本發(fā)明涉及一種聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
周?chē)窠?jīng)損傷在臨床上十分常見(jiàn)，迄今為止，經(jīng)歷了神經(jīng)吻合、自體神經(jīng)移植、同種異體神經(jīng)移植、自體非神經(jīng)組織移植和生物材料替代等幾個(gè)過(guò)程，但幾種治療方式各有利弊，未使神經(jīng)缺損的問(wèn)題得到根本性的解決。通過(guò)研究表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)作用，能促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)，誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長(zhǎng)，刺激胞體和樹(shù)突的發(fā)育，促進(jìn)神經(jīng)元的分化發(fā)育。同時(shí)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一定條件內(nèi)的電刺激對(duì)周?chē)窠?jīng)再生與神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，不論是局部還是全身應(yīng)用，或電場(chǎng)類(lèi)型、脈沖頻率、波長(zhǎng)以及時(shí)間長(zhǎng)短,，均具有促進(jìn)的作用。
在以往，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)通過(guò)注射作用于神經(jīng)損傷部位，但其中大多數(shù)生物半衰期短，容易遭受破壞失去生活活性，且在直接注入后無(wú)法解決突釋的問(wèn)題，無(wú)法達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間修復(fù)神經(jīng)損傷的作用。因此找到一種合適的藥物載體，既可以對(duì)藥物的釋放進(jìn)行一定控制，且兼具導(dǎo)電特性能輔助進(jìn)行電刺激修復(fù)，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化，將為修復(fù)神經(jīng)損傷提供很好的研究方向與幫助。
水凝膠是一種由親水性聚合物所形成的不溶于水的高度交聯(lián)系統(tǒng)，由于其具有含水量高，與人體組織力學(xué)性能相似等特點(diǎn)，使得水凝膠材料廣泛應(yīng)用在藥物控釋及活性細(xì)胞包覆等生物醫(yī)用領(lǐng)域。合成水凝膠的材料主要包括天然高分子材料如絲素蛋白、殼聚糖、透明質(zhì)酸、明膠等，以及人工合成可降解材料如聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯等。這些材料在一定程度上能起到促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生的效果，所以充分利用天然材料的生物活性基元及便于大批量生產(chǎn)及成本低等特點(diǎn)，可制備出內(nèi)部結(jié)構(gòu)多孔，生物相容性優(yōu)良的水凝膠。
水凝膠與導(dǎo)電聚合物(cps)組成的復(fù)合材料被稱為導(dǎo)電水凝膠，它是理想的生物醫(yī)用材料，可應(yīng)用于組織工程中修復(fù)受損的組織和器官、電化學(xué)生物傳感器以及可控制藥物釋放體系。導(dǎo)電水凝膠結(jié)合了cps的電性能與水凝膠的機(jī)械性能，使其成為可控制藥物釋放領(lǐng)域的新型熱點(diǎn)材料。該體系可以達(dá)到較高的載藥量水平，而且可以解決單純cps對(duì)中性藥物加載不理想以及大體積藥物無(wú)法從cps體系中釋放等問(wèn)題。
殼聚糖(cs)是一種多糖類(lèi)天然高分子，具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性、低毒及較好的生物活性和力學(xué)性能等。研究表明，一些組織細(xì)胞易黏附于殼聚糖表面并促進(jìn)其增殖，還具有藥物活性，而且能夠能促進(jìn)傷口愈合及軟、硬組織的重建等生物活性。其含有豐富的氨基和羥基，在堿性條件下，與氯乙酸反應(yīng)脫氯化氫可以得到羧甲基化的殼聚糖(cmcs)。通過(guò)化學(xué)交聯(lián)羧甲基殼聚糖，可以制備材料所需的水凝膠。
吡咯單體是一種c，n五元雜環(huán)分子，微溶于水，無(wú)毒，在電場(chǎng)或氧化劑的作用下易被氧化，進(jìn)而發(fā)生聚合反應(yīng)生成高分子聚合物聚吡咯。聚吡咯除了具有導(dǎo)電聚合物共同的特征以外，還具有單體無(wú)毒，容易制備，電導(dǎo)率高，機(jī)械性能好穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)電化學(xué)方法或其他手段把藥物分子或離子加入到聚合物中，可組成修飾電極或復(fù)合材料，將包含的藥物分子或離子釋放出去，可以實(shí)現(xiàn)藥物在體內(nèi)的控制釋放。這種方法可以更好的提高藥物的藥效，還可以實(shí)現(xiàn)更為智能化的功能,即通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)出的電信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)病人自主的釋放過(guò)程。對(duì)于這種體系的要求是藥物載體結(jié)合牢固，對(duì)體液穩(wěn)定，藥物負(fù)載量大,，釋放率高，載體無(wú)毒，無(wú)排異反應(yīng)。而聚吡咯復(fù)合材料恰恰滿足這些要求，可以作為一種優(yōu)良的藥物釋放載體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠及其制備與應(yīng)用，其適于周?chē)窠?jīng)損傷，具有電刺激修復(fù)以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的雙重功效系統(tǒng)。該導(dǎo)電水凝膠生物相容性好，對(duì)于ngf具有高載藥率，能對(duì)藥物的釋放起到緩釋作用，且通過(guò)外加電刺激或生物電刺激能輔助治療，可以為神經(jīng)修復(fù)與神經(jīng)細(xì)胞的再生提供更優(yōu)越的藥物載體與細(xì)胞依附組織。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠，其組分包括有羧甲基殼聚糖、交聯(lián)劑、吡咯單體、摻雜劑、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和去離子水，其用量配比為羧甲基殼聚糖：交聯(lián)劑：吡咯單體：摻雜劑：神經(jīng)生長(zhǎng)因子：去離子水＝1：0.08-0.16：0.06-0.12：0.09-0.18：0.08-0.16：150-200，以重量比計(jì)。
聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的制備方法，包括以下步驟：將羧甲基殼聚糖通過(guò)交聯(lián)劑在一定條件下制備羧甲基殼聚糖水凝膠，凍干處理；與此同時(shí)將吡咯單體電化學(xué)合成聚吡咯并加入摻雜劑進(jìn)行改性，將改性的聚吡咯進(jìn)行球磨粉碎得到改性的聚吡咯顆粒，使其顆粒尺寸與羧甲基殼聚糖水凝膠孔隙的孔徑相匹配；隨后將神經(jīng)生長(zhǎng)因子融入水中，加入改性的聚吡咯顆粒，攪拌分散均勻，放入羧甲基殼聚糖水凝膠，使溶液完全吸收，再加入水，震蕩，充分溶脹平衡，即得到聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠。
按上述方案，所述的羧甲基殼聚糖水凝膠的制備方法是：將交聯(lián)劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)加入到二甲基亞砜(dmso)中，攪拌溶解，再將其加入到羧甲基殼聚糖的水溶液中，進(jìn)行反應(yīng)，即得羧甲基殼聚糖水凝膠。
按上述方案，所述的改性的聚吡咯的制備方法是：將摻雜劑對(duì)甲基苯磺酸鈉加入去離子水中，溶解后，再加入吡咯單體，震蕩分散均勻，配置成為電解液，運(yùn)用循環(huán)伏安法電化學(xué)合成得到改性的聚吡咯。
按上述方案，所述的聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的基質(zhì)組分含量為：神經(jīng)生長(zhǎng)因子6％-10％，改性的聚吡咯顆粒12％-18％，羧甲基殼聚糖水凝膠凍干物74％-80％，以重量比計(jì)；聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的基質(zhì)與去離子水的用量比為1：80-120。
按上述方案，所述的粉碎后的改性的聚吡咯顆粒的粒徑為50-80μm，制得的羧甲基殼聚糖水凝膠孔隙的孔徑為80-200μm。
所述的聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠作為注射的藥物載體的應(yīng)用，可以注射進(jìn)神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)。
本發(fā)明以具有優(yōu)良機(jī)械性能與生物相容性的水凝膠為基底，摻雜具有高電導(dǎo)率的改性聚吡咯顆粒，并包埋神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類(lèi)型的模型藥物，制備得到生物導(dǎo)電水凝膠。在用于神經(jīng)修復(fù)時(shí)，既能完成對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的緩釋，且能經(jīng)由生物電或外加電刺激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行一定的電刺激，通過(guò)電刺激與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的雙重作用，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖分化，引導(dǎo)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，使能在修復(fù)神經(jīng)損傷時(shí)取得更好的效果。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
(1)制備的生物導(dǎo)電水凝膠系統(tǒng)穩(wěn)定，且有良好的生物相容性
本發(fā)明制備的水凝膠與聚吡咯的復(fù)合材料穩(wěn)定性好，無(wú)生物毒性，且結(jié)構(gòu)具有仿生性，不會(huì)產(chǎn)生排異反應(yīng)且能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供優(yōu)良的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。
(2)摻雜的聚吡咯顆粒尺寸可調(diào)節(jié)，解決聚吡咯在體內(nèi)不可降解的問(wèn)題
以往通過(guò)電化學(xué)合成聚吡咯通常是為了得到高電導(dǎo)率的聚吡咯導(dǎo)電薄膜，本發(fā)明將電化學(xué)合成的聚吡咯通過(guò)細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行粉碎處理，得到均勻分散的，顆粒大小可調(diào)節(jié)的聚吡咯導(dǎo)電顆粒。在生物導(dǎo)電水凝膠分解后可隨人體體液循環(huán)排出；
(3)制備的生物導(dǎo)電水凝膠對(duì)模型藥物如ngf有高載藥率且具有緩釋作用
本發(fā)明的水凝膠結(jié)構(gòu)多孔，且孔徑可調(diào)節(jié)。同樣的，摻雜的聚吡咯顆粒尺寸也可進(jìn)行調(diào)節(jié)，可將二者進(jìn)行同步調(diào)整，來(lái)滿足裝載不同模型藥物，提高載藥率，對(duì)藥物進(jìn)行緩釋；
(4)電刺激與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)的雙重作用，提高了對(duì)于修復(fù)神經(jīng)損傷和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的功效。
附圖說(shuō)明
圖1為聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的掃描電鏡結(jié)構(gòu)圖，其中圖1(a)為改性聚吡咯顆粒、圖1(b)為羧甲基殼聚糖水凝膠、圖1(c)為聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠。
具體實(shí)施方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
實(shí)施例1
1)高分子水凝膠的制備
采用均相edc/nhs催化體系，交聯(lián)羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入0.1gcmcs，再加入30ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.01gedc和0.006gnhs加入到40ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉(zhuǎn)移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間15h。羧甲基殼聚糖的交聯(lián)過(guò)程反應(yīng)方程式是：
產(chǎn)物透析48h，冷凍干燥24h，得到羧甲基殼聚糖水凝膠凍干物；通過(guò)圖1(b)羧甲基殼聚糖水凝膠的電鏡圖測(cè)得水凝膠的孔隙孔徑為80-200μm。
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統(tǒng)，ito導(dǎo)電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學(xué)工作站作為電源。電解液由對(duì)甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取1g對(duì)甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入0.5ml吡咯單體，繼續(xù)攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環(huán)伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區(qū)間設(shè)定為0-2.5v，加壓速率為0.01v/s，掃描周期為100周。
聚吡咯的摻雜和脫摻雜的過(guò)程如下反應(yīng)式所示：
掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為360r/min，時(shí)間為4min，得到尺寸均勻的改性的聚吡咯顆粒，通過(guò)圖1(a)改性聚吡咯顆粒的電鏡圖測(cè)得顆粒尺寸為50-80μm；
3)聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的制備
將0.005gngf溶于10ml水中，待完全溶解后，加入0.01g改性的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.05g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收，再加入10ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠。通過(guò)圖1(c)聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的電鏡圖我們觀察到最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多孔且層次分明，尺寸均勻的改性聚吡咯顆粒摻雜進(jìn)結(jié)構(gòu)特征明顯的水凝膠中，為細(xì)胞吸附生長(zhǎng)創(chuàng)造了良好的模擬環(huán)境并使載體附帶了適度的電導(dǎo)特性。
制得的聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的電導(dǎo)率為：
實(shí)施例2
1)高分子水凝膠的制備
以羧甲基殼聚糖(cmcs)為例。采用均相edc/nhs催化體系，交聯(lián)羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入0.2gcmcs，再加入30ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.02gedc和0.012gnhs加入到60ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉(zhuǎn)移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間15h。產(chǎn)物透析48h，冷凍干燥24h，得到水凝膠凍干物；
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統(tǒng)，ito導(dǎo)電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學(xué)工作站作為電源。電解液由對(duì)甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取2g對(duì)甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入1ml吡咯單體，繼續(xù)攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環(huán)伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區(qū)間設(shè)定為0-2.5v，加壓速率為0.01v/s，掃描周期為100周。掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為360r/min，時(shí)間為5min，得到尺寸均勻的改性的聚吡咯顆粒。
3)聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的制備
將0.01gngf溶于20ml水中，待完全溶解后，加入0.02g的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.1g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收。再加入20ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠。
實(shí)施例3
1)高分子水凝膠的制備
以羧甲基殼聚糖(cmcs)為例。采用均相edc/nhs催化體系，交聯(lián)羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入0.3gcmcs，再加入50ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.03gedc和0.018mgnhs加入到60ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉(zhuǎn)移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間15h。產(chǎn)物透析48h，冷凍干燥24h，得到水凝膠凍干物；
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統(tǒng)，ito導(dǎo)電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學(xué)工作站作為電源。電解液由對(duì)甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取3g對(duì)甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入1.5ml吡咯單體，繼續(xù)攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環(huán)伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區(qū)間設(shè)定為0-2.5v，加壓速率為0.01v/s，掃描周期為100周。掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為360r/min，時(shí)間為6min，得到尺寸均勻的聚吡咯顆粒。
3)聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的制備
將0.015gngf溶于20ml水中，待完全溶解后，加入0.03g的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.15g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收。再加入30ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠。
實(shí)施例4
1)高分子水凝膠的制備
以羧甲基殼聚糖(cmcs)為例。采用均相edc/nhs催化體系，交聯(lián)羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入0.6gcmcs，再加入100ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.06gedc和0.036gnhs加入到80ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉(zhuǎn)移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間15h。產(chǎn)物透析48h，冷凍干燥24h，得到水凝膠凍干物；
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統(tǒng)，ito導(dǎo)電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學(xué)工作站作為電源。電解液由對(duì)甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取6g對(duì)甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入3ml吡咯單體，繼續(xù)攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環(huán)伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區(qū)間設(shè)定為0-2.5v，加壓速率為0.05v/s，掃描周期為100周。掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為360r/min，時(shí)間為7min，得到尺寸均勻的聚吡咯顆粒。
3)聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的制備
將0.03gngf溶于40ml水中，待完全溶解后，加入0.06g的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.3g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收。再加入60ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠。
實(shí)施例5
1)高分子水凝膠的制備
以羧甲基殼聚糖(cmcs)為例。采用均相edc/nhs催化體系，交聯(lián)羧甲基殼聚糖制備水凝膠。在250ml三口燒瓶中加入1gcmcs，再加入120ml去離子水，磁力攪拌30～60min，溶解。將0.1gedc和0.06gnhs加入到100ml二甲基亞砜(dmso)中，磁力攪拌溶解。將dmso溶液轉(zhuǎn)移到滴液漏斗中，逐滴加入到羧甲基殼聚糖水溶液中，反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間15h。產(chǎn)物透析48h，冷凍干燥24h，得到水凝膠凍干物；
2)聚吡咯的制備
采用三電極系統(tǒng)，ito導(dǎo)電玻璃作為工作電極，鉑絲作為輔助電極，飽和甘汞電極作為參比電極，以電化學(xué)工作站作為電源。電解液由對(duì)甲基苯磺酸鈉與水配成，配制稱取10g對(duì)甲基苯磺酸鈉加入100ml去離子水，攪拌溶解10min。再向溶液中加入2ml吡咯單體，繼續(xù)攪拌至分散均勻。將工作電極插入配置的電解液中，采用循環(huán)伏安法制備。起始電壓為0v，掃描區(qū)間設(shè)定為0-2.5v，加壓速率為0.1v/s，掃描周期為100周。掃描完成后，將工作電極上生成的聚吡咯剝離，多次洗滌后烘干，將聚吡咯放入行星式球磨儀進(jìn)行研磨，轉(zhuǎn)速為360r/min，時(shí)間為8min，得到尺寸均勻的聚吡咯顆粒。
3)聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠的制備
將0.05gngf溶于50ml水中，待完全溶解后，加入0.1g的聚吡咯顆粒，超聲震蕩至完全分散，放入0.5g水凝膠凍干物，使溶液完全吸收。再加入100ml水，震蕩，使充分溶脹平衡；或先將0.5g聚吡咯顆粒反散投入含有1gcmcs的120ml去離子水溶液中，磁力攪拌60min，再加入含有0.1gedc和0.06gnhs的100ml二甲基亞砜(dmso)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，時(shí)間24h，產(chǎn)物進(jìn)行凍干處理后，將0.6g的凍干產(chǎn)物加入含有0.05gngf的50ml水中，待溶液完全吸收，再加入60ml水，震蕩，使充分溶脹平衡，得到聚吡咯生物導(dǎo)電水凝膠。