素溶液的ph為9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速800rpm持續(xù)攪拌24h得到乳濁液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制備絲素溶液所用的蠶絲的質(zhì)量比計算，即(nh4)2hpo4：蠶絲為1.85：1；

（4）、將步驟（3）所得的乳濁液控制轉(zhuǎn)速為800rpm進(jìn)行離心，所得的沉淀用去離子水洗滌4次后，控制溫度為-90℃進(jìn)行冷凍干燥，過400目篩子，得到絲素蛋白/羥基磷灰石白色復(fù)合粉體，其粒徑均一，均小于38微米，然后密封保存?zhèn)溆茫?/p>

（5）、在步驟（4）得到的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中加入粘結(jié)劑，控制攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm攪拌2h后得到打印墨水，密封保存?zhèn)溆茫?/p>

粘結(jié)劑的加入量，按絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體：粘結(jié)劑的質(zhì)量比為10.0：1的計算；

所述的粘結(jié)劑為質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液，所述的海藻酸鈉的分子量為216；

質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液的配制：即將2g分子量為216的海藻酸鈉溶于18g的去離子水中，控制溫度為90℃水浴加熱磁力攪拌至完全溶解即得質(zhì)量百分比濃度為10%的海藻酸鈉水溶液；

（6）、將步驟（5）得到的打印墨水裝進(jìn)三維打印機(jī)的料筒中，針頭直徑為400微米；啟動三維打印程序，調(diào)節(jié)氣壓為3.0~3.5bar，打印速度為6.0~8.0mm/s，墨水相鄰兩層走向夾角為60°，孔徑為800微米，將打印墨水以層層堆積的方式沉積在載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，冷凍干燥，得到具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架；

所述的三位打印程序是通過autocad制圖技術(shù)繪制而成的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架圖形。

采用華為手機(jī)加外置魚眼鏡頭，對上述所得的具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架進(jìn)行拍攝，所得的光學(xué)照片如圖4a、4b所示，從圖4a、4b中可以看出支架結(jié)構(gòu)完好，線與線之間間距均勻，層與層呈90度堆疊，孔徑分布良好，支架高度、形狀可調(diào)。由此表明了支架孔隙率高，支架結(jié)構(gòu)完整，利用三維打印技術(shù)能夠靈活的控制打印參數(shù)。

綜上所述，本發(fā)明提供的一種具有三維結(jié)構(gòu)的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架的制備方法，首先通過仿生礦化，制備出粒徑均一的絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體，該絲素蛋白在絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合粉體中的含量，按質(zhì)量百分比計算可達(dá)10%-80%，進(jìn)一步，利用三維打印技術(shù)，可制備出具有高孔隙率、較好的孔連通性，可控的力學(xué)性能的骨修復(fù)復(fù)合材料支架，從而有利于成骨誘導(dǎo)、分化，細(xì)胞黏附、遷移、增殖。通過三維打印技術(shù)，可以靈活調(diào)節(jié)打印針頭直徑、打印氣壓、打印速度、支架孔徑和結(jié)構(gòu)等參數(shù)，能夠滿足骨組織工程支架“一結(jié)構(gòu)，一支架”的要求。

以上所述僅是本發(fā)明的實施方式的舉例，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，例如：基本參數(shù)的改變（針頭直徑、打印氣壓、打印速度等）、打印墨水的配比、粘結(jié)劑的改變、粉體和支架的處理方法等，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。