姜葉三七及其提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用的制造方法與工藝

本發(fā)明涉及姜葉三七、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物及姜葉三七揮發(fā)油的新用途，即在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物方面的新用途，特別是在制備治療和/或預(yù)防肺癌藥物方面的新用途。

背景技術(shù)：
癌癥，亦稱惡性腫瘤(Malignantneoplasm)，為由控制細(xì)胞生長增殖機制失常而引起的疾病。癌細(xì)胞除了生長失控外，還會局部侵入周遭正常組織甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部分。惡性腫瘤由于分化不成熟、生長較快，浸潤破壞器官的結(jié)構(gòu)和功能，并可發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而對機體影響嚴(yán)重。惡性腫瘤除可引起與上述良性腫瘤相似的局部壓迫和阻塞癥狀外，還可有發(fā)熱、頑固性疼痛，晚期可出現(xiàn)嚴(yán)重消瘦、乏力、貧血和全身衰竭的狀態(tài)。異位內(nèi)分泌綜合征：一些非內(nèi)分泌腺腫瘤能產(chǎn)生和分泌激素或激素類物質(zhì)，引起內(nèi)分泌紊亂的臨床癥狀，這種腫瘤稱為異位內(nèi)分泌性腫瘤，其所引起的臨床癥狀稱為異位內(nèi)分泌綜合征。此類腫瘤多為惡性腫瘤，以癌居多，如胃癌、肝癌、結(jié)腸癌，也可見于肉瘤如纖維肉瘤、平滑肌肉瘤等。此外APUD系統(tǒng)(彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng))的腫瘤，也可產(chǎn)生生物胺或多肽激素，如類癌、嗜鉻細(xì)胞瘤等。由于腫瘤的產(chǎn)物(包括異位激素產(chǎn)生)或異常免疫反應(yīng)(包括交叉免疫、自身免疫和免疫復(fù)合物沉積等)引起內(nèi)分泌、神經(jīng)、造血、消化、骨關(guān)節(jié)、腎臟、皮膚等系統(tǒng)發(fā)生病變，引起相應(yīng)的臨床癥狀，稱為副腫瘤綜合癥狀。肺癌是肺部最常見的惡性腫瘤。世界衛(wèi)生組織調(diào)查報告，許多國家和地區(qū)，肺癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的首位。男性多于女性，男女之比約為4-8:1。城市多于農(nóng)村。年齡多在40歲以上，少數(shù)病人在40歲以下。絕大多數(shù)的肺癌起源于支氣管粘膜上皮，故稱支氣管肺癌。肺癌是它簡稱或通常稱呼。肺癌的治療以外科手術(shù)切除為首選。原發(fā)癌腫局限在支氣管肺內(nèi)，尚未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，手術(shù)后5年生存率可達50％以上。但多數(shù)病人在第一次來外科就診時病變已屬晚期，多數(shù)病人已失去根治性切除之機會，因此，早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷及早期治療仍是當(dāng)前醫(yī)者的重要任務(wù)和責(zé)任。癌癥治療方法：1、外科手術(shù)治療：切除癌變組織。2、放射療法：利用高能電磁輻射線作用于生命體，使生物分子結(jié)構(gòu)改變，達到破壞癌細(xì)胞目的。放射能夠治療癌癥是因為癌細(xì)胞對放射線敏感。目前臨床上應(yīng)用的放射線有X線治療和r線治療兩種。3、化學(xué)療法：將藥物經(jīng)血管帶到全身，對身體所有細(xì)胞都有影響。這種療法有時也稱為“胞毒療法”，因為所用藥物都是有害的，甚至是帶毒性的，體內(nèi)細(xì)胞，無論是否惡性細(xì)胞，都受到破壞。4、中醫(yī)治療癌癥現(xiàn)在已經(jīng)被國內(nèi)外醫(yī)療專家廣泛的認(rèn)可，大量的臨床試驗及科研結(jié)果已經(jīng)證實了中醫(yī)治療癌癥的效果。姜葉三七為姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖及塊根。具清熱，利濕，止痛，解毒，止血之功效，用于淋濁，胃痛，口瘡，痔瘡，潰瘍，跌打損傷，蛇咬傷，外傷出血等癥，為廣西特色中藥材?！拔覈扑幱弥参镅芯竣鼋邠]發(fā)油化學(xué)成分分析”(發(fā)表于《色譜》1984年第1卷第1期)，用氣液色譜和氣液色譜-質(zhì)譜法對姜三七揮發(fā)油各成分進行分享和鑒定，鑒定出二氫姜三七酮、α-蒎烯、茨烯、β-蒎烯、蒈烯、檸檬烯、桉葉素、芳樟醇、樟腦、α-胡椒烯、反-丁香烯、香樹烯、γ-衣蘭油烯、杜松烯、姜三七醌等15種成分。申請?zhí)枮镃N200510098945.2“一種姜葉三七的外用藥”，公開了由姜葉三七、鉆石風(fēng)、倒生蓮、滇崖爬藤、五角楓根、無腺磷木、絡(luò)石藤、乙醇組成的一種外用藥，對風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打瘀痛、跌打損傷、外傷出血、關(guān)節(jié)疼痛、筋骨扭傷疼痛、筋骨疼痛、瘀腫疼痛、腰膝疼痛、關(guān)節(jié)酸痛、外傷瘀痛、軟組織挫傷療效確切，療程更短，效果更佳。此外，公開號為CN1814229的專利申請“一種土千年健祛濕鎮(zhèn)痛藥酒”、公開號為CN1742972的專利申請“一種四葉細(xì)辛外用藥”、公開號為CN1814230的專利申請“一種山野豌豆活絡(luò)鎮(zhèn)痛藥”、公開號為CN1814228的專利申請“一種矮人陀活絡(luò)傷濕止痛膏”、公開號為CN101766729的專利申請“祛濕止痛液及穴敷治療方法”均提及姜葉三七或土田七在跌打損傷或風(fēng)濕疾病方面的治療效果。在現(xiàn)有公開文獻中，或提到姜葉三七的揮發(fā)油成分，或提到姜葉三七治療跌打損傷等疾病的效果，但未見公開使用姜葉三七、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物及姜葉三七揮發(fā)油用于治療腫瘤、各種癌癥的效果，尚未有人對姜葉三七治療腫瘤、癌癥作過全面的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供姜葉三七植物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用；本發(fā)明的目的是提供姜葉三七提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用；本發(fā)明的目的是提供姜葉三七揮發(fā)油提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用；本發(fā)明的另一目的是提供姜葉三七揮發(fā)油的制備方法。姜葉三七為姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖、塊根。秋末冬初葉片枯黃后采挖，除去雜質(zhì)，洗凈，置沸水中稍燙，曬干。收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1990年版第8頁。姜葉三七的別名有三七姜、姜葉三七、土田七、竹葉三七、姜葉三七、雞心七、紅沙姜、尖三七、拖顛槍(壯族)、內(nèi)消子、打不死等。根據(jù)發(fā)明人對姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物以及姜葉三七揮發(fā)油進行臨床研究和藥效學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物以及姜葉三七揮發(fā)油能夠通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、影響腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，以及影響癌細(xì)胞周期的改變，呈現(xiàn)G1期阻滯，達到抗腫瘤活性、治療癌癥的功效。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人通過對姜葉三七揮發(fā)油的有效成分進行有目的提取及含量控制以后，使其用于治療和/或預(yù)防癌癥的效果更顯著。本發(fā)明專利臨床應(yīng)用的安全性較高，在癌癥特別是肺癌的藥物治療中不失為一種好藥，其拓寬了中藥制劑治療癌癥、尤其是肺癌的新方法，在不能開展介入治療的基層醫(yī)院尤為適用。因此，申請人提供姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物、姜葉三七揮發(fā)油用于制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物方面的新用途。本發(fā)明公開了姜葉三七提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七提取物的制備包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加水煎煮提取兩次，第一次加入藥材重量2-6倍量的水煎煮，沸騰后煮1-3小時，第二次加入藥材重量1-4倍量的水煎煮1-3小時，過濾，混合兩次煎煮液，濃縮至藥材總重量的0.5-2倍，即得。本發(fā)明公開了姜葉三七提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七提取物的制備還包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加入乙醇回流提取2-3次，第一次加入2-6倍體積百分比為40-70％的乙醇，提取1-3小時，第二次加入1-4倍量體積百分比為40-70％的乙醇提取1-3小時，合并煎液，過濾，回收乙醇，制成干膏，即得。本發(fā)明還公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加石油醚回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的石油醚，提取時間為1-3小時，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加乙酸乙酯回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的乙酸乙酯，提取時間為1-3小時，合并提取液，過濾，回收乙酸乙酯，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加水飽和正丁醇回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的水飽和正丁醇，提取時間為1-3小時，合并提取液，過濾，回收水飽和正丁醇，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加乙醇回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍、體積百分比為30-50％的乙醇，提取時間為1-3小時，合并提取液，過濾，回收乙醇，得濃縮液。所述濃縮液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量為濃縮液體積的3-5倍，收集石油醚相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。所述濃縮液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量為濃縮液體積的3-5倍，收集石油醚相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。所述濃縮液加水飽和正丁醇分3次萃取，每次水飽和正丁醇用量為濃縮液體積的3-5倍，收集水飽和正丁醇相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七揮發(fā)油組合物在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七揮發(fā)油中含有活性成份，該活性成份由姜葉三七提取的姜葉三七揮發(fā)油活性成份組成，其中包括單萜類化合物，單萜氧化物類化合物，倍半萜類化合物，倍半萜氧化物類化合物。優(yōu)選地，所述的姜葉三七揮發(fā)油活性成份包括：20-30重量份的3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，8-20重量份的莰烯；6-15重量份的1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮，2-8重量份的香樹烯；1-6重量份的氧化石竹烯。更優(yōu)選地，所述的姜葉三七揮發(fā)油活性成份含量包括：24-28重量份的3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，11-15重量份的莰烯；8-12重量份的1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮，3-6重量份的香樹烯；2-5重量份的氧化石竹烯。申請人還提供了一種制備所述姜葉三七揮發(fā)油的方法，它包括如下步驟：取姜葉三七粉碎成粗粉，加入藥材總重量3-7倍的蒸餾水浸泡0.5-3小時，通過水蒸汽蒸餾提取3-6小時，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油。優(yōu)選地，姜葉三七揮發(fā)油的制備包括以下步驟：取姜葉三七粉碎，加藥材總重量5倍的蒸餾水浸泡1h，通過水蒸汽蒸餾提取4h，收集上層精油得姜葉三七揮發(fā)油組合物。基于上述姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物、姜葉三七揮發(fā)油，本發(fā)明的目的是提供以上組合物的一種新用途，即在制備治療和/或預(yù)防癌癥藥物的應(yīng)用，特別是制備治療和/或預(yù)防肺癌藥物的應(yīng)用。它可以制成注射液、注射用粉針劑，注射用凍干粉針劑、片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、合劑、糖漿劑、膠囊劑、滴丸劑制劑，優(yōu)選制成注射液、注射用凍干粉針劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。以下是本發(fā)明中藥制劑的藥材來源：姜葉三七：姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖及塊根。本發(fā)明公開了姜葉三七在治療癌癥中的新用途，姜葉三七原植物和常規(guī)工藝提取物對于治療癌癥有一定的治療效果，結(jié)果可見實驗例1和實驗例2，并且，姜葉三七毒性小，不會產(chǎn)生諸如化療之類的強烈副作用。姜葉三七的揮發(fā)油提取物具有更加出色的療效，如實驗例所示的細(xì)胞實驗，其濃度在120μg/ml時，就已經(jīng)具有了明顯的活性，在24小時或36小時對腫瘤細(xì)胞的抑制率超過了對照藥物組，而其濃度在360μg/ml以上時，其殺滅癌細(xì)胞的活性更是能夠超過90％。附圖說明圖1是姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細(xì)胞株(CNE-2)增殖抑制率線圖圖2是姜葉三七揮發(fā)油對肺癌細(xì)胞株(A549)增殖抑制率線圖圖3是姜葉三七揮發(fā)油對肝癌細(xì)胞株(HepG2)增殖抑制率線圖圖4是姜葉三七揮發(fā)油對乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)增殖抑制率線圖圖5是姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2凋亡的形態(tài)變化圖6是姜葉三七揮發(fā)油對肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡的形態(tài)變化圖7是姜葉三七揮發(fā)油對肺癌細(xì)胞株A549凋亡的形態(tài)變化圖8是姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細(xì)胞株(CNE-2)早期凋亡AnnexinV-PI雙染色法熒光散點圖圖9姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細(xì)胞株(CNE-2)凋亡率條形圖圖10是姜葉三七揮發(fā)油對肺癌細(xì)胞株(A549)早期凋亡AnnexinV-PI雙染色法熒光散點圖圖11是姜葉三七揮發(fā)油對肺癌細(xì)胞株(A549)凋亡率條形圖圖12是姜葉三七揮發(fā)油對肝癌細(xì)胞株(HepG2)早期凋亡AnnexinV-PI雙染色法熒光散點圖圖13是姜葉三七揮發(fā)油對肝癌細(xì)胞株(HepG2)凋亡率條形圖圖14是姜葉三七揮發(fā)油對乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)早期凋亡AnnexinV-PI雙染色法熒光散點圖圖15是姜葉三七揮發(fā)油對乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)凋亡率條形圖圖16是姜葉三七揮發(fā)油對CNE-2細(xì)胞周期的影響圖17是姜葉三七揮發(fā)油對A549細(xì)胞周期的影響圖18是姜葉三七揮發(fā)油對HepG2細(xì)胞周期的影響圖19是姜葉三七揮發(fā)油對MCF-7細(xì)胞周期的影響具體實施方式下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)(乙醇為體積百分比)。實施例1：姜葉三七揮發(fā)油取新鮮姜葉三七150g粉碎成粗粉，加藥材450ml的蒸餾水浸泡0.5h，通過水蒸汽蒸餾提取3h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油1.7ml。對所得姜葉三七揮發(fā)油進行檢測，成分含量結(jié)果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為24％，莰烯為15％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為12％，香樹烯為3％；氧化石竹烯為2％。實施例2：姜葉三七揮發(fā)油取新鮮姜葉三七根莖150g粉碎，加750ml的蒸餾水浸泡1h，通過水蒸汽蒸餾提取4h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油組合物2.2ml。對所得姜葉三七揮發(fā)油進行檢測，成分含量結(jié)果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為28％，莰烯為11％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為8％，香樹烯為6％；氧化石竹烯為5％。實施例3：姜葉三七揮發(fā)油取姜葉三七干燥根莖150g粉碎，加1050ml蒸餾水浸泡3h，通過水蒸汽蒸餾提取6h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油組合物2.0ml。對所得姜葉三七揮發(fā)油進行檢測，成分含量結(jié)果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為30％，莰烯為20％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為15％，香樹烯為2％；氧化石竹烯為1％。實施例4：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加石油醚回流提取2次，第一次加入20000ml石油醚，提取2小時，第二次加入15000ml石油醚提取2小時，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例5：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加石油醚回流提取3次，第一次加入25000ml石油醚，提取3小時，第二次加入20000ml石油醚提取2小時，第三次加入15000ml石油醚提取時間為1小時，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例6：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加乙酸乙酯回流提取3次，第一次加入25000ml乙酸乙酯，提取3小時，第二次加入20000ml乙酸乙酯提取2小時，第三次加入15000ml乙酸乙酯，提取時間為1小時，合并提取液，過濾，回收乙酸乙酯，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例7：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加水飽和正丁醇回流提取3次，第一次加入25000ml水飽和正丁醇，提取3小時，第二次加入20000ml水飽和正丁醇提取2小時，第三次加入15000ml水飽和正丁醇提提取時間為1小時，合并提取液，過濾，回收水飽和正丁醇，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例8：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七干燥根莖5000g切碎，加入乙醇回流提...