專利名稱：核糖核酸及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核糖核酸及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核糖核酸是動物體內(nèi)一種生物大分子，是一種重要的免疫觸發(fā)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。1967年通過肉瘤免疫綿羊制取的淋巴細(xì)胞核糖核酸對大鼠進行試驗，發(fā)現(xiàn)核糖核酸能抑制荷瘤鼠腫瘤的生長，甚至消除，首次證實了免疫核糖核酸能傳遞免疫信息。1982年林單坤等人把從免疫羊肝中提取得到的核糖核酸做成制劑注入體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)對腫瘤與癌癥有明顯的療效并能提高機體的免疫功能，而且未出現(xiàn)不良的副作用。從脾臟中提取得到的免疫核糖核直接制成針注入體內(nèi)，可激活人體的T細(xì)胞及B細(xì)胞的活性；同時有提高人體免疫功能的作用，對一些與人體免疫功能下降有關(guān)的疾病，如慢性支氣管炎、哮喘病、慢性乙型肝等，以及胃癌、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤有顯著的療效。雖然免疫核糖核酸在國內(nèi)已經(jīng)用于臨床治療，但在生產(chǎn)工藝方面仍然存在一定的問題，給推廣帶來一定的難度。中國專利CN1116879C曾描述了從牛脾臟制備核糖核酸的方法，受當(dāng)時條件限制，有些不足1)由于工藝中使用SDS可能造成殘留，并可能使DNA從組蛋白上解離下來，造成DNA含量超標(biāo)，RNA含量為95-96％左右；2)生產(chǎn)周期過長，生產(chǎn)效率低，整個提取步驟大約需要一周時間；3)收率低，約為1g核糖核酸/公斤胰臟。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)周期短、污染小、成本低、高活性的核糖核酸制備方法。
本發(fā)明所提供的核糖核酸的制備方法，包括如下步驟1)提取原液的制備將動物胰腺小塊絞碎后移入膠體磨，加入提取緩沖液進行研磨，得到提取原液；所述提取緩沖液為0.01～0.10mol/L Tris-乙酸緩沖液，pH4～8；2)核糖核酸的提取提取原液加入0.2～10倍體積飽和酚液體的上層水相，和0.2～10倍體積的飽和酚液體的下層酚相，加熱到40～80℃，恒溫30～180分鐘；然后，在4～10℃下離心，收集上清液；所述飽和酚液體是將苯酚融化后，加入等體積的步驟1)所述提取緩沖液，攪拌均勻后得到的；上清液加入0.5～2倍體積的氯仿-異戊醇溶液，搖勻5～30分鐘，在4～10℃下離心，收集上清液；上清液加入0.2～2倍體積氯仿-異戊醇，搖勻后在4～10℃離心，收集含核糖核酸的上層上清液，所述氯仿-異戊醇溶液中氯仿與異戊醇的體積比為10～50∶1；上清液加入0.1～1體積助沉淀緩沖液，再加入2～6倍體積95％乙醇，搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃下離心，收集得到核糖核酸沉淀；助沉淀緩沖液為1-5mol/L乙酸鈉溶液，pH為3-6。
為了能進一步提高核糖核酸的純度，減少雜質(zhì)含量，動物胰腺小塊在絞碎前，還要去除非胰腺組織。核糖核酸沉淀還以溶解緩沖液溶解，加乙醇至乙醇終濃度為50～85％，在4～10℃離心；然后，以70-80％乙醇洗滌，并在4～10℃下離心；所述溶解緩沖液為0.5-1M NaCl溶于0.025-0.075M Tris-HCl緩沖液中，pH9.5。在制備過程中，離心的加速度為2000～10000g，優(yōu)選為4000g。
應(yīng)用本發(fā)明所制備的核糖核酸，還可以制備出一種注射用核糖核酸凍干制劑。
該注射用核糖核酸凍干制劑，是按如下過程制備的a)制備注射用核糖核酸中間體將核糖核酸和右旋糖酐混合，攪拌均勻，控制溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5～7.5，其中，核糖核酸和右旋糖酐的重量比為1∶1～3；然后，加入溶液重量0.1～0.8％的活性炭，混勻、脫色，加注射用水至所需量，使得溶液中核糖核酸濃度為20～30g/L，右旋糖酐濃度為30～60g/L；再依次經(jīng)孔徑為0.3-0.5μm的第一微孔濾膜及孔徑為0.1-0.3μm的第二微孔濾膜過濾除菌，得到注射用核糖核酸中間體；b)病毒滅活將所得注射用核糖核酸中間體在50～80℃恒溫6～12小時，滅活病毒；c)凍干將經(jīng)病毒滅活后的注射用核糖核酸中間體放置凍干箱中，-50至-30℃預(yù)凍2～3小時，-30至-20開始升華，真空度≤20Pa；然后，在20-40℃干燥，得到所述注射用核糖核酸凍干制劑。
優(yōu)選的，第一微孔濾膜的孔徑為0.45μm；第二微孔濾膜的孔徑為0.22μm。
本發(fā)明采用氯仿-異丙醇為提取溶劑，能有效提取出動物胰腺中的核糖核酸，該提取過程的生產(chǎn)周期短，基本上在16～18時間內(nèi)即可以完成提取過程；提取率高，能達到3.0～4.8g核糖核酸/kg胰臟的收率，相比現(xiàn)有技術(shù)所提取的核糖核酸，提高了1～2倍，成本降低70％左右；產(chǎn)品的純度高，其中RNA含量在98-99.7％左右；應(yīng)用所制備的核糖核酸來生產(chǎn)注射用核糖核酸凍干制劑，產(chǎn)品經(jīng)過病毒滅活步驟，安全性更易于保證。
具體實施例方式
實施例1、制備核糖核酸一、配制溶液(1)提取緩沖液(0.02M Tris-乙酸緩沖液)900ml純化水，加2.42克Tris，用乙酸調(diào)pH5.0，定容至1000ml。
(2)飽和酚液體將苯酚在50℃融化，加入等體積提取緩沖液，攪拌均勻制成飽和酚溶液，避光保存。
(3)助沉淀緩沖液3M乙酸鈉溶液，pH5.0(4)溶解緩沖液1M NaCl溶于0.05M Tris-HCl緩沖液中，pH9.5。
二、提取過程1、原材料選擇和預(yù)處理取小牛(1歲半以下)胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及結(jié)締組織等非胰腺組織，用純化水清洗干凈，切成3～5cm小塊。
2、組織及細(xì)胞的破碎用干凈絞肉機將胰腺小塊絞碎，將絞碎的小牛胰腺移入膠體磨中，加入等量提取緩沖液，第一次以200μm破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液應(yīng)較易通過200目不銹鋼網(wǎng)，得到100kg左右的勻漿液。
3、有效成份提取勻漿液加入1倍體積飽和酚液體的上層水相，加入0.5倍體積飽和酚液體的下層酚相，加熱到60℃，恒溫120分鐘，迅速冷卻，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集上清液，棄去沉淀(回收苯酚)。
上清液加入0.6倍體積氯仿-異戊醇(體積比24∶1)，搖勻15分鐘，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集上層的上清液，棄去中間層沉淀，回收底層氯仿層。
上清液加入0.3倍體積氯仿-異戊醇(體積比24∶1)，搖勻15分鐘，在4～10℃離心4000g，30分鐘)，收集含核糖核酸的上層上清液，棄去中間層沉淀，回收底層氯仿層。
上清液加入1倍體積助沉淀緩沖液，再加入2倍體積乙醇(95％)，搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集核糖核酸沉淀，上層的上清液為乙醇，回收乙醇。
為了能進一步提高核糖核酸的純度，減少雜質(zhì)含量，核糖核酸沉淀以溶解緩沖液溶解，加入乙醇至終濃度75％(質(zhì)量)，在4～10℃下離心(4000g，30分鐘)。
用75％乙醇反復(fù)洗滌沉淀2次，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集核糖核酸沉淀，置50℃水中放置到無醇味(約1小時)。
以上過程提取過程可在16～18時間內(nèi)完成，核糖核酸的提取率為3.8g/kg胰臟，較已有的核糖核酸提取工藝大大縮短了提取時間，產(chǎn)量提高1～2倍。在核糖核酸提取過程中，總會帶有少量DNA雜質(zhì)，由于DNA分子一般均比較大，注射時會間接引起過敏反應(yīng)。本發(fā)明由于核糖核酸提取效率的提高，核糖核酸產(chǎn)品中RNA含量在99.7％左右，純度OD260/OD280＞1.9，相比現(xiàn)有技術(shù)所提取得到的產(chǎn)品(RNA含量為95-96％)，產(chǎn)品純度有了很大的提高，脫氧核糖核酸“污染”含量降低，能提高產(chǎn)品安全性；并且，提取過程批成品率提高30％左右，批報廢率由30％降低到零，成本降低70％左右。
實施例2、制備核糖核酸一、配制溶液(1)提取緩沖液(0.06M Tris-乙酸緩沖液)900ml純化水，加7.26克Tris，用乙酸調(diào)pH7.0，定容至1000ml。
(2)飽和酚液體將苯酚在50℃融化，加入等體積提取緩沖液，攪拌均勻制成飽和酚溶液，避光保存。
(3)助沉淀緩沖液3M乙酸鈉溶液，pH5.0(4)溶解緩沖液1M NaCl溶于0.05M Tris-HCl緩沖液中，pH9.5。
二、提取過程1、原材料選擇和預(yù)處理取仔豬(6-10月)胰腺50公斤在25℃左右去筋膜、脂肪及結(jié)締組織等非胰腺組織，用純化水清洗干凈，切成3～5cm小塊。
2、組織及細(xì)胞的破碎用干凈絞肉機將胰腺小塊絞碎，將絞碎的仔豬胰腺移入膠體磨中，加入等量提取緩沖液，第一次以200μm破碎研磨，第二次以50μ研磨，真空下，研磨液應(yīng)較易通過200目不銹鋼網(wǎng)，得到125kg左右的勻漿液。
3、有效成份提取勻漿液加入8倍體積飽和酚液體的上層水相，加入0.4倍體積飽和酚液體的下層酚相，加熱到60℃，恒溫120分鐘，迅速冷卻，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集上清液，棄去沉淀(回收苯酚)。
上清液加入1.5倍體積氯仿-異戊醇(體積比30∶1)，搖勻15分鐘，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集上層的上清液，棄去中間層沉淀，回收底層氯仿層。
上清液加入1倍體積助沉淀緩沖液，再加入4倍體積乙醇(95％)，搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集核糖核酸沉淀，上層的上清液為乙醇，回收乙醇。
為了能進一步提高核糖核酸的純度，減少雜質(zhì)含量，核糖核酸沉淀以溶解緩沖液溶解，加入乙醇至終濃度75％(質(zhì)量)，在4～10℃下離心(4000g，30分鐘)。
用75％乙醇反復(fù)洗滌沉淀2次，在4～10℃離心(4000g，30分鐘)，收集核糖核酸沉淀，置50℃水中放置到無醇味(約1小時)。
以上過程提取過程可在16～18時間內(nèi)完成，核糖核酸的提取率為4.8g/kg胰臟，較已有的核糖核酸提取工藝大大縮短了提取時間，產(chǎn)量提高1～2倍；核糖核酸產(chǎn)品中RNA含量在99％左右。
實施例3、制備注射用核糖核酸1、制備注射用核糖核酸中間體取核糖核酸(實施例1提取得到)50g，加入右旋糖酐90g，加入1800ml的水，攪拌均勻，用1mol/L Tris溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5～7.5(20℃～22℃)。加入溶液重量0.1％的針用活性炭，混勻，40℃脫色15分鐘。添加注射用水至2000ml，經(jīng)0.45μm微孔濾膜精濾及0.22μm微孔濾膜過濾除菌至澄明，得到注射用核糖核酸中間體。測定其pH值為7.2，含量為25mg/ml，細(xì)菌內(nèi)毒素＜10EU。
2、病毒滅活(巴氏滅活)取注射用核糖核酸中間體，60℃10小時恒溫，滅活病毒。
3、制備注射用核糖核酸按含量要求，將藥液灌裝于西林瓶中，放置凍干箱中，-40℃預(yù)凍2～3小時，-30℃開始升華，約15h，真空度≤20Pa。干燥溫度約30℃，經(jīng)約5h后，干燥(殘留水分≤3.0％)，得到注射用核糖核酸制劑。
二、產(chǎn)品檢測1、光譜學(xué)特征在190～360nm波長范圍，對所得注射用核糖核酸中間體進行紫外吸收掃描，結(jié)果顯示在258nm有最大吸收，在230nm吸收峰最小，A260/A230、A260/A280的比值分別達到2.1和1.9以上，巴氏滅活后光譜學(xué)特征沒有改變。
2、RNA特性RNA中的核糖與酸作用生成糠醛，后者再與3，5二羥基甲苯作用產(chǎn)生綠色物質(zhì)。根據(jù)這一特性，取3，5二羥基甲苯鹽酸溶液，在80℃水浴中加熱，進行RNA特性檢測。結(jié)果表明，所得注射用核糖核酸中間體有綠色反應(yīng)，說明病毒滅活后RNA特性沒有改變。
3、增色效應(yīng)RNA在強堿溶液中可使核酸鏈斷裂、吸光度增加的原理，做了增色效應(yīng)檢測，注射用核糖核酸中間體增色效應(yīng)達到35％以上，進行病毒滅活后增色效應(yīng)有1～2％減小，仍符合國藥標(biāo)準(zhǔn)大于20％的質(zhì)量要求。
4、病毒滅活效果取出液氮內(nèi)凍存的BHK21細(xì)胞，置37℃水浴，全融后開封，移入含MEM營養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃培養(yǎng)，使細(xì)胞長成單層，傳代培養(yǎng)。病毒滴度采用細(xì)胞病變培養(yǎng)法，在96孔板上進行滴定，樣品用MEM營養(yǎng)液10倍系列稀釋，每一稀釋度接種6孔，滴定結(jié)果按karber法計算TCID50。
取注射用核糖核酸中間體900ml，分別加入指示病毒100ml，混勻，取出30ml作病毒滅活前陽性病毒滴度檢測。然后在60℃10小時恒溫滅活病毒，分別在30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時取樣，用0.22μm膜除菌后密封，-65℃保存，同時設(shè)藥液陰性對照組，測定病毒滴度。
結(jié)果表明，經(jīng)病毒滅活后，滅活液中均未檢測出病毒，經(jīng)盲傳三代，亦均未見特異性細(xì)胞病變(CPE)，這表明所采用的滅活方法的滅活效率高，能夠保障產(chǎn)品的安全性。
5、產(chǎn)品活性測定目前，如何對核糖核酸生物活性進行檢測，尚未得到滿意的解決方案。正常白細(xì)胞都具有粘附于玻璃、塑料表面的特性，但在特異因子作用下，正常白細(xì)胞的這種粘附能力可顯著降低，這種反應(yīng)稱為白細(xì)胞粘附抑制反應(yīng)，一般以抑制率＞20％為有意義。本發(fā)明采用正常白細(xì)胞給予一定濃度核糖核酸來誘發(fā)白細(xì)胞的粘附抑制反應(yīng)，通過小鼠白細(xì)胞粘附的抑制率來表征核糖核酸的生物活性，抑制率越高，說明核糖核酸的生物活性越高。
1)溶液配制培養(yǎng)液 含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，用Hepes和碳酸氫鈉調(diào)節(jié)PH值至7.2～7.4，過濾除菌后-20℃保存。
紅細(xì)胞分離液(0.83％NH4Cl-Tris緩沖溶液)0.17mol/L Tris(20.60g/1000ml)10.0ml與0.16mol/L NH4Cl(8.30g/1000ml)90.0ml混勻，用1mol/L HCl調(diào)pH至7.2，4℃保存?zhèn)溆谩?br>
供試品溶液取注射用核糖核酸凍干制劑(實施例3制備)，用培養(yǎng)液制成每1ml中含核糖核酸5mg的溶液，作為供試品溶液；對照組溶液培養(yǎng)液。
2)小鼠脾細(xì)胞懸液的制備取小鼠拉脫頸椎或放血而死，用碘酒、酒精處理皮毛。剪開皮膚，打開腹腔。在胃底部找到紅色的脾，用鑷子分離后摘除。
脾經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后，置50～300(200)目不銹鋼網(wǎng)上，用剪刀剪成數(shù)塊，用注射器柄擠壓研磨，低速離心(1000r/min)，懸起沉淀部分即得脾細(xì)胞懸液。若其中有較多紅細(xì)胞，可將脾細(xì)胞懸液放在5ml預(yù)冷的0.83％NH4Cl-Tris緩沖溶液中，置37℃水浴中10min，低速離心(1000r/min)收集沉淀白細(xì)胞。
3)測定方法在96孔培養(yǎng)板中進行，供試品孔及對照組孔各做三孔。
每孔各加溶液50μl，然后每孔加小鼠脾細(xì)胞懸液50μl；將培養(yǎng)板于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃孵化2小時，使細(xì)胞在培養(yǎng)板底部粘附，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，用震蕩器在低強度下?lián)u30～60秒，將未粘附細(xì)胞搖起，吸出上清液(組間再震蕩一次保證均勻)，移至另一孔，每孔再加入培養(yǎng)液液50μl按上法洗一次，將洗液與上清液合并(注意勿起氣泡)，在酶標(biāo)儀上，在405nm波長下測定每孔的吸收值，作為粘附后細(xì)胞的吸收值。
另取溶液50μl，加小鼠脾細(xì)胞懸液50μl混勻，再加50μl培養(yǎng)液，在405nm波長下測定吸收度值，做為粘附前細(xì)胞的吸收值。
按下式計算粘附率和粘附抑制率粘附率＝(粘附前細(xì)胞的吸收度值-粘附后細(xì)胞的吸收度值)/粘附前細(xì)胞吸收度值×100％
粘附抑制率＝(對照品粘附率-供試品粘附率)/對照粘附率×100％4)測定結(jié)果對照組粘附率＝(對照組粘附前細(xì)胞的吸收度值-對照組粘附后細(xì)胞的吸收度值)/對照組粘附前細(xì)胞吸收度值×100％＝1.405-0.912/1.405＝35％供試品粘附率＝(供試品粘附前細(xì)胞的吸收度值-供試品粘附后細(xì)胞的吸收度值)/供試品粘附前細(xì)胞吸收度值×100％＝0.701-0.528/0.701＝24.6％粘附抑制率＝(對照組粘附率-供試品粘附率)/對照組粘附率×100％＝35％-24.6％/35％＝29.7％以上結(jié)果說明，本發(fā)明所提取的核糖核酸具有良好的活性。
現(xiàn)有技術(shù)提取(中國專利CN1116879C)的核糖核酸的粘附抑制率為17-23％。
權(quán)利要求
1.核糖核酸的制備方法，包括如下步驟1)提取原液的制備將動物胰腺小塊絞碎后移入膠體磨，加入提取緩沖液進行研磨，得到提取原液；所述提取緩沖液為0.01～0.10mol/L Tris-乙酸緩沖液，pH4～8；2)核糖核酸的提取提取原液加入0.2～10倍體積飽和酚液體的上層水相，和0.2～10倍體積的飽和酚液體的下層酚相，加熱到40～80℃，恒溫30～180分鐘；然后，在4～10℃下離心，收集上清液；所述飽和酚液體是將苯酚融化后，加入等體積的步驟1)所述提取緩沖液，攪拌均勻后得到的；上清液加入0.5～2倍體積的氯仿-異戊醇溶液，搖勻5～30分鐘，在4～10℃下離心，收集上清液；上清液加入0.2～2倍體積氯仿-異戊醇，搖勻后在4～10℃離心，收集含核糖核酸的上層上清液，所述氯仿-異戊醇溶液中氯仿與異戊醇的體積比為10～50∶1；上清液加入0.1～1體積助沉淀緩沖液，再加入2～6倍體積95％乙醇，搖勻，4℃放置過夜，在4～10℃下離心，收集得到核糖核酸沉淀；助沉淀緩沖液為1-5mol/L乙酸鈉溶液，pH為3-6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述動物胰腺小塊在絞碎前，還要去除非胰腺組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述核糖核酸沉淀還以溶解緩沖液溶解，加乙醇至乙醇終濃度為50～85％，在4～10℃離心；然后，以70-80％乙醇洗滌，并在4～10℃下離心；所述溶解緩沖液為0.5-1M NaCl溶于0.025-0.075MTris-HCl緩沖液中，pH9.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2活3所述的制備方法，其特征在于所述離心的加速度為2000～10000g。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述離心的加速度為4000g。
6.權(quán)利要求1～5任一所述制備方法得到的核糖核酸。
7.一種注射用核糖核酸凍干制劑，是按如下過程制備的a)制備注射用核糖核酸中間體將核糖核酸和右旋糖酐混合，攪拌均勻，控制溶液調(diào)節(jié)pH值為6.5～7.5，其中，核糖核酸和右旋糖酐的重量比為1∶1～3；然后，加入溶液重量0.1～0.8％的活性炭，混勻、脫色，加注射用水至所需量，使得溶液中核糖核酸濃度為20～30g/L，右旋糖酐濃度為30～60g/L；再依次經(jīng)孔徑為0.3-0.5μm的第一微孔濾膜及孔徑為0.1-0.3μm的第二微孔濾膜過濾除菌，得到注射用核糖核酸中間體；b)病毒滅活將所得注射用核糖核酸中間體在50～80℃恒溫6～12小時，滅活病毒；c)凍干將經(jīng)病毒滅活后的注射用核糖核酸中間體放置凍干箱中，-50至-30℃預(yù)凍2～3小時，-30至-20開始升華，真空度≤20Pa；然后，在20-40℃干燥，得到所述注射用核糖核酸凍干制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的注射用核糖核酸凍干制劑，其特征在于第一微孔濾膜的孔徑為0.45μm；第二微孔濾膜的孔徑為0.22μm。
全文摘要
本發(fā)明公開了核糖核酸及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的核糖核酸的制備方法，是將新鮮胰臟加入水勻漿，勻漿液與飽和苯酚混勻、攪拌，徹底破碎細(xì)胞，變性蛋白質(zhì)，離心分離水相，水溶液加入氯仿抽提，離心分離水相，水相加入乙醇沉淀核糖核酸。本發(fā)明采用氯仿－異丙醇為提取溶劑，能有效提取出牛胰腺中的核糖核酸，該提取過程的生產(chǎn)周期短，提取過程可在16～18時間內(nèi)完成，核糖核酸的提取率為3.0～4.8g/kg胰臟，純度OD260/OD280＞1.9，較已有的核糖核酸提取工藝大大縮短了提取時間，產(chǎn)量提高1～2倍，由于核糖核酸提取效率的提高，脫氧核糖核酸“污染”含量降低，批成品率提高30％左右，批報廢率由30％降低到零，成本降低70％左右；產(chǎn)品經(jīng)過病毒滅活步驟，安全性更易于保證。
文檔編號A61P37/02GK101058595SQ20071009998
公開日2007年10月24日 申請日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者孫德軍, 霍英, 李夏, 李秉安, 禹學(xué)軍 申請人:吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司