Manoalide在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及已知化合物的新應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及Manoalide在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血管新生是指從已經(jīng)存在的毛細血管長出新的血管的生物學(xué)過程，它是一系列的生理、病理過程中非常重要的環(huán)節(jié)。在生理狀態(tài)下，如胚胎發(fā)育、傷口愈合以及月經(jīng)周期中卵巢、子宮的周期性變化都依賴于新生的血管提供氧氣、養(yǎng)料及帶走代謝的廢物。病理狀態(tài)下局部缺血的組織、心梗后再灌注，這時有明顯的血管新生，這種血管新生過程在治療中應(yīng)得到促進以利于疾病的治療。相反地，腫瘤、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、節(jié)段性回腸炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、銀屑病、子宮內(nèi)膜異位癥、肥胖癥等疾病將會從抑制血管新生方面達到治療疾病的效果。

目前抑制血管新生的藥物有貝伐單抗、恩度和反應(yīng)停、舒尼替尼（Sunitinib）；馬立馬司他（Marimastat）；TNP-470等，但是這些藥物有各自的局限性，如手足皮膚反應(yīng)、心血管毒性、腎毒性等副作用，可以增加致死性不良事件的風(fēng)險。最常見的致死性不良事件為出血、心肌梗死、肝衰竭、高血壓和蛋白尿等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了Manoalide在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

本發(fā)明要求保護Manoalide在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

因為雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型和雞胚卵黃囊膜（YSM）模型是本技術(shù)領(lǐng)域用于檢測或篩選對新生血管生成具有影響作用藥物的典型性和普適性模型，因此，本發(fā)明只需要在這兩種代表性模型中證明Manoalide可以抑制新生血管形成，就可以強有力的證實Manoalide可以用于制備抑制新生血管形成的藥物。

優(yōu)選地，本發(fā)明要求保護Manoalide在制備抑制腫瘤新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，本發(fā)明要求保護Manoalide在制備抑制乳腺癌腫瘤新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

一種抑制新生血管形成的藥物，含有Manoalide和藥學(xué)上可接受的輔劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)Manoalide可以抑制雞胚絨毛尿囊膜模型中二級及三級血管的形成，并可以抑制雞胚卵黃囊膜模型中血管的生長。另外，在雞胚絨毛尿囊膜上種植乳腺癌腫瘤細胞(MDA-MB-231)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在雞胚絨毛尿囊膜上生長并形成腫瘤，腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)新生血管，用Manoalide處理后，此藥可以顯著抑制腫瘤內(nèi)部新生血管形成和腫瘤細胞的生長，由此證明Manoalide可抑制新生血管形成，可以用于制備抑制新生血管形成的藥物，該藥物可以廣泛用于新生血管相關(guān)疾?。ㄈ缒[瘤、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、節(jié)段性回腸炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、銀屑病、子宮內(nèi)膜異位癥、肥胖癥等）。尤其是腫瘤的血管新生，為臨床靶向血管新生治療腫瘤具有重要的意義。

附圖說明

圖1為藥物處理雞胚絨毛尿囊膜模型后的觀察結(jié)果。

圖2為藥物處理雞胚卵黃囊膜模型后的觀察結(jié)果。

圖3為藥物處理雞胚絨毛尿囊膜種腫瘤細胞后的觀察結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實施例1

雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型的建立及藥物處理

1）雞胚處理：將購買的9天雞胚表面清潔，然后用1∶1 000新潔爾滅液擦拭，拭干后將雞胚氣室向上，長軸與蛋托呈45°放入普通培養(yǎng)箱中孵化，設(shè)定溫度(37.8 ±0.5)℃和相對濕度60%，每天照蛋轉(zhuǎn)蛋3次。

2）開窗：孵育第9天，在照蛋器下標記氣室，確定開窗位置，用75%酒精消毒后，用慢速牙科鉆在氣室標記處鉆一個1mm³大小的小孔，用眼科彎鑷小心揭去蛋殼，形成直徑約為1cm的缺口，用眼科鑷輕輕揭掉蛋膜暴露雞胚絨毛尿囊膜。

3）實驗分組及加藥：Manoalide通過購買獲得，開窗后將雞胚隨機分為兩組（Manoalide實驗組和DMSO對照組）。每組8只雞胚。實驗組加待測藥物Manoalide，對照組加相同劑量的對照液DMSO。將Manoalide或DMSO從開口處小心加到尿囊膜上，醫(yī)用膠布封口，放入37.8℃，50%～60%濕度的恒溫箱中孵育48小時。

4）結(jié)果觀察：加藥48小時后，將蛋殼從中線剪開，流凈蛋中內(nèi)容物，肉眼直接觀察開窗孔一側(cè)尿囊膜上血管的變化，記錄現(xiàn)象，并在體式顯微鏡下照相觀察，統(tǒng)計血管發(fā)育情況。

觀察指標：以給藥點為中心，主干血管向中心盤的彎曲和靠近稱之為血管的吸引；周圍血管放射狀朝向中心的生長狀態(tài)，稱為血管輻輳。反之，無此向心生長情況，且比正常發(fā)育情況下的血管網(wǎng)密度小，血管細且數(shù)量顯著減少，出現(xiàn)明顯的無血管區(qū)域則存在待定的血管生長發(fā)育抑制作用。

結(jié)果如圖1所示，A為Manoalide處理的雞胚絨毛尿囊膜的血管變細，并且二級及三級血管分支變少。B為對血管密度增長率的統(tǒng)計，***P＜0.001?？梢姡琈anoalide抑制了9天雞胚CAM的血管形成。

實施例2

雞胚卵黃囊膜（YSM）模型的建立及藥物處理

1）種蛋處理：將種蛋表面清潔，然后用1:1 000新潔爾滅液浸泡3min，拭干后將雞胚氣室向上，長軸與蛋托呈45°放入普通培養(yǎng)箱中孵化，設(shè)定溫度(37.8 ±0.5)℃和相對濕度60%，每天照蛋、轉(zhuǎn)蛋3次。

2）實驗方法：取孵化2.5天的雞胚，將雞卵內(nèi)容物傾倒入無菌平皿中，將紅色和黑色記號筆標記的兩個同樣大小的硅膠環(huán)放置到雞胚卵黃囊血管網(wǎng)上血管較少的不同位置，蓋好平皿蓋(不需封閉)，放入37～38℃孵育箱中繼續(xù)孵育3～4h。3～4h后，挑選硅膠環(huán)未見移位、卵黃囊膜完整、血管網(wǎng)及胚盤發(fā)育良好的雞胚，紅色標記的硅膠環(huán)中加入待測藥物Manoalide，黑色標記的膠圈加入相同劑量的對照液DMSO作為自身對照，然后繼續(xù)孵育。

結(jié)果觀察：于加藥后0h、12h、24h分別在體式顯微鏡下拍照，觀察膠圈內(nèi)和周圍的YSM血管密度、走向。采用Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)分析拍攝實驗區(qū)域整個硅膠圈內(nèi)的血管，以血管面積和血管密度的變化作為分析指標。

加藥后12h的觀察結(jié)果如圖2所示，A左側(cè)為用0.1%DMSO處理的自身對照，右側(cè)為用Manoalide處理后的結(jié)果；B為對血管面積增長率的統(tǒng)計。*P＜0.05；**P＜0.01?？梢姡珼PPA抑制了3天雞胚YSM的血管生成。

實施例3

雞胚絨毛尿囊膜（CAM）接種腫瘤細胞模型的建立及藥物處理：將購買的雞胚種蛋用75%乙醇擦拭表面，雞胚氣室向上，長軸與蛋托呈45°放入普通培養(yǎng)箱中孵化，設(shè)定溫度（38±0.5）℃和相對濕度60%，每天照蛋、轉(zhuǎn)蛋，棄去未受精或死胚。持續(xù)孵育8～10d，標記氣室，確定開窗位置，用75%酒精消毒后，用牙科鉆在標記處磨出“+”痕跡，再用眼科彎鑷小心揭去蛋殼，形成直徑約1cm的缺口，用酒精棉球擦拭缺口外緣，用眼科彎鑷輕輕揭掉蛋膜，暴露出含有豐富血管的雞胚卵黃膜組織，用滅菌醫(yī)用膠布呈十字交叉封口，適應(yīng)9～16 h。在超凈臺上揭開醫(yī)用膠布。將無菌膠圈放在卵黃膜一級血管的半側(cè)附近。把已消過毒的硅膠藥圈放在卵黃膜一級血管與二級血管的交匯處。取對數(shù)生長期的 MDA-MB-231 細胞，用0.25%的胰酶消化、PBS洗滌、800rpm5min離心去上清后用1mL PBS基重懸，細胞計數(shù)后按每個種蛋 CAM 的硅膠藥圈中加入 50 μL細胞懸液(約含3×10⁶～5 ×10⁶個細胞)，配置細胞懸液并加入蛋中，保證膠圈與CAM緊貼，以確保加入的細胞懸液不流出膠圈。

30 h后，在超凈臺上打開膠布，觀察腫瘤生長情況，淘汰 CAM膜上沒有腫瘤生長的雞胚種蛋。將帶有腫瘤的雞胚種蛋隨機分成 4 組，前3組為實驗組，在膠圈中加2μM，4μM，6μM的50μL /個Manoalide，對照組給予相同劑量的 DMSO。用無菌膠布封口，孵育箱繼續(xù)孵育。24h加藥一次，連續(xù)加藥 3次，確保達到藥物的有效濃度。

第3次加藥后大約16 h，沿中線剪開雞蛋，倒凈里面的內(nèi)容物，PBS清洗，體視顯微鏡拍照測量腫瘤的體積，測量腫瘤區(qū)域血管的面積(V)，計算 MVD。腫瘤體積= 4π/3（長徑×短徑²）。MVD(%) = 腫瘤血管面積/(腫瘤區(qū)域亮區(qū)面積 + 腫瘤區(qū)域暗區(qū)面積) ×100%。將 CAM 移植瘤取出，置PBS中清洗。包埋、切片、H&E染色。

H&E染色：H&E染色是取雞胚絨毛尿囊膜上生長的腫瘤組織得到的石蠟切片，厚度為3～4μm。組織石蠟切片脫蠟、蘇木素染色4分鐘，反藍，伊紅染色3 秒，37℃過夜、封片。正置顯微鏡下觀察各個組織血管密度變化并拍照。