吡唑并[1,5?a]吡啶類化合物的新應用及一種治療膿腫分枝桿菌感染的組合物的制作方法

本發(fā)明屬于組合物領域，更具體地，涉及一種治療膿腫分枝桿菌感染的組合物。

背景技術(shù)：

膿腫分枝桿菌(mycobacteriumabscessus，mab)是屬于非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculousmycobacteria，ntm)分類中的迅速生長的菌類，其主要引起肺部、皮膚和皮下軟組織感染，可以在免疫缺陷的病人中傳播，能引起包括囊胞性纖維癥，纖維化支氣管擴張，慢性阻塞性肺炎等肺部疾病。相關調(diào)查研究表明，在ntm引起的肺病中，mab感染所占比例為82％，mab可以引起散在的和爆發(fā)性的流行，近年來已經(jīng)成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，有報道指出，過去的十年中，在中國、美國和澳大利亞由于mab引起的感染人數(shù)呈上升的趨勢。

mab對多種抗生素天然耐藥，只有極少數(shù)藥物對其具有殺菌或抑菌活性，這使得目前mab感染難以治療。1990年，克拉霉素(clarithromycin，clr)被列為mab的主要治療藥物，然而clr在治療過程中極易產(chǎn)生誘導耐藥，特別是采用clr單一治療時，誘導耐藥往往使治療失敗。已有研究將clr、氨基糖苷類的頭孢西丁(cefoxitin，fox)以及阿米卡星(amikacin，amk)聯(lián)用治療由mab引起的疾病，但是該療法的治愈率僅有50％左右，并且副作用極大，復發(fā)率高，且臨床治療周期往往需要2～6個月，但是藥物的副作用往往不允許這么長時間的療程。

氯法齊明(clofazimine，cfz)是人工合成化合物，最初是麻風病的治療藥物，后來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)其抗其他分枝桿菌的活性，現(xiàn)為耐多藥結(jié)核病(mdr-tb)的二線口服藥物。然而，由于其在治療時會有時滯性，需要很長的治療周期，且藥物副作用大，長期治療會帶來嚴重的色素沉積以及心臟毒性。此外，cfz對mab的抑菌效果并不理想，最小抑制濃度(miniuminhibitationconcentration,mic)往往超過1.5μg/ml，目前對于cfz是否能有效治療mab感染，仍有待檢驗。

吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物是一種具有良好的體外抗結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis，簡稱結(jié)核菌)活性的新型化合物，其抗結(jié)核菌的mic低于0.1μg/ml，部分達到0.003μg/ml，對臨床分選的耐多藥結(jié)核菌(mdr-tb)菌株具有很強的抑制作用。體內(nèi)實驗中，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在20mg/kg/d的劑量下，可有效抑制小鼠體內(nèi)結(jié)核菌生長；然而，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，其對mab的最低抑菌濃度超過了50μg/ml，已經(jīng)可以判斷其不能單獨用于治療mab感染。

綜上，開發(fā)一種起效快、不反彈、療效好的治療mab感染的藥物，具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在制備氯法齊明抗菌增效劑中的應用；

本發(fā)明的目的之二在于提供一種治療膿腫分枝桿菌感染的組合物。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在制備氯法齊明抗菌增效劑中的應用。

作為上述應用的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在制備氯法齊明抗膿腫分枝桿菌增效劑中的應用。

作為上述應用的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物為吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物或其藥學上可接受的鹽或酯或醚或其立體異構(gòu)體或其前藥分子。

作為上述應用的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物的主體結(jié)構(gòu)式如下：

其中，r1基團為：5-ome；r2基團為：me；r3基團為：

一種治療膿腫分枝桿菌感染的組合物，其活性成分含有：

(a)氯法齊明；和

(b)吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物；和/或

(c)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

上述組合物的優(yōu)選，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素中的一種或多種。

上述組合物的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物為吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物或其藥學上可接受的鹽或酯或醚或其立體異構(gòu)體或其前藥分子。

上述組合物的優(yōu)選，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物的主體結(jié)構(gòu)式如下：

其中，r1基團為：5-ome；r2基團為：me；r3基團為：

上述組合物的優(yōu)選，治療膿腫分枝桿菌感染的組合物其活性成分按重量份含有：吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物1～25份，氯法齊明20～100份。

上述組合物的優(yōu)選，治療膿腫分枝桿菌感染的組合物活性成分按重量份含有：吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物1.5～2.5份、氯法齊明2～3份、克拉霉素或羅紅霉素15～25份。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物可用于制備氯法齊明抗膿腫分枝桿菌增效劑，研究發(fā)現(xiàn)，吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物體外單獨使用不能抑制膿腫分枝桿菌，氯法齊明體外單獨使用的最低抑菌濃度為2.5μg/ml，二者聯(lián)用具有協(xié)同效果，并且進一步發(fā)現(xiàn)低濃度的吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物即可增強氯法齊明抗膿腫分枝桿菌的效果。

本發(fā)明的治療膿腫分枝桿菌感染的組合物，其活性成分含有氯法齊明和/或大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，以及增效劑吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物；胞內(nèi)活性檢測和小鼠體內(nèi)活性檢測表明：吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物和氯法齊明存在協(xié)同作用；此外，無論是單獨使用克拉霉素，還是克拉霉素和阿米卡星聯(lián)合使用，都極易產(chǎn)生誘導耐藥，導致膿腫分枝桿菌感染的治療效果下降，所需治療周期也被大大延長，使用氯法齊明、吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物以及克拉霉素或者羅紅霉素三種藥聯(lián)合使用后，不僅起效快，同時也沒有出現(xiàn)治療反彈，并且克服了現(xiàn)有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素臨床治療易產(chǎn)生誘導耐藥，長期治療效果差的弊端。

附圖說明

圖1：cfz和tb47的分級濃度對mab藥敏檢測結(jié)果，圖中，x軸所示為相應的cfz分級濃度，圖標所示為相應的tb47分級濃度，y軸所示為兩藥聯(lián)用時檢測的相對發(fā)光值對應菌數(shù)；

圖2：低濃度tb47對cfz抗mab的增效實驗結(jié)果，圖中，x軸表示檢測的不同時間點，準備加藥前為0h，y軸所示為檢測的相對發(fā)光值對應菌數(shù)；

圖3：clr、rox(roxithromycin，羅紅霉素)和cfz單用以及cfz和tb47組合使用對mab胞內(nèi)活性的檢測結(jié)果；圖中，x軸表示檢測的不同時間點，準備加藥前為0h，y軸表示每個時間點檢測的相對發(fā)光值(與存活的細菌量成正比)和0h檢測的相對發(fā)光值的比值；

圖4：不同藥物組合對mab胞內(nèi)活性的檢測結(jié)果；圖中，x軸表示檢測的不同時間點，準備加藥前為0h，y軸表示每個時間點檢測的相對發(fā)光值(與存活的細菌量成正比)和0h檢測的相對發(fā)光值的比值；

圖5：不同藥物及藥物組合對感染mab小鼠體內(nèi)活性的檢測結(jié)果；圖中，x軸表示處死小鼠檢測的不同時間點，準備加藥前為day0，y軸表示的是小鼠肺部的菌載量；triple-drug組只有14天后的檢測結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明的治療膿腫分枝桿菌感染的組合物，其活性成分含有：

(a)氯法齊明；和

(b)吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物；和/或

(c)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

其中吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物作為氯法齊明的抗菌增效劑；

其中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以選用克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等。

本發(fā)明所述的tb47為一種吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物，

tb47的主體結(jié)構(gòu)式為：

其中：r1基團為：5-ome；r2基團為：me；r3基團為：

本發(fā)明的吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物可以是吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物或其藥學上可接受的鹽或酯或醚或其立體異構(gòu)體或其前藥分子。

本發(fā)明中所述的最低抑菌濃度為mic90。

本發(fā)明所用的自發(fā)光mab，為廣州市胸科醫(yī)院提供臨床菌株，申請人構(gòu)建的自主發(fā)光mab，專利號cn201510104936.3。

以下通過實驗例進一步解釋本發(fā)明。

實驗例1、cfz和tb47的分級抑菌濃度實驗

1.實驗分組

tb47分級濃度為12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0μg/ml；

cfz(cfz)分級濃度為10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.62μg/ml、0μg/ml；

按上述兩種藥物的分級濃度一一相互組合聯(lián)合給藥；

上述所用cfz、tb47溶解于二甲基亞砜(dmso)中待用。

2.實驗步驟

(1)mab的培養(yǎng)

將自發(fā)光mab接入5ml7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散，培養(yǎng)至菌液的od600達到0.6～0.8時，將菌液稀釋10^-6，取0.5ml鋪板7h11固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)14天；從平板上挑取單菌落使用發(fā)光檢測儀檢測相對光單位(rlu)，將確認發(fā)光的單菌落接入50ml的7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散。培養(yǎng)至od600達到0.6～0.8時，使用7h9液體培養(yǎng)基稀釋至每200ul體積菌液發(fā)光值為3000～8000，用于檢測實驗，并對菌懸液進行稀釋平板計數(shù)，以校準實際菌數(shù)。

(3)mab藥敏檢測

取96孔板，根據(jù)各組設計的藥物濃度，將不同藥物分別加入設計孔中；在各孔中加入200μl含有相同菌量的菌懸液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)；在培養(yǎng)18小時后檢測相對發(fā)光值，相對發(fā)光值越小，說明藥物抑菌效果越明顯，反之亦然。

3.實驗結(jié)果

檢測結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明：當cfz濃度為0μg/ml時，分級提高tb47濃度，均表明單用tb47并不能抑制mab；當tb47濃度為0μg/ml時，cfz的最低抑菌濃度為2.5μg/ml；當cfz和tb47聯(lián)用后，其組合最低抑菌濃度是：cfz為0.62μg/ml和tb47為0.78μg/ml。根據(jù)分級抑菌濃度(fractionalinhibitoryconcentration，fic)的計算公式，即fic指數(shù)＝mic(a組聯(lián)合)/mic(a組單用)+mic(b組聯(lián)合)/mic(b組單用)，計算其fic指數(shù)為0.3104左右，該指數(shù)小于0.5，因此可以判斷cfz和tb47存在協(xié)同作用。

實驗例2、低濃度tb47對cfz抗mab的增效實驗

1.實驗分組

utreated組：給等體積的dmso，作為對照

tb47-0.078組：給藥tb47，濃度為0.078μg/ml；

cfz-2組：給藥cfz，濃度2μg/ml；

cfz-2+tb47-0.02組：給藥濃度為tb470.02μg/ml和cfz2μg/ml；

cfz-2+tb47-0.078組：給藥濃度為tb470.078μg/ml和cfz2μg/ml；

上述所用cfz、tb47溶解于dmso中待用。

2.實驗步驟

(1)mab的培養(yǎng)

將自發(fā)光mab接入5ml7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散，培養(yǎng)至菌液的od600達到0.6～0.8時，將菌液稀釋10^-6，取0.5ml鋪板7h11固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)14天；從平板上挑取單菌落使用發(fā)光檢測儀檢測相對光單位(rlu)，將確認發(fā)光的單菌落接入50ml的7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散。培養(yǎng)至od600達到0.6～0.8時，使用7h9液體培養(yǎng)基稀釋至每200ul體積菌液的發(fā)光值為3000～8000，用于檢測實驗，并對菌懸液進行稀釋平板計數(shù)，以校準實際菌數(shù)。

(2)mab藥敏檢測

取96孔板，根據(jù)實驗分組的藥物濃度，將不同藥物分別加入設計孔中，在各個孔中加入200μl含有相同菌量的菌懸液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，從給藥開始時和培養(yǎng)過程中定時檢測相對發(fā)光值，相對發(fā)光值越小，說明藥物抑菌效果越明顯，反之亦然。

3.實驗結(jié)果

檢測結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明：僅0.02μg/ml的tb47即可顯著提高cfz的抑菌效果；說明吡唑并[1,5-a]吡啶類化合物在很低濃度下可增強cfz抗mab的效果。

實驗例3、本發(fā)明組合物的胞內(nèi)活性檢測

1.實驗分組

untreated組：給等體積的二甲亞砜，作為對照；

tb47組：給藥tb47，濃度為1μg/ml；

cfz組：給藥cfz，濃度為2μg/ml，為其體外最低抑菌濃度；

clr組：給藥clr，濃度為4μg/ml，為其體外最低抑菌濃度；

rox組：給藥rox，濃度為4μg/ml，為其體外最低抑菌濃度；

cfz+tb47組：給藥cfz1μg/ml和tb472μg/ml；

clr+amk組：給藥clr4μg/ml和amk8μg/ml；

cfz+tb47+clr組：給藥cfz1μg/ml、tb472μg/ml和clr4μg/ml；

cfz+tb47+rox組：給藥cfz1μg/ml、tb472μg/ml和rox4μg/ml；

上述所用clr、rox、cfz、tb47溶解于dmso中待用；amk溶解于去離子水中，過濾除菌后待用。

2.實驗步驟

(1)thp-1細胞的誘導分化與處理

調(diào)整thp-1細胞的密度為5×10⁵/ml，移取2ml置于35×10mm的培養(yǎng)皿中，加入佛波酯(pma)至終濃度為100ng/l和0.1％胎牛血清白蛋白(bsa)的無血清1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48h，當70～90％的細胞由懸浮狀態(tài)變?yōu)橘N壁狀態(tài)，且細胞形狀也發(fā)生明顯變化，由圓形變?yōu)樗笮?，橢圓形或者不規(guī)則形，說明thp-1單核細胞已被pma誘導分化為巨噬細胞

(2)mab的培養(yǎng)

將自發(fā)光mab接入5ml7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散，培養(yǎng)至菌液的od600達到0.6～0.8時，將菌液稀釋10^-6，取0.5ml鋪板7h11固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)14天；從平板上挑取單菌落使用發(fā)光檢測儀檢測相對光單位(rlu)，將確認發(fā)光的單菌落接入50ml的7h9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入玻璃珠打散，用無菌生理鹽水重懸后，用300目的細胞篩網(wǎng)過濾，濾后接近形成單個存在的菌懸液，用于細胞感染實驗，并對菌懸液進行稀釋平板計數(shù)，以校準實際菌數(shù)。

(3)自發(fā)光mab侵染巨噬細胞

將誘導分化完成的巨噬細胞用pbs清洗3次，加入對數(shù)生長期的自發(fā)光mab，moi為10，侵染3h。在侵染這段時間中，根據(jù)各組設計的藥物濃度，將不同藥物分別加入含0.1％胎牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)基(無雙抗)中混勻。侵染完成后，使用pbs清洗細胞3次，加入含有藥物的0.1％胎牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)基(無雙抗)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

3.檢測結(jié)果

從給藥開始時，定時檢測相對發(fā)光值，并計算每個時間點相對發(fā)光值與0h檢測的相對發(fā)光值的比值，該比值越小說明藥物抑菌效果越明顯，反之亦然。

檢測結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明：tb47組與utreated組的檢測結(jié)果基本一致，說明單獨使用tb47并不能抑制mab，而cfz+tb47組的檢測結(jié)果顯著低于cfz組，說明tb47可以提高cfz的活性，二者聯(lián)用存在協(xié)同作用，并且聯(lián)用效果明顯優(yōu)于clr以及rox治療組。

檢測結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明：clr+amk組起效遠慢于cfz+tb47組、cfz+tb47+clr組和cfz+tb47+rox組，而clr+amk組和cfz+tb47組在給藥21h以后出現(xiàn)治療反彈，而cfz+tb47+clr組和cfz+tb47+rox組不僅比目前臨床上常用的治療方案起效更快，而且效果最優(yōu)，未出現(xiàn)治療反彈。

實驗例4、本發(fā)明組合物的小鼠體內(nèi)活性檢測

1.動物分組及給藥

選擇6周左右的balb/c-nude鼠，使用glas-col氣溶膠發(fā)生器進行mab感染，每只小鼠感染約5000cfu，感染兩天后開始給藥治療，給藥分組如下，每組5只小鼠：

untreated組：給等體積的0.5wt％的羧甲基維素鈉溶液，作為對照；；

cfz組：給藥cfz，灌胃量為25mg/kg；

tb47組：給藥tb47，灌胃量為20mg/kg；

cfz+tb47組：給藥灌胃量為cfz25mg/kg和tb4720mg/kg；

rox組：給藥rox，灌胃量為200mg/kg

triple-drugs組：給藥灌胃量為cfz25mg/kg、tb4720mg/kg、rox200mg/kg；

每種藥物的灌胃量為0.2ml/次/只，每天均只給藥一次；

上述clr、rox、cfz、tb47分別溶于0.5wt％的羧甲基維素鈉溶液中，超聲和震蕩處理去除團塊后，4℃避光待用。

2.指標檢測

在灌胃7d和14d，麻醉小鼠后頸椎脫臼法處死，取肺研磨，測定肺部的菌載量。

3.實驗結(jié)果

檢測結(jié)果如圖5所示，cfz+tb47組的抑菌效果優(yōu)于各自單獨使用，說明tb47和cfz在體內(nèi)聯(lián)用具有協(xié)同作用。目前認為rox等大環(huán)內(nèi)酯類的短期療效較好，而長期療效較差，因此對于triple-drugs組，主要是探究cfz+tb47能否提高rox的長期療效，因此在治療7天的這個時間點未進行檢測，只檢測了14天后的治療結(jié)果，可以看到triple-drug組的抑菌效果顯著優(yōu)于其他任意組別，說明在tb47和cfz聯(lián)用的基礎上，再加用rox或clr這類環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能進一步增強療效，并且隨著治療時間的延長，療效更佳，克服了現(xiàn)有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素臨床治療易產(chǎn)生誘導耐藥，長期治療效果差的弊端。