血管新生誘導(dǎo)劑的制作方法

專(zhuān)利名稱：血管新生誘導(dǎo)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以作為藥物組合物使用的血管新生誘導(dǎo)劑。
背景技術(shù)：
血管新生，是指從現(xiàn)有的血管形成小血管的現(xiàn)象，至今有很多研究者正在對(duì)血管新生的機(jī)理進(jìn)行研究。血管新生，涉及到癌的增大及轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜癥和炎癥性疾病(慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的發(fā)展，尤其出現(xiàn)了很多以治療癌癥為目的抑制血管新生的研究。另一方面，近年來(lái)出現(xiàn)了對(duì)于被稱為“血管新生療法”的新的治療方法的研究，該療法通過(guò)利用并促進(jìn)血管新生作用，積極向缺血組織周邊供給充足的血液而保護(hù)缺血組織，從而治療患處。
對(duì)于缺血性疾病的藥物療法，缺血的改善效果并不明顯，對(duì)于這樣的藥物治療不應(yīng)性的缺血性病例，需要實(shí)施旁通手術(shù)等血行再建術(shù)。但是，也有不少因?yàn)槟X血管障礙或腎功能障礙等并發(fā)癥而不能實(shí)施血行再建術(shù)的病例。而且，循環(huán)系統(tǒng)疾病，例如，以閉塞性動(dòng)脈硬化癥或伯格氏病為代表的末梢血管疾病沒(méi)有有效的治療方法，在難以進(jìn)行血管擴(kuò)張術(shù)及外科血行再建術(shù)時(shí)，不得不截?cái)嘞轮?。作為這樣嚴(yán)重的缺血性病例及循環(huán)系統(tǒng)疾病的新的治療方法，促進(jìn)血管新生，形成新的血管的血管新生療法是很有效的。但是，這些技術(shù)還沒(méi)有達(dá)到實(shí)用化，急需開(kāi)發(fā)一種有效且安全地誘導(dǎo)血管新生的優(yōu)良藥劑。
在血管新生療法中作為具體開(kāi)發(fā)的一例，可以例舉利用胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)等的血管形成技術(shù)的研究(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)，但是其培養(yǎng)法、分化誘導(dǎo)法及分化細(xì)胞的取得方法等應(yīng)具備的技術(shù)還不完善，沒(méi)有達(dá)到實(shí)用化。
另外如同上面所述，也進(jìn)行了將從人類(lèi)骨髓液中分離的骨髓單核細(xì)胞直接導(dǎo)入治療部位，形成血管新生的自體骨髓細(xì)胞移植法(例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)的研究。但是，在該方法中，需要對(duì)患者實(shí)施全身麻醉而收取大量的骨髓液，因此不能避免對(duì)患者身體的負(fù)擔(dān)及危險(xiǎn)。進(jìn)而存在極其難以控制導(dǎo)入的細(xì)胞分化的問(wèn)題。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)在生物體中導(dǎo)入在外科手術(shù)等中可以用作止血?jiǎng)┑葘?duì)生物體安全的纖維蛋白，可以在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生的技術(shù)至今沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)。而且，本發(fā)明為充分明確其機(jī)理，沒(méi)有必要必須使用可能因給藥產(chǎn)生副作用的生長(zhǎng)因子，而且不會(huì)對(duì)患者造成采取骨髓液等外科負(fù)擔(dān)，從而更加安全。另外，纖維蛋白在生物體內(nèi)具有優(yōu)良的附著性，在生物體內(nèi)施用時(shí)，在患處等目的部位可以容易達(dá)到固定化。
因此，通過(guò)利用本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)，可以實(shí)現(xiàn)在患處周邊形成血管而供給充足的血液，治療患處的在臨床及成本方面都非常實(shí)用的血管新生療法。
平島、片岡等(Hiarshima M.，Kataoka H.等)，“體外脈管形成模式中胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的成熟(Maturation of embryonic stemcells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis.)”，血液(Blood)，美國(guó)血液學(xué)會(huì)(American Society of Hematology)，(美國(guó))，1999年2月15日，93卷，4號(hào)，1253-1263頁(yè)。
田壽文、室原豐明，“利用自體骨髓細(xì)胞移植的血管再生治療”，再生醫(yī)學(xué)再生治療現(xiàn)代化學(xué)增刊，(株)東京化學(xué)同人，2002年7月1日，41卷，102-108頁(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供對(duì)生物體安全的血管新生誘導(dǎo)劑。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供的由纖維蛋白構(gòu)成的血管新生誘導(dǎo)劑，通過(guò)在臟器或組織內(nèi)施用對(duì)生物體安全且具有優(yōu)良的生物體附著性的纖維蛋白，形成血管新生。進(jìn)而本發(fā)明的目的是提供用于再生治療的血管新生誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明者在潛心研究中，意外發(fā)現(xiàn)通過(guò)在生物體內(nèi)給藥纖維蛋白，可以誘導(dǎo)血管新生的新方法。而且，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在生物體內(nèi)給藥纖維蛋白，可以利用其血管新生誘導(dǎo)作用供給細(xì)胞的增殖、維持所必需的氧及營(yíng)養(yǎng)成分，而且可以使功能障礙或功能不全的生物體組織或臟器的功能再生。
本發(fā)明者以上述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)進(jìn)一步進(jìn)行研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及(1)血管新生誘導(dǎo)劑，其特征在于，含有纖維蛋白；(2)根據(jù)前述(1)所述的血管新生誘導(dǎo)劑，其特征在于，進(jìn)一步含有生物體內(nèi)分解性高分子；(3)根據(jù)前述(1)所述的血管新生誘導(dǎo)劑，進(jìn)一步含有選自骨髓單核細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、胰臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、腸細(xì)胞及胃細(xì)胞的細(xì)胞和/或由所選細(xì)胞構(gòu)成的組織；(4)根據(jù)前述(1)所述的血管新生誘導(dǎo)劑，其特征在于，進(jìn)一步含有生長(zhǎng)因子；(5)血管新生誘導(dǎo)方法，其特征在于，用纖維蛋白處理生物體；
(6)粒狀制劑，通過(guò)冷凍干燥酶分解纖維蛋白原所得的纖維蛋白而得到；(7)粒狀制劑，通過(guò)冷凍干燥酶分解纖維蛋白原所得的纖維蛋白與鈣的混合物而得到；(8)皮膚移植方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(9)皮膚疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(10)末梢血管疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(11)心臟疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(12)腦疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(13)骨疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(14)人工臟器皮下移植方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(15)呼吸器官疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(16)消化器官疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(17)內(nèi)分泌、代謝疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(18)自體免疫疾病的預(yù)防及治療方法，其特征在于，使用纖維蛋白；(19)纖維蛋白在血管新生誘導(dǎo)中的應(yīng)用。


圖1為在實(shí)施例1制備的纖維蛋白的給藥組及對(duì)照組中，皮瓣形成后第3天及第7天的皮瓣生存狀態(tài)的照片。
圖2是表示在實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的給藥組及對(duì)照組中，皮瓣形成后第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的皮瓣生存率(％)的圖。
圖3表示在實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的給藥組(a)及對(duì)照組(b)中，皮瓣形成后第7天收取各皮瓣，將該組織進(jìn)行了HE染色。(c)表示在實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的給藥組中，皮瓣形成后第50天收取皮瓣，將該組織進(jìn)行了HE染色。
圖4表示在實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的給藥組及對(duì)照組中，隨時(shí)間變化測(cè)定皮瓣形成后第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的各個(gè)皮下組織的血流量(ml/100g組織/分)。
圖5表示在實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的給藥組及對(duì)照組中，在皮瓣形成后第1天、第3天及第7天，皮瓣上的0.5cm(a)位置及1.5cm(b)位置的各皮下組織血流量的恢復(fù)率(％)。
圖6表示在實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的給藥組及對(duì)照組中，皮瓣形成后第3天及第7天的各皮瓣表皮溫度的恢復(fù)率(％)。
圖7表示在切斷了大腿動(dòng)脈的大鼠缺血模型的缺血部位給藥實(shí)施例1中制備的纖維蛋白，給藥后第5天測(cè)定該部位血流量(ml/100g組織/分)的隨時(shí)間變化的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所使用的纖維蛋白沒(méi)有特別的限定，可以為市售的纖維蛋白粉、從市售的纖維蛋白原制成的物質(zhì)、由人或動(dòng)物的血漿精制的纖維蛋白原制成的物質(zhì)。另外，也可以從利用DNA重組技術(shù)得到的纖維蛋白原的生成中所得到的含纖維蛋白原的細(xì)胞培養(yǎng)液制備纖維蛋白。而且這些纖維蛋白，優(yōu)選細(xì)粒狀冷凍干燥品，且在生理食鹽水或磷酸緩沖溶液等溶液中容易懸浮的形狀。作為市售的纖維蛋白，可以例舉根據(jù)厚生省藥務(wù)局監(jiān)修的生物學(xué)制劑標(biāo)準(zhǔn)(1979年第201～203頁(yè))制備的醫(yī)療用干燥纖維蛋白，但優(yōu)選作為止血?jiǎng)┑冗_(dá)到臨床實(shí)用化的、除去了病毒的物質(zhì)。
作為將本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑進(jìn)行給藥的對(duì)象，包括人及其他哺乳動(dòng)物。
從人或動(dòng)物的血漿分離纖維蛋白原時(shí)，從生物體適合性的角度考慮，以人為對(duì)象時(shí)優(yōu)選從人的血漿分離，或以動(dòng)物為對(duì)象時(shí)優(yōu)選從這種動(dòng)物的血漿分離。纖維蛋白原的分離方法沒(méi)有特別的限定，可以通過(guò)公知的血漿分離法進(jìn)行。通過(guò)血漿分離法得到的纖維蛋白原沉淀物的進(jìn)一步精制，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，例如，在鹽和/或氨基酸存在的條件下，利用蛋白質(zhì)沉淀物使纖維蛋白再沉淀的技術(shù)，或色譜技術(shù)(例如離子交換、親和層析、疏水性或凝膠過(guò)濾層析法)中使用任一技術(shù)，或兩種技術(shù)組合使用。優(yōu)選除去混入的血漿污染物質(zhì)，例如纖連蛋白和纖溶酶原分別利用被固定的明膠和被固定的賴氨酸吸收、除去。通過(guò)實(shí)施了這種操作的纖維蛋白原形成的纖維蛋白的自體溶解被抑制，從而可以長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定。
另外，從人或動(dòng)物的血漿制備的纖維蛋白原，優(yōu)選實(shí)施熱處理、化學(xué)處理，從而除去對(duì)生物體有害的病毒。
分離的纖維蛋白原可以懸浮在適當(dāng)?shù)乃匀軇┑戎行纬衫w維蛋白原溶液。而且也可以將該纖維蛋白原溶液冷凍干燥而制成纖維蛋白原冷凍干燥品。冷凍干燥法可以根據(jù)公知的技術(shù)進(jìn)行。
從市售的纖維蛋白原，或從人或動(dòng)物的血漿中分離的纖維蛋白原制備纖維蛋白時(shí)，優(yōu)選使用除去了病毒的高純度凝血酶制備。作為高純度的凝血酶，優(yōu)選用作臟器止血?jiǎng)┑鹊目诜媚讣?xì)粒劑等市售的藥典記載品，但是通常也可以使用具有作為凝血酶的生物活性或生理活性的物質(zhì)，例如可以使用將血漿蛋白分離而得到的物質(zhì)等。也就是說(shuō)，例如，也可以精制使用，在Ca2+存在的條件下將組織促凝血酶原激酶或蛇毒作用于人或牛的血漿精制的凝血酶原而制備的物質(zhì)。凝血酶的精制，優(yōu)選單獨(dú)使用疏水作用色譜(HIC)或配合陽(yáng)離子交換色譜(CEC)進(jìn)行。
上述纖維蛋白的制備中，纖維蛋白原溶解時(shí)的濃度為4～12w/v％，優(yōu)選6～10w/v％。因?yàn)樵谠摑舛确秶?，所制備的纖維蛋白的粘著強(qiáng)度增大。作為溶解纖維蛋白原的溶劑，可以使用注射用蒸餾水、注射用生理食鹽水、pH為5～8的緩沖液(磷酸系、檸檬酸系等)等水性溶劑。
關(guān)于在上述纖維蛋白原溶液中添加的凝血酶的混合量，為了不降低纖維蛋白的交聯(lián)度(聚合度)而形成穩(wěn)定的凝血酶，在每1mg纖維蛋白原中優(yōu)選添加0.07至0.36單位的凝血酶，更加優(yōu)選添加0.07至0.25單位。關(guān)于凝血酶的單位，通常將1ml的0.1％精制纖維蛋白原溶液凝固15秒的量設(shè)定為1單位(NIH(美國(guó)全國(guó)衛(wèi)生研究所)單位[Minimum Requirements for Dried Thorombin](干燥凝血酶的最低要求)(1946))。
在本發(fā)明中，將市售的纖維蛋白原，或從人或動(dòng)物(例如牛)的血漿中制備的纖維蛋白原在上述溶劑中懸浮之后，優(yōu)選添加適量的凝血酶，在攪拌條件下以37℃左右溫度溫育一夜而使其進(jìn)行酶反應(yīng)，生成纖維蛋白。利用上述方法生成的纖維狀纖維蛋白，優(yōu)選通過(guò)濾紙等從反應(yīng)溶液分離，并通過(guò)冷凍干燥而形成粒狀。生成的纖維蛋白的分離及冷凍干燥的方法，可以按照公知的方法進(jìn)行。
利用上述方法得到的纖維蛋白冷凍干燥品，可以含有鈣。鈣的添加，優(yōu)選在纖維蛋白原中添加凝血酶而進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)進(jìn)行。通過(guò)鈣的添加，纖維蛋白與Ca2+進(jìn)行聚合、交聯(lián)反應(yīng)從而可以提高纖維蛋白的穩(wěn)定性。添加的Ca2+優(yōu)選2mM以上，優(yōu)選以CaCl2等鈣鹽的形式添加。而且，雖然纖維蛋白具有生物體內(nèi)分解性，但是通過(guò)添加鈣，可以調(diào)整在生物體內(nèi)纖維蛋白的分解時(shí)間，并且根據(jù)疾病的程度等，可以使誘導(dǎo)血管新生的時(shí)間延長(zhǎng)。
另外，利用上述方法得到的纖維蛋白冷凍干燥品，根據(jù)使用目的、使用場(chǎng)所、纖維蛋白在生物體內(nèi)的滯留時(shí)間等，也可以進(jìn)一步含有其他生物體內(nèi)分解性高分子。其他生物體內(nèi)分解性高分子，可以在冷凍干燥纖維蛋白而形成粒狀品時(shí)，或?qū)⒗w維蛋白粒狀品懸浮在適當(dāng)?shù)乃匀軇r(shí)，與纖維蛋白混合。作為生物體內(nèi)分解性高分子，已知有天然高分子及合成高分子。作為天然高分子，可以例舉葡聚糖、透明質(zhì)酸、殼多糖、殼聚糖、脫乙酰殼多糖、藻酸、硫酸軟骨素、淀粉、普魯蘭多糖(プルラン)等多糖或這些多糖的衍生物，或白蛋白、膠原蛋白、明膠等蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，優(yōu)選天然物質(zhì)，特別優(yōu)選來(lái)自天然植物的高分子，例如明膠等。作為合成高分子，可以例舉聚乙醇酸、聚乳酸、聚氰基丙烯酸酯等。這些材料任何一個(gè)都在體內(nèi)被吸收而消失，所以沒(méi)有必要考慮生物體內(nèi)適合性，而且因?yàn)闆](méi)有細(xì)胞毒性，所以不存在有關(guān)生物體安全性的問(wèn)題。
含有利用上述方法得到的纖維蛋白的血管新生誘導(dǎo)劑的生物體給藥形式，因?yàn)楦鶕?jù)給藥患者等的疾病種類(lèi)、疾病部位、疾病程度等各不相同，故不能一概而論，通常根據(jù)醫(yī)生的判斷確定，但優(yōu)選給藥形式如下面所述。
本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑，可以以粉體形式直接給藥至生物體內(nèi)的目標(biāo)部位，或在注射用蒸餾水、注射用生理食鹽水、pH為5～8的緩沖液(磷酸系、檸檬酸系等)等水性溶劑的液狀賦形劑中懸浮，例如可以通過(guò)注射、涂布等方式給藥。另外，也可以與適當(dāng)?shù)馁x形劑混合，形成軟膏狀、凝膠狀、奶油狀等，例如可以作為纖維蛋白凝膠等進(jìn)行涂布。進(jìn)而，在上述水性溶劑等中，懸浮含有纖維蛋白的本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑，之后通過(guò)除去溶劑而形成例如片狀、塊狀、球狀等適當(dāng)形狀，例如作成纖維蛋白片，將其給藥至生物體的目標(biāo)部位。這些制劑中使用的賦形劑，只要是可以添加到藥品的則沒(méi)有特別的限定，但是優(yōu)選具有生物體內(nèi)分解性的那些，另外制劑化方法可以采用該領(lǐng)域中公知的方法。
關(guān)于對(duì)生物體的纖維蛋白給藥量，相對(duì)于給藥生物體的表面積1cm2，優(yōu)選為1～10mg，更優(yōu)選1～5mg，特別優(yōu)選2～3mg。但是，該給藥量并沒(méi)有限定于此，從而不能一概而論，所以如上所述，根據(jù)給藥部位的疾病等狀況或纖維蛋白在生物體內(nèi)的滯留處置時(shí)間等，根據(jù)醫(yī)生的判斷確定，而且可以變更。另外，本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑的劑型為水溶液或軟膏時(shí)，賦形劑與纖維蛋白的配比相對(duì)于纖維蛋白4mg，賦形劑優(yōu)選為100～500μl。
本發(fā)明的含有纖維蛋白的血管新生誘導(dǎo)劑的血管新生誘導(dǎo)效果的確認(rèn)方法，沒(méi)有特別的限定，可以將本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物(例如兔子、大鼠或小鼠等動(dòng)物)給藥，通過(guò)確認(rèn)給藥部的細(xì)動(dòng)脈的增加而進(jìn)行。作為確認(rèn)給藥部的細(xì)動(dòng)脈新生的方法，例如，向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物將本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑給藥之后，用肉眼確認(rèn)給藥部中細(xì)動(dòng)脈的新生狀況，或收取給藥部的組織并用福爾馬林固定之后，將該部位實(shí)施HE(蘇木精-曙紅)染色而進(jìn)行調(diào)查。進(jìn)而也可以通過(guò)測(cè)定給藥部位的血流量、表皮溫度等進(jìn)行。
在本發(fā)明中，進(jìn)行了使用裸小鼠的皮瓣生存率的研究。本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑涂布在剝離皮瓣后的皮下組織上，可以確認(rèn)血管新生誘導(dǎo)效果。具體來(lái)說(shuō)，血管新生的誘導(dǎo)效果的確認(rèn)通過(guò)如下方法實(shí)施切開(kāi)小鼠皮膚，在產(chǎn)生的皮瓣與剝離皮瓣后的皮下組織之間涂布該血管新生誘導(dǎo)劑，之后測(cè)定皮下組織的血流量、皮膚表面溫度等。另外，也可以通過(guò)如下方法實(shí)施通過(guò)切斷小鼠的動(dòng)脈等人為制作生物體內(nèi)的缺血部位，向缺血部位將該血管新生誘導(dǎo)劑給藥之后，測(cè)定該部位的血流量。血流量、皮膚溫度等的測(cè)定方法，可以為公知的方法，例如對(duì)于血流量的測(cè)定，可以例舉通過(guò)利用激光散射的實(shí)時(shí)血流測(cè)定裝置，例如使用激光多普勒裝置(型號(hào)ALF2100，Advance Co.Ltd.制備)的方法；關(guān)于皮膚溫度的測(cè)定，可以例舉拍攝溫度記錄圖象，通過(guò)電子計(jì)算機(jī)分析溫度分布，例如使用溫度描記器(サ一モトレ一サ)(TH3100ME、NEC.公司制備)的方法。
在本發(fā)明中，通過(guò)向生物體給藥纖維蛋白，可以誘導(dǎo)血管新生，可以達(dá)到功能障礙或功能不全的生物體內(nèi)組織及臟器的功能再生，而且通過(guò)將細(xì)胞或組織等與纖維蛋白一同向生物體內(nèi)給藥，可以進(jìn)一步促進(jìn)其效果。
再生治療的實(shí)施，通常需要移植細(xì)胞、血管生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖因子等，成為組織再生立足點(diǎn)的生物體內(nèi)適合材料，進(jìn)而需要用于維持移植細(xì)胞的生物體功能的氧及營(yíng)養(yǎng)成分的供給源。這些因子被導(dǎo)入生物體內(nèi)，且在生物體內(nèi)形成網(wǎng)絡(luò)，可以實(shí)現(xiàn)功能障礙或功能不全的生物體內(nèi)組織及臟器的功能再生。
使用本發(fā)明的含有纖維蛋白的血管新生誘導(dǎo)劑時(shí)，纖維蛋白不僅具有作為生物體內(nèi)適合材料的功能，而且也具有作為氧、營(yíng)養(yǎng)成分的供給源的作用。即，作為生物體內(nèi)分解性高分子的纖維蛋白，具有作為促進(jìn)移植細(xì)胞的粘著、分化、形態(tài)形成的立足點(diǎn)的功能，而且通過(guò)誘導(dǎo)血管新生發(fā)揮作為移植細(xì)胞的氧、營(yíng)養(yǎng)成分的供給源的作用。進(jìn)而為增進(jìn)血管新生而在本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑中含有bFGF、VEGF、HGF等生長(zhǎng)因子時(shí)，纖維蛋白可以取得在組織再生的地方持續(xù)放出生長(zhǎng)因子的緩釋效果。
作為在本發(fā)明中使用的生長(zhǎng)因子，可以例舉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)[包括堿性FGF及酸性FGF]、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)[優(yōu)選來(lái)自血小板]、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、血管生成素(包括血管生成素-1和血管生成素-2)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、胎兒型平滑肌肌球蛋白重鏈(SMemb)、生長(zhǎng)激素(GH)或其類(lèi)似物質(zhì)、其他細(xì)胞增殖促進(jìn)因子等。這些生長(zhǎng)因子可以單獨(dú)使用一種，也可以組合兩種以上使用。這些物質(zhì)的用法、用量只要在公知的范圍，則沒(méi)有特別的限定，需要根據(jù)將本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑給藥的患者等的疾病、該血管新生誘導(dǎo)劑的給藥形式及處置時(shí)間等因素而確定，所以不能一概而論。因此，生長(zhǎng)因子的用法、用量，優(yōu)選根據(jù)醫(yī)生等的判斷確定，通常相對(duì)于每4mg纖維蛋白，生長(zhǎng)因子的混合量約為1ng～100μg，特別優(yōu)選1ng～50μg。
作為本發(fā)明的纖維蛋白構(gòu)成的血管新生誘導(dǎo)劑中使用的移植細(xì)胞或移植組織，可以例舉骨髓單核細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)等未分化細(xì)胞，角質(zhì)化細(xì)胞或成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞等分化細(xì)胞以及這些分化細(xì)胞構(gòu)成的組織。
作為再生治療的代表性領(lǐng)域，可以例舉皮膚再生治療。因火灼傷、或進(jìn)行皮膚癌手術(shù)時(shí)，在患者的皮膚上會(huì)殘留疤痕。為治愈這些創(chuàng)傷部位，生物體內(nèi)的自體皮膚再生功能是必不可少的。通過(guò)在創(chuàng)傷部位涂布或注入由本發(fā)明的纖維蛋白構(gòu)成的血管新生誘導(dǎo)劑，角質(zhì)化細(xì)胞或成纖維細(xì)胞從該周邊的皮膚組織進(jìn)入纖維蛋白內(nèi)，并誘導(dǎo)血管新生，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，表皮、真皮組織得到再生。表皮組織難以進(jìn)行自體再生時(shí)，通過(guò)將患者的其他部分表皮移植到再生的真皮上，在再生真皮與移植表皮之間涂布本發(fā)明的纖維蛋白構(gòu)成的血管新生誘導(dǎo)劑，進(jìn)一步誘導(dǎo)血管新生而可以提高表皮的粘著性。難以進(jìn)行自體皮膚再生時(shí)，以覆蓋保護(hù)為目的實(shí)施皮膚移植等，但是用于移植的皮膚即使是從患者本人剝離的自體皮膚，或在生物體外培養(yǎng)的培養(yǎng)皮膚，通過(guò)在創(chuàng)傷部與皮膚之間通過(guò)給藥本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑，可以提高與移植皮膚的覆蓋部位的粘著性。另外，通過(guò)在本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑內(nèi)預(yù)先含有角質(zhì)化細(xì)胞或成纖維細(xì)胞等和/或生長(zhǎng)因子等，可以提高自體組織的再生及移植皮膚的粘著性。
閉塞性動(dòng)脈硬化、慢性閉塞性動(dòng)脈硬化、糖尿病、壞疽、雷諾氏病及伯格氏病為代表的末梢性血管疾病沒(méi)有有效的治療方法，在難以進(jìn)行血管擴(kuò)張術(shù)及血管旁通手術(shù)等血行再建術(shù)時(shí)，不得不截?cái)嘞轮?。?duì)于這樣嚴(yán)重的末梢性血管疾病的治療方法，誘導(dǎo)血管新生，形成新血管的本發(fā)明的含有纖維蛋白的血管新生誘導(dǎo)劑是有用的。通過(guò)在疾患部給藥本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑，因血管新生而形成側(cè)副動(dòng)脈(旁通)，可以改善缺血部。而且，在本發(fā)明的含有纖維蛋白的血管新生誘導(dǎo)劑中，為了進(jìn)一步促進(jìn)血管新生，可以預(yù)先配合有關(guān)血管形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞和/或骨髓單核細(xì)胞等，也可以進(jìn)一步配合bFGF、VEGF、HGF等生長(zhǎng)因子。
對(duì)于心肌梗塞癥、擴(kuò)張型心肌癥等心臟疾病，因?yàn)樾募](méi)有再生能力，故因心肌壞死而使收縮功能不全時(shí)，除了心臟移植方法之外，至今沒(méi)有其他治療方法。但是，通過(guò)使用本發(fā)明的含有纖維蛋白的血管新生誘導(dǎo)劑，可以再生心肌功能。也就是說(shuō)，在本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑中含有心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，通過(guò)將其給藥至心臟的壞死區(qū)域，可以使壞死區(qū)域的心肌組織再生，而且從宿主的健康的周邊心肌部誘導(dǎo)血管，與宿主的心肌組織連接的同時(shí)可以再生能夠收縮的心肌組織。
腦挫傷、帕金森氏病、多發(fā)性硬化癥或腦梗塞等腦疾病，必須改善受損的腦功能，嘗試了神經(jīng)上皮型干細(xì)胞等神經(jīng)干細(xì)胞的腦內(nèi)移植。在神經(jīng)細(xì)胞的移植治療中，需要被移植的神經(jīng)干細(xì)胞在宿主的組織內(nèi)生存，形成突觸而再建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。為了再建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，需要在移植細(xì)胞周邊誘導(dǎo)血管新生，將移植的細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠星狀細(xì)胞等各種細(xì)胞。此時(shí)，通過(guò)將含有該移植細(xì)胞的本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑給藥至腦內(nèi)，可以同時(shí)誘導(dǎo)血管新生，促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的再建。
在骨折等的治療中，將直接固定工具貼在作為損傷部位的骨上進(jìn)行治療。此時(shí)，通過(guò)將固定工具和本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑結(jié)合使用，例如通過(guò)在固定工具上負(fù)載本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑，可以促進(jìn)骨形成，加快治療速度。另外，在本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑中含有成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，可以進(jìn)一步促進(jìn)骨形成。
另外，作為骨和關(guān)節(jié)疾病等的治療方法，嘗試了利用人工骨、人工關(guān)節(jié)的人工骨、關(guān)節(jié)置換術(shù)，但該置換術(shù)的課題是如何使人工骨與患者的周?chē)M織融合為一體。作為解決這個(gè)課題的方法，需要開(kāi)發(fā)一種與患者自身的周?chē)?xì)胞一體化，可以與周邊組織一同生長(zhǎng)的人工骨等。為了得到具有上述功能的人工骨，需要開(kāi)發(fā)如下人工骨的基材具有網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的，可以三維培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等移植細(xì)胞；具有優(yōu)良的生物體適合性；一定時(shí)間內(nèi)可以在生物體內(nèi)被吸收。本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑以纖維蛋白為其構(gòu)成成分，所以具有優(yōu)良的生物體適合性及生物體內(nèi)分解性，而且通過(guò)血管新生誘導(dǎo)作用可以促進(jìn)移植細(xì)胞的增殖。從而，通過(guò)使用本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑，可以得到優(yōu)良的人工關(guān)節(jié)、人工骨。
作為消化器官疾病所公知的缺血性大腸炎、腸閉塞等，是一伴隨由腸的血液循環(huán)障礙所導(dǎo)致的腸組織或腸平滑肌細(xì)胞壞死的重病。另外，胃潰瘍或十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎等潰瘍性消化器官疾病，也因腸平滑肌細(xì)胞壞死而使平滑肌層受到傷害。通過(guò)在本發(fā)明的含有纖維蛋白的血管新生誘導(dǎo)劑中配合腸細(xì)胞、腸平滑肌細(xì)胞或胃細(xì)胞等并給藥至壞死區(qū)域，可以從宿主的健康周邊組織誘導(dǎo)血管，可以再生壞死區(qū)域的腸組織或胃組織。
作為恢復(fù)功能不全的臟器功能的方法，有使用人工臟器的方法，于是為了實(shí)現(xiàn)該方法，正在開(kāi)發(fā)可以長(zhǎng)時(shí)間埋入體內(nèi)，具有半永久性功能的人工臟器。特別是，從長(zhǎng)時(shí)間維持人工臟器功能的目的出發(fā)，進(jìn)行了以人工臟器為基材，嵌入培養(yǎng)細(xì)胞的生物人工臟器的研究開(kāi)發(fā)。生物人工臟器，根據(jù)其形狀有微膠囊型、大膠囊型等，但任一個(gè)都具有在生物體內(nèi)環(huán)境中用于防止生物體的免疫系統(tǒng)襲擊的防御手段，例如免疫隔離膜等防御屏障，和可以替代恢復(fù)功能的移植細(xì)胞及保持移植細(xì)胞功能的細(xì)胞外基質(zhì)(培養(yǎng)基)。而且，這些人工臟器中負(fù)載的移植細(xì)胞，為了維持細(xì)胞功能，需要從血液供給氧和營(yíng)養(yǎng)成分。從而，通過(guò)將本發(fā)明的由纖維蛋白構(gòu)成的血管新生誘導(dǎo)劑與該人工臟器復(fù)合，可以制作有效增殖、維持人工臟器內(nèi)移植細(xì)胞的生物人工臟器。
作為上述生物人工臟器內(nèi)負(fù)載的移植細(xì)胞，可以例舉胰島細(xì)胞、胰內(nèi)分泌細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞等。通過(guò)使用這些細(xì)胞，可以制作各種生物人工胰臟、生物人工腎臟、生物人工肺等。通過(guò)移植這種生物胰臟(胰島)，可以將作為內(nèi)分泌、代謝疾病一例的糖尿病引起的高血糖癥，調(diào)整至生理更正常狀態(tài)。通過(guò)移植生物人工腎臟，可以減少因自體免疫不全疾病而必須定期進(jìn)行血液透析療法等的腎功能不全患者的肉體上的負(fù)擔(dān)。另外，通過(guò)移植生物人工肺，可以恢復(fù)肺組織、細(xì)胞的損傷、破壞或肺炎、肺纖維化疾癥、肺氣腫等呼吸器官疾病導(dǎo)致的障礙、肺功能低下。
進(jìn)而，通過(guò)本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑的效果，可以在缺血部誘導(dǎo)血管，所以可以進(jìn)行一直以來(lái)難以進(jìn)行的人工臟器及生物人工臟器的皮下、肌肉內(nèi)的移植。皮下或肌肉內(nèi)，可以以比較輕微的侵襲進(jìn)行移植，并且從該部位移植的人工臟器等的回收也容易，所以被認(rèn)為是理想的移植部位，但是，在其反面，血管的分布密度稀疏，因而難以用作細(xì)胞增殖、生存的場(chǎng)所。也就是說(shuō)，通過(guò)在生物人工臟器內(nèi)復(fù)合本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑后進(jìn)行移植，在皮下或肌肉內(nèi)可以誘導(dǎo)血管新生，可以恢復(fù)該部位的缺血狀態(tài)，所以在皮下或肌肉內(nèi)生物人工臟器也可以有效發(fā)揮其功能。
在本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑中配合上述細(xì)胞等時(shí)，所用細(xì)胞可以任選自培養(yǎng)細(xì)胞及非培養(yǎng)細(xì)胞，其培養(yǎng)方法及從生物體的分離方法，可以使用公知的方法。例如，血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以為動(dòng)脈、大動(dòng)脈、靜脈及臍帶靜脈中的任一血管的內(nèi)皮細(xì)胞。從血管分離內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，例如可以收取將血管內(nèi)壁進(jìn)行胰蛋白酶等蛋白酶處理而游離的細(xì)胞。骨髓單核細(xì)胞可以利用常規(guī)方法從骨髓液分離，骨髓液可以從胸骨或骨盆收取。而且，分離的細(xì)胞，根據(jù)需要也可以進(jìn)行培養(yǎng)后使用。另外，這些血管內(nèi)皮細(xì)胞或骨髓單核細(xì)胞等，可以為患者或病畜等的自體來(lái)源或具有移植適合性的其他來(lái)源，但優(yōu)選患者等的自體來(lái)源。
在本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑中配合細(xì)胞時(shí)的狀態(tài)，沒(méi)有特別的限定，需要根據(jù)將本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑給藥的患者等的疾病、該血管新生誘導(dǎo)劑的給藥形式及處置時(shí)間等因素而確定，通常相對(duì)于每4mg纖維蛋白，細(xì)胞數(shù)為1×102～106個(gè)，特別優(yōu)選1×103～105個(gè)。
另外，在本發(fā)明的血管新生誘導(dǎo)劑中配合細(xì)胞的方法沒(méi)有特別的限定，例如，可以在纖維蛋白乳濁液中均勻懸浮細(xì)胞，得到細(xì)胞乳濁液，或按上述作成纖維蛋白凝膠或纖維蛋白片，通過(guò)在其中均勻含有細(xì)胞而實(shí)施。利用這種方法制備的制劑中，形成在制劑內(nèi)配合的細(xì)胞被纖維蛋白均勻覆蓋的形態(tài)，將該制劑給藥到生物體時(shí)，可以有效且均勻再生血管。而且，與細(xì)胞一同給藥的纖維蛋白在生物體內(nèi)分解、消失，給藥的細(xì)胞同樣通過(guò)增殖、粘著，形成具有健全的生物體內(nèi)網(wǎng)絡(luò)功能的器官組織。
下面，利用實(shí)施例等詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明沒(méi)有限定于下述各例。
纖維蛋白的制備將500mg的纖維蛋白原(Sigma公司制備)緩慢添加到500ml的PBS(-)(pH7.2)溶液中，利用攪拌器進(jìn)行攪拌而使其完全溶解。在得到的纖維蛋白原溶液中，添加125單位的凝血酶(Sigma公司制備)，在室溫下攪拌一小時(shí)。從溶液中收取析出的纖維蛋白，在500ml的蒸餾水中進(jìn)行30分鐘攪拌。重復(fù)3次洗凈操作。在洗凈之后，用濾紙(ADVANTEC公司制備，5A)除去纖維蛋白的水分，放入500ml離心管中并在-80℃下冷凍保存一夜。將凍結(jié)的纖維蛋白干燥，得到了約為280mg的粒狀纖維蛋白。冷凍干燥使用東京理科機(jī)械公司制備的FDU-830，在溫度-40℃條件下進(jìn)行一夜。
在Eppendorf管內(nèi)各移入4mg所得的粒狀纖維蛋白，通過(guò)氣體滅菌器(西本產(chǎn)業(yè)公司制備、イオジエクトSA-360)實(shí)施氣體滅菌之后，在室溫下保存。
使用裸小鼠的皮瓣生存率的研究在8～10周齡的裸小鼠(日本SLC株式會(huì)社、BALB/C-nu)中，腹腔內(nèi)給藥戊巴比妥鈉(50mg/kg)而進(jìn)行麻醉，在背部正中線部的皮膚中，不切開(kāi)距離肩胛骨1cm位置的橫向1邊(基底邊Base of Flap)的狀態(tài)下，切開(kāi)、剝離3邊成橫向1cm、縱向2cm的方形，制作了皮瓣(參照?qǐng)D1)。
每只小鼠給藥4mg實(shí)施例1中制備的纖維蛋白。給藥方法如下在Eppendorf管內(nèi)將4mg纖維蛋白懸浮在20μl的PBS(-)中，用刮鏟將該溶液均勻涂布在皮瓣與皮下組織之間。涂布之后立即縫合切開(kāi)部。重復(fù)這個(gè)操作，制作了9個(gè)實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的給藥模型組。作為對(duì)照組，制作了只給藥沒(méi)有添加實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的20μlPBS(-)的9只(n＝9)小鼠。給藥模型組及對(duì)照組，在縫合之后回到飼養(yǎng)籠，通常用固體飼料及水來(lái)飼養(yǎng)。
皮瓣的生存率測(cè)定在試驗(yàn)例1中制作的給藥模型組(n＝9)及對(duì)照組(n＝9)中，測(cè)定了皮瓣形成后第3天及第7天的皮瓣生存率。
將皮瓣形成后第3天及第7天的兩組小鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用數(shù)碼相機(jī)拍攝(圖1)背部圖象并傳送到電子計(jì)算機(jī)上。利用圖象處理軟件(Mac Aspect)分析圖象，算出了整個(gè)皮瓣的生存率。兩組的皮瓣生存率通過(guò)將整個(gè)皮瓣面積設(shè)定為100，扣除壞死部面積的比例而求得。在圖2中，表示了兩組的皮瓣形成后第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的皮瓣生存率。其中，進(jìn)行t檢驗(yàn)，求得了兩組之間的差異。
在對(duì)照組中，皮瓣的生存率在第3天約為44.5±6.07％(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)，第7天大約下降為32.0±4.38％。與對(duì)照組相比，給藥模型組中，顯示出了第3天及第7天皮瓣的生存率約為72.9±2.54％及73.0±3.89％的高值。這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)在實(shí)施例1中制備的纖維蛋白皮瓣缺血部的血管得到新生，促進(jìn)了剝離的皮瓣與皮下組織的粘著。實(shí)際上，收取皮瓣形成后第7天的兩組皮瓣組織實(shí)施HE染色(圖3(a)(b))時(shí)，在給藥模型組中，與對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)在肌肉組織內(nèi)形成了明顯的血管網(wǎng)，發(fā)生了良好的血管新生。其中，作為參考，收取了在實(shí)施例1中制備的纖維蛋白的給藥組的皮瓣形成后第50天的皮瓣組織，實(shí)施了HE染色，結(jié)果如圖3(c)所示。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，可以確定在皮瓣與皮下組織粘著之后，纖維蛋白完全分解，形成正常的組織。
血流量測(cè)定試驗(yàn)在試驗(yàn)例1中制作的給藥模型組(n＝1)及對(duì)照組(n＝1)中，測(cè)定了皮瓣形成后第3天及第7天的皮瓣中心部的血流量。
將兩組小鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，將背部已縫合的皮瓣表面的中心部位作為激光多普勒裝置(型號(hào)ALF2100，Advance Co.Ltd.制備)的激光照射部，測(cè)定了一定時(shí)間血流量的變化。此時(shí)，盡量在照射部與小鼠皮瓣表面密合的狀態(tài)下測(cè)定。在圖4(a)(b)(c)(d)中，表示了在得到穩(wěn)定血流量的時(shí)間帶中血流量的變化。(a)及(b)表示皮瓣形成后第3天兩組的血流量(ml/100g組織/分)，(c)及(d)表示瓣形成后第7天兩組的血流量(ml/100g組織/分)。
根據(jù)這些結(jié)果，可以得到如下結(jié)論。皮瓣形成后第3天，給藥模型組的血流量大約變化14～16ml/100g組織/分，對(duì)照組的血流量大約變化4～5.5ml/100g組織/分。皮瓣形成后第7天，給藥模型組的血流量大約變化11～20.5ml/100g組織/分，對(duì)照組的血流量大約變化4.5～5.5ml/100g組織/分。因此，不論是第3天還是第7天，給藥模型組的血流量與對(duì)照組相比均顯示出明顯的高值，從而可以確定通過(guò)給藥實(shí)施例1中制備的纖維蛋白，可以提高血流量。
血流量恢復(fù)試驗(yàn)在試驗(yàn)例1中制作的給藥模型組(n＝5)及對(duì)照組(n＝4)中，測(cè)定了皮瓣形成后第1天、第3天及第7天的皮瓣血流量的恢復(fù)率。
將兩組小鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，設(shè)置了其背部已縫合的皮瓣表面(橫向1cm、縱向2cm方形)的縱向4等分線(將縱向2cm以0.5cm間隔分割)，和橫向3等分線(將橫向1cm大約以0.33cm間隔分割)。將距離基底邊0.5cm及1.5cm處的線，與橫向3等分線之間的4個(gè)交點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，將該4處作為激光多普勒裝置(型號(hào)ALF2100，Advance Co.Ltd.制備)的激光照射部，測(cè)定了血流量(ml/100g組織/分)。此時(shí)，盡量在照射部與小鼠皮瓣表面密合的狀態(tài)下測(cè)定。其中，距離基底邊0.5cm位置的線上的兩點(diǎn)血流量的平均值作為0.5cm位置的血流量，距離基底邊1.5cm的線上的兩點(diǎn)血流量的平均值作為1.5cm位置的血流量。對(duì)進(jìn)行皮瓣形成前的兩組各個(gè)小鼠通過(guò)測(cè)定相同4處的血流量而得到的血流量的平均值設(shè)定為100，以相對(duì)這100的比例(％)表示血流量的恢復(fù)率。其中，進(jìn)行t檢驗(yàn)，求得兩組之間的有效差。
在圖5(a)及(b)中表示了0.5cm及1.5cm位置血流恢復(fù)率的結(jié)果。在對(duì)照組中，在接近基底邊的0.5cm位置，第7天的血流量恢復(fù)了70.4±13.29％(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)程度，在1.5cm位置，第7天的血流量只恢復(fù)了5.23±8.27％(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)程度。與此相對(duì)，在給藥模型組中，在接近基底邊的0.5cm位置，第3天的血流量幾乎恢復(fù)到100％，在1.5cm位置，第7天的血流量只恢復(fù)了81.75±16.29％。從而可以確定通過(guò)給藥實(shí)施例1中制備的纖維蛋白，可以得到顯著的血流量恢復(fù)。
表1表示詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
表1

血流量ml/100g組織/分[試驗(yàn)例5]皮膚溫度恢復(fù)試驗(yàn)在試驗(yàn)例1中制作的給藥模型組(n＝5)及對(duì)照組(n＝4)中，測(cè)定了皮瓣形成后第3天及第7天的皮瓣表面溫度。
將兩組小鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用溫度描記器(TH3100ME、NEC公司制備)拍攝了包括背部已縫合皮瓣的區(qū)域的表面溫度。拍攝模式設(shè)定為級(jí)別(レベル)35℃、靈敏度(センフ)0.7℃、掃描模式SC∑4。在拍攝的圖象基礎(chǔ)上，進(jìn)行皮瓣區(qū)域的表皮溫度分布的分析，求得該區(qū)域內(nèi)的溫度平均值。對(duì)進(jìn)行皮瓣形成前的兩組各個(gè)小鼠通過(guò)預(yù)先分析相同皮瓣區(qū)域的表皮溫度分布而得到的平均值設(shè)定為100，以相對(duì)于該100的比例(％)表示表皮溫度的恢復(fù)率。
圖6表示結(jié)果。在給藥模型組中，第3天及第7天與對(duì)照組相比，得到了顯著的皮膚溫度恢復(fù)。特別是第7天的恢復(fù)率幾乎達(dá)到100％，從而可以確定通過(guò)給藥實(shí)施例1中制備的纖維蛋白，可以顯著恢復(fù)皮膚溫度。
大鼠缺血模型中的血流量測(cè)定試驗(yàn)在8～10周齡的大鼠(清水實(shí)驗(yàn)材料(株)、京都)中，腹腔內(nèi)給藥戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)而進(jìn)行麻醉。在大鼠的右大腿根部?jī)?nèi)側(cè)完全切斷大腿動(dòng)脈，在右下肢制作了缺血區(qū)域(缺血模型)。在Eppendorf管內(nèi)，將實(shí)施例1中制備的纖維蛋白8mg在400μl的PBS(-)中無(wú)菌懸浮，并通過(guò)注射將各100μl該溶液各自給藥至缺血模型的右下肢缺血區(qū)域中的4處(給藥模型組，n＝1)。使用激光多普勒裝置(型號(hào)ALF2100，Advance Co.Ltd.制備)，測(cè)定了切開(kāi)大腿大動(dòng)脈后第5天右下肢缺血區(qū)域的血流量。測(cè)定方法如同試驗(yàn)例3，測(cè)定了缺血區(qū)域內(nèi)的血流量。在對(duì)照組(n＝1)中，只給藥不含纖維蛋白的PBS(-)400μl。
給藥模型組及對(duì)照組的各個(gè)結(jié)果用圖7(a)及(b)表示。給藥模型組的血流量大約變化12～13ml/100g組織/分，對(duì)照組的血流量大約變化4～4.5ml/100g組織/分。給藥模型組的血流量與對(duì)照組相比顯示出明顯的高值，從而可以確定通過(guò)給藥實(shí)施例1中制備的纖維蛋白，可以改善血流量。
發(fā)明效果通過(guò)在生物體內(nèi)給藥本發(fā)明的含有纖維蛋白的血管新生誘導(dǎo)劑，可以安全且有效誘導(dǎo)血管新生，可以實(shí)現(xiàn)功能障礙和功能不全的生物體組織及臟器的功能再生。
權(quán)利要求
1.粒狀制劑，通過(guò)冷凍干燥酶分解纖維蛋白原所得的纖維蛋白而得到。
2.粒狀制劑，通過(guò)冷凍干燥酶分解纖維蛋白原所得的纖維蛋白與鈣的混合而得到。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供對(duì)生物體安全的血管新生誘導(dǎo)劑。通過(guò)向生物體內(nèi)給藥，本發(fā)明提供的血管新生誘導(dǎo)劑可以安全誘導(dǎo)血管新生，實(shí)現(xiàn)功能障礙和功能不全的生物體組織及臟器的功能再生。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1911438SQ20061012562
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2003年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月23日
發(fā)明者井上一知, 顧元駿, 金度勛 申請(qǐng)人:井上一知, 創(chuàng)新株式會(huì)社