包含官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的充氣微膠囊的制作方法

專利名稱：包含官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的充氣微膠囊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含官能化聚氰基丙烯酸烷基酯、特別是用于超聲診斷的充氣微膠囊，以及該充氣微膠囊的制備方法。
本發(fā)明基于以下定義微粒500nm-500μm之間的所有顆粒的統(tǒng)稱，而不管其結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如何。
微膠囊500nm-500μm之間的、具有核-殼結(jié)構(gòu)的所有顆粒。
壁材料＝殼材料微膠囊殼的材料。
納米顆粒500nm以下的所有顆粒的統(tǒng)稱，而不管其結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如何。
顆粒納米顆粒及微米顆粒的統(tǒng)稱。
充氣微膠囊具有氣態(tài)芯的微膠囊。
均聚物由一種單體制成的聚合物。
共聚物由各種單體制成的聚合物。
氰基丙烯酸烷基酯氰基丙烯酸的烷基酯。
聚氰基丙烯酸烷基酯基本上沒有游離酸及醇基團(tuán)并由一種或者多種氰基丙烯酸烷基酯制成的聚合物。
官能團(tuán)包含至少一個帶有X-H原子基團(tuán)的極性、反應(yīng)性原子化合物的分子基團(tuán)，其中X＝O、S和N。
潛在官能團(tuán)具有保護(hù)基的官能團(tuán)，其中所述保護(hù)基也可保護(hù)多個官能團(tuán)。
官能單體與氰基丙烯酸烷基酯共聚的單體，除聚合分子基團(tuán)外，該單體還包含至少一個游離或者潛在的官能團(tuán)，而且可用該單體直接或者在脫除保護(hù)基后產(chǎn)生帶有游離官能團(tuán)的共聚物。
官能化聚氰基丙烯酸烷基酯通過使至少一種氰基丙烯酸烷基酯與至少一種官能單體進(jìn)行共聚反應(yīng)或者通過使聚氰基丙烯酸烷基酯的酯化酸性官能團(tuán)發(fā)生部分側(cè)鏈水解反應(yīng)而形成的具有游離官能團(tuán)的聚氰基丙烯酸烷基酯。
官能化通過使至少一種氰基丙烯酸烷基酯與至少一種官能單體進(jìn)行共聚反應(yīng)或者通過使聚氰基丙烯酸烷基酯的酯化酸性官能團(tuán)發(fā)生部分側(cè)鏈水解反應(yīng)而形成官能化的聚氰基丙烯酸烷基酯。
非官能化聚氰基丙烯酸烷基酯聚氰基丙烯酸烷基酯。
氣相比例φG氣體體積與反應(yīng)物總體積的比＝氣體在反應(yīng)混合物中的相-體積比例。
攪拌是使液體與液體、固體或者氣態(tài)物質(zhì)混合，其方式是氣相比例φG小于1％。
分散是使液體與液體、固體或者氣態(tài)物質(zhì)混合，其方式是氣相比例φG大于1％。
分散體是膠體(粒徑小于500納米)或者粗分散(粒徑大于500納米)的多相體系。
初級分散體是由通過一種或多種單體聚合反應(yīng)而制得的聚合物顆粒組成的膠體分散體。
自加氣是通過氣體的運(yùn)動或者通過產(chǎn)生動態(tài)流體低壓而在液體中引入氣體。
浮集是由于微膠囊與分散介質(zhì)之間的密度差微膠囊向加速力(由于重力g產(chǎn)生的加速，徑向加速a)相反方向移動。
浮集材料是浮集后充氣微膠囊的乳化層。如本發(fā)明專利所定義的，術(shù)語聚合物包括均聚物和共聚物，而術(shù)語聚合反應(yīng)包括均聚反應(yīng)和共聚反應(yīng)。
氰基丙烯酸烷基酯或者聚氰基丙烯酸烷基酯在醫(yī)藥和藥物領(lǐng)域中有多種用途。
藥劑Histoacryl由例如氰基丙烯酸丁基酯組成，并在手術(shù)中用作組織粘合劑或者血管粘合劑。在使用后，單體聚合，而且能夠非?？焖俚孛芊饨M織和或者血管。
另外，還有人提出使用氰基丙烯酸烷基酯用作活性成分的緩釋制劑(Couvreur，P.等人，J.Pharm.Pharmacol.31，331-332 1979)。在此情況下，活性成分嵌入由相應(yīng)聚合物組成的基質(zhì)中。其結(jié)果是可改變并控制活性成分的釋放速度和部位。
此時，氰基丙烯酸烷基酯或者聚氰基丙烯酸烷基酯都適合于制備幾個厘米大小的包含活性成分的植入物，以及制備幾微米或納米大小的微米顆粒和納米顆粒。
已發(fā)現(xiàn)氰基丙烯酸烷基酯或者聚氰基丙烯酸烷基酯在超聲造影劑的配制中有特殊用途。
作為造影劑，包含或者釋放氣體的物質(zhì)通常被用于醫(yī)療超聲診斷中，這是因?yàn)橛眠@些物質(zhì)可產(chǎn)生比液體或者固體與血液之間更有效的密度差以及阻抗差。
術(shù)語“微米顆粒”和“微膠囊”的使用在現(xiàn)有技術(shù)中并不是一致的。在以下的現(xiàn)有技術(shù)描述中，即使文獻(xiàn)中的術(shù)語與其有偏差，但仍使用本發(fā)明所基于的定義。
在歐洲專利EP 0 398 935和EP 0 458 745中，描述了包含氣體的微膠囊作為超聲造影劑，該造影劑由合成的可生物降解的聚合物組成。例如，公開了聚氰基丙烯酸烷基酯和聚交酯作為壁材料。歐洲專利EP 0 644777描述了一種經(jīng)過優(yōu)化的方法，通過該方法可顯著提高EP 0 398 935中描述的充氣微膠囊的超聲活性。超聲活性的增加是通過空氣芯的直徑來實(shí)現(xiàn)的，所述空氣芯在恒定的顆粒直徑情況下已被增大。雖然由此產(chǎn)生的壁厚較小，但顆粒仍能夠從心肺系統(tǒng)中通過并保存下來。所公開的充氣微膠囊的殼是由聚氰基丙烯酸烷基酯或者α-、β-或γ-羥基羧酸的聚酯制成的。
該用于由聚氰基丙烯酸烷基酯組成的充氣微膠囊的優(yōu)化方法具有以下特征在酸性、氣體飽和的水溶液中分散并聚合單體，而且在此情況下立即進(jìn)行微膠囊的構(gòu)建。以此方式，在制造過程中可以不依賴于有機(jī)溶劑來制造微膠囊。
現(xiàn)有技術(shù)中的充氣微膠囊的殼材料由聚氰基丙烯酸烷基酯組成，但是該充氣微膠囊具有以下多個缺陷1、氰基丙烯酸烷基酯的聚合物在終端醇基團(tuán)上沒有官能團(tuán)，而該官能團(tuán)對于直接共價偶聯(lián)特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)是必須的。
2、由于不存在官能團(tuán)，而且與官能化聚合物相比，氰基丙烯酸烷基酯的聚合物具有類似的分子量，而且氰基丙烯酸烷基酯的水溶性更低，幾乎不能溶漲。在靜脈給藥時，肝臟的網(wǎng)織上皮系統(tǒng)將微膠囊由血液循環(huán)中消除很大程度上取決于顆粒表面的親水性，因此疏水性表面加速消除。其結(jié)果是限制了診斷時間窗。
3、體內(nèi)降解是通過側(cè)鏈水解和解聚進(jìn)行的。除介質(zhì)的pH值以及聚合物的分子量外，官能團(tuán)的存在對于在血液和肝臟中的分解是更重要的，因此官能度越高，則分解和代謝通常都進(jìn)行得更快速。
4、由聚氰基丙烯酸烷基酯組成的充氣微膠囊在稀釋時具有有限的穩(wěn)定性，使得在通過給藥體積進(jìn)行變化時，超聲造影劑的劑量不得不顯著變化，但通過超聲造影劑濃度進(jìn)行變化時，超聲造影劑的劑量需要變化低。特別是在輸注期間進(jìn)行時，稀釋造影劑的選擇可降低給藥的成本。
本發(fā)明的目的是提供用于超聲診斷中的微膠囊，其不具有現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。官能化為使特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)與聚合物的結(jié)合提供更多的可能性。另外，應(yīng)實(shí)現(xiàn)疏水化，以減緩肝臟的網(wǎng)織上皮系統(tǒng)將微膠囊由血液循環(huán)中消除的速度，并由此擴(kuò)大診斷時間窗。再者，應(yīng)加速充氣微膠囊在肝臟中的分解和代謝。而且，根據(jù)本發(fā)明的超聲造影劑應(yīng)比現(xiàn)有技術(shù)中的超聲造影劑具有更高的稀釋穩(wěn)定性，以使給藥劑量的變化以及給藥形式具有額外的自由度。
本發(fā)明的目的是通過包含官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的超聲診斷用充氣微膠囊實(shí)現(xiàn)的。官能化聚氰基丙烯酸烷基酯可通過使一種或者多種氰基丙烯酸烷基酯與官能單體共聚來制備，所述氰基丙烯酸烷基酯優(yōu)選是氰基丙烯酸丁基、乙基和/或異丙基酯，而所述官能單體優(yōu)選是氰基丙烯酸，和/或通過聚氰基丙烯酸烷基酯的部分側(cè)鏈水解來制備，該聚氰基丙烯酸烷基酯優(yōu)選是聚氰基丙烯酸丁基、乙基和/或異丙基酯。
包含官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的充氣微膠囊可通過各種方法來制備。方法I第一個方法的特征在于以下步驟(a)使官能單體與一種或多種氰基丙烯酸烷基酯混合，(b)在酸性水溶液中，于分散條件下原位共聚合并構(gòu)建微膠囊。方法II第二個方法的特征在于以下步驟(a)使官能單體與一種或多種氰基丙烯酸烷基酯混合，(b)在酸性水溶液中，于攪拌條件下原位共聚合，以及(c)與共聚反應(yīng)單獨(dú)地在分散條件下構(gòu)建微膠囊。方法III第三個方法的特征在于以下步驟(a)在酸性水溶液中，于分散條件下使一種或多種氰基丙烯酸烷基酯原位聚合并構(gòu)建微膠囊，(b)添加堿液進(jìn)行部分側(cè)鏈水解，(c)添加酸使反應(yīng)停止。方法IV第四個方法的特征在于以下步驟(a)在酸性水溶液中，于攪拌條件下使一種或多種氰基丙烯酸烷基酯原位聚合，(b)與共聚反應(yīng)單獨(dú)地在分散條件下構(gòu)建微膠囊，(c)添加堿液進(jìn)行部分側(cè)鏈水解，(d)添加酸使反應(yīng)停止。方法V第五個方法的特征在于以下步驟(a)在酸性水溶液中，于攪拌條件下使一種或多種氰基丙烯酸烷基酯原位聚合，(b)在初級分散體中通過添加堿液進(jìn)行部分側(cè)鏈水解，(c)添加酸使反應(yīng)停止，(d)任選重新添加一種或多種氰基丙烯酸烷基酯，在分散條件下構(gòu)建微膠囊。
無論是哪一個方法，在進(jìn)行微膠囊的構(gòu)建后，都可任選地進(jìn)行一個或者多個浮集，隨后將浮集物質(zhì)吸收在生理相容性介質(zhì)中。
另外，即使已通過與官能單體的共聚反應(yīng)進(jìn)行官能化，但仍可通過添加堿液進(jìn)行部分側(cè)鏈水解以及添加酸使反應(yīng)停止，由此任選地進(jìn)行額外的官能化。再者，可進(jìn)行諸如過濾、超濾和/或離心的純制處理步驟。
無論是哪一種方法，優(yōu)選使用氰基丙烯酸的烷基酯作為單體。特別優(yōu)選的是氰基丙烯酸的丁基、乙基和異丙基酯。
作為官能單體，可使用以下者·氰基丙烯酸(H2C＝C(CN)-CO-OH)、甲基丙烯酸(H2C＝C(CH3)-CO-OH)、亞甲基丙二酸(H2C＝C(CO-OH)2)、和α-氰基山梨酸(H3C-CH＝CH-CH＝C(CN)-CO-OH)以及以下通式表示的衍生物H2C＝C(CN)-CO-X-Z(氰基丙烯酸衍生物)，H2C＝C(CH3)-CO-X-Z(甲基丙烯酸衍生物)，H2C＝C(CO-X′-Z′)2(亞甲基丙二酸衍生物)，以及H3C-CH＝CH-CH＝C(CN)-CO-X-Z(α-氰基山梨酸衍生物)，其中X＝-O-、-NH-、或者-NR1-，以及Z＝-H、-R2-NH2、-R2-NH-R1、-R2-SH、-R2-OH、R2-HC(NH2)-R1、 其中R1＝具有1-20個碳原子的直鏈或者支鏈烷基，而R2＝具有1-20個碳原子的亞烷基，X′和Z′在任何情況下都分別與X和Z的定義相同。
·取代的苯乙烯(Y-C6H4-CH＝CH2)或者甲基苯乙烯(Y-C6H4-C(CH3)＝CH2)，其中Y＝-NH2、-NR1H、-OH、-SH、-R2-NH2-、-R2-NH-R1、-R2-SH、-R2-OH、-R2-HC(NH2)-R1，
其中R1＝具有1-20個碳原子的直鏈或者支鏈烷基，而R2＝具有1-20個碳原子的亞烷基。
·可聚合的乳化劑(Surfmer)、具有官能團(tuán)的引發(fā)劑(Inisurf)以及具有官能團(tuán)的鏈轉(zhuǎn)移劑(Transsurf)。
優(yōu)選使用的是氰基丙烯酸(H2C＝C(CN)-CO-OH)和甲基丙 在此情況下，官能單體氰基丙烯酸產(chǎn)生游離羧基，作為具有極性、反應(yīng)性O(shè)-H原子基團(tuán)的官能團(tuán)。
官能單體甲基丙烯酸縮水甘油酯產(chǎn)生兩個相鄰的游離醇基(二醇)，具有兩個極性、反應(yīng)性O(shè)-H原子基團(tuán)。醇基在甲基丙烯酸縮水甘油酯中被保護(hù)成環(huán)氧基團(tuán)(潛在的官能團(tuán))，并通過水解釋放。
在方法I和II中，官能化是通過使氰基丙烯酸烷基酯與官能單體的共聚反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。
在方法III-V中，官能化是通過在初級分散體或者微膠囊懸浮體中用堿液隨后處理聚氰基丙烯酸烷基酯而實(shí)現(xiàn)的。在堿性介質(zhì)中，會導(dǎo)致側(cè)鏈中酯化酸性官能團(tuán)的酯水解。取決于所希望的官能化強(qiáng)度，此等反應(yīng)在室溫、pH為9-14的條件下進(jìn)行15分鐘-5小時。
該反應(yīng)可通過用例如鹽酸調(diào)節(jié)pH低于7來停止。
通過改變酯水解的pH值和反應(yīng)時間，可控制官能化的程度。如果小心地進(jìn)行反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)純的表面官能化。
在方法I和III中，其中一步進(jìn)行微膠囊的聚合及構(gòu)建的步驟基本上描述在歐洲專利EP 0398935和0644777中。在此，在分散條件下進(jìn)行微膠囊的聚合及構(gòu)建。作為分散工具，主要合適的是轉(zhuǎn)子-定子混合器，因?yàn)槠淠軌虍a(chǎn)生顯著的剪切梯度，并通過自加氣確保大量氣體的引入。
在方法II、IV和V中，其中微膠囊的聚合及構(gòu)建是在兩個步驟進(jìn)行的，其描述在德國專利申請(申請?zhí)?9925311.0)中。
在此描述的發(fā)明涉及制備充氣微膠囊的多步法，其中成殼物質(zhì)的聚合步驟以及微膠囊的構(gòu)建步驟單獨(dú)地進(jìn)行。用本發(fā)明的方法制得的微膠囊具有核-殼結(jié)構(gòu)，而且其特征是具有特定的尺寸分布。
在此情況下，單體的聚合反應(yīng)是在攪拌條件下于酸性的水溶液中進(jìn)行，所述攪拌條件使得攪拌介質(zhì)中的氣相比例φG小于1％。作為這些方法的中間產(chǎn)物，得到由膠體聚合物顆粒組成的初級分散體。所形成的用于包封氣體的聚合物膠乳顆粒的直徑在10-500nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選為30-150nm，特別優(yōu)選為60-120nm。
膠體聚合物顆粒的粒徑(可例如用平均直徑和多分散性表征)以及聚合物的分子量(可用例如摩爾質(zhì)量分布的最大值和摩爾質(zhì)量分布表征)可通過例如攪拌介質(zhì)的pH值、表面活性劑濃度和表面活性劑的類型來影響。具體而言，溶液浴(liquor bath)比例(表面活性劑的質(zhì)量與單體質(zhì)量的比例)是重要的參數(shù)，通過該參數(shù)可控制膠體聚合物顆粒的性質(zhì)。在此情況下，聚合物的分子量影響聚合物的玻璃轉(zhuǎn)化溫度，并因而影響其彈性，其對于由膠體聚合物顆粒制得的充氣微膠囊的聲學(xué)性質(zhì)是一個更為重要的參數(shù)。
作為聚合反應(yīng)的攪拌器件，基本上可以考慮所有常規(guī)使用的攪拌器，但是特別考慮的是那些用于徹底混合低粘度的水樣介質(zhì)(＜10mPas)的攪拌器件。這些器件包括例如螺旋槳攪拌機(jī)、葉輪攪拌機(jī)、pitched-blade攪拌機(jī)、MIG攪拌機(jī)、以及盤式攪拌機(jī)等。
對于聚合反應(yīng)，任選在聚合時產(chǎn)生的大部分物質(zhì)可被分離(例如通過過濾)，使它們不再對微膠囊的形成過程產(chǎn)生破壞性的作用。
充氣微膠囊的形成是在另一個步驟中通過膠體聚合物顆粒的構(gòu)建附聚來進(jìn)行的。由該聚合物初級分散體構(gòu)建微膠囊是在分散條件下進(jìn)行的，在該分散條件下氣相比例φG大于1％，優(yōu)選大于10％?？汕宄乜匆娝▔K形成。為此，初級分散體必須用分散工具進(jìn)行攪拌，使得反應(yīng)混合物中的氣相比例φG明顯地大于1％，而且通常增加至超過10％。
作為多步制造充氣微膠囊方法中的分散工具，可產(chǎn)生高剪切梯度的轉(zhuǎn)子-定子混合器也是合適的。另外，它們確保氣體的大量引入。
分散工具的尺寸及操作尺寸基本上確定了微膠囊的粒徑分布；它們的粒徑也取決于裝置單元的尺寸和冷卻容量。
具體的實(shí)施方案包括在連續(xù)的反應(yīng)器中進(jìn)行初級分散體的制造，為此目的，具有嚴(yán)格限定的停留時間性質(zhì)的管式反應(yīng)器比攪拌容器反應(yīng)器更適合。
通過合適地選擇聚合反應(yīng)參數(shù)，反應(yīng)器形狀以及平均停留時間在管式反應(yīng)器中可以簡單的方式確保，使得管式反應(yīng)器末端的聚合反應(yīng)完全完成。
在管式反應(yīng)器的末端，多級轉(zhuǎn)子-定子系統(tǒng)也可用于微膠囊的構(gòu)建反應(yīng)，使得整個過程可在單個裝置中進(jìn)行，而且兩個步驟，即、聚合物分散體的制備以及微膠囊的構(gòu)建反應(yīng)，可相互脫離。
另一個實(shí)施方案使用環(huán)式反應(yīng)器，其包括連續(xù)的攪拌容器或者任選具有外側(cè)環(huán)的非連續(xù)攪拌容器，該非連續(xù)攪拌容器包含單級或者多級在線分散單元或者單級或多級轉(zhuǎn)子-定子系統(tǒng)，它們還可產(chǎn)生用于外側(cè)環(huán)的輸出。
在此情況下，初級分散體的制備可在中等攪拌條件下在攪拌容器中進(jìn)行或者在封閉的環(huán)或在整個環(huán)式反應(yīng)器中進(jìn)行，其中所述環(huán)是開口的，具體地是在循環(huán)條件下，該條件不會由于相應(yīng)調(diào)節(jié)的速度范圍導(dǎo)致任何自加氣發(fā)生。在反應(yīng)結(jié)束后，環(huán)是開口的，使得隨后通過與該環(huán)為整體的轉(zhuǎn)子-定子單元進(jìn)行微膠囊的構(gòu)建反應(yīng)。當(dāng)所述環(huán)由外側(cè)開口時，轉(zhuǎn)子-定子單元的速度范圍相應(yīng)增加。
實(shí)施例1和2提供了根據(jù)上述德國專利申請多步構(gòu)建微膠囊的方法無論是哪種方法，攪拌或者分散介質(zhì)可包含一種或者多種以下的表面活性劑烷基芳基聚(氧乙烯)硫酸堿金屬鹽、葡聚糖、聚(氧乙烯)、聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)嵌段聚合物、乙氧基化脂肪醇(cetomacrogols)、乙氧基化脂肪酸、烷基酚聚(氧乙烯)、烷基酚聚(氧乙烯)與醛的共聚物、脫水山梨醇的部分脂肪酸酯、聚(氧乙烯)脫水山梨醇的部分脂肪酸酯、聚(氧乙烯)的脂肪酸酯、聚(氧乙烯)的脂肪醇醚、蔗糖的脂肪酸酯或者macrogol甘油酯、聚乙烯醇、聚(氧乙烯)-羥基脂肪酸酯、多元醇的macrogols、部分脂肪酸酯。
優(yōu)選使用一種或多種以下表面活性劑乙氧基化壬基酚、乙氧基化辛基酚、醛與辛基酚聚(氧乙烯)的共聚物、乙氧基化甘油-部分脂肪酸酯、乙氧基化氫化蓖麻油、聚(氧乙烯)-羥基硬脂酸酯、分子量小于20000的聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)嵌段聚合物。
特別優(yōu)選的表面活性劑是平均具有9-10個乙氧基的對辛基酚-聚(氧乙烯)(＝Octoxynol 9，10)，平均具有30/40個乙氧基的對壬基酚-聚(氧乙烯)(＝如Emulan30/Emulan40)，平均具有28個乙氧基的對壬基酚-聚(氧乙烯)硫酸鈉(＝如DisponilAES)，聚(氧乙烯)甘油單硬脂酸酯(如TagatS)，平均聚合度為600-700、水解度為85-90％的聚乙烯醇(＝如Mowiol4-88)，聚(氧乙烯)-660-羥基硬脂酸酯(＝如SolutolHS 15)，甲醛與對辛基酚聚(氧乙烯)的共聚物(＝如TritonWR 1339)，分子量為約12000、聚氧乙烯比例為約70％的聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(＝如LutolF 127)，乙氧基化十六烷基硬脂醇(＝如CremophorA25)，乙氧基化蓖麻油(＝如CremophorEL)。
除溫度外，還可通過pH來設(shè)定聚合反應(yīng)速度，并由此設(shè)定平均粒徑。所述pH是根據(jù)酸設(shè)定的，并在1.0-4.5的范圍內(nèi)，而所述酸例如是鹽酸、磷酸和/或硫酸。
影響反應(yīng)速度的其他因素是表面活性劑的類型和濃度以及添加劑的類型和濃度。
單體以0.1-60％、優(yōu)選0.1-10％的濃度添加至酸性水溶液中。
聚合反應(yīng)以及微膠囊的構(gòu)建是在-10℃至60℃、優(yōu)選0℃至50℃、并特別優(yōu)選5℃-35℃的溫度下進(jìn)行。聚合反應(yīng)以及微膠囊的構(gòu)建時間為2分鐘-2小時。
用上述方法，如果反應(yīng)正常進(jìn)行，原則上微膠囊中可包括所有的氣體。例如，可舉例有空氣、氮?dú)狻⒀鯕?、二氧化碳、稀有氣體、氧化氮、烷烴、烯烴、炔烴、一氧化二氮、以及全氟烴。
反應(yīng)批料可進(jìn)一步加工。
建議由反應(yīng)介質(zhì)中分離充氣微膠囊。
這可通過浮集利用密度差而容易地進(jìn)行。充氣微膠囊形成浮集材料，其可容易地由反應(yīng)介質(zhì)中分離。
所得的浮集材料可進(jìn)一步用生理相容性的載體處理，在最簡單的情況下為水或者生理鹽水。
可立即給藥混懸液。稀釋可任選地進(jìn)行。
分離步驟也可重復(fù)一次或多次。通過直接設(shè)定浮集條件，可得到具有限定性質(zhì)的部分。
微膠囊的尺寸以及尺寸分布是通過各種方法參數(shù)確定的，例如剪切梯度或者攪拌時間。充氣微膠囊的直徑在0.2-50μm之間，在作為非胃腸道藥劑時，直徑優(yōu)選在0.5-10μm之間，并特別優(yōu)選在0.5-5μm之間。
混懸液在非常長的時間內(nèi)是穩(wěn)定的，而且微膠囊不聚集。
隨后任選添加聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、明膠、人血清白蛋白或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他低溫保護(hù)劑，并進(jìn)行凍干，也可提高耐久性。
根據(jù)本發(fā)明的充氣微膠囊可直接或者在活化后用于偶聯(lián)特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)。
官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的活化可任選地有利于特異性結(jié)合分子和/或影響動力學(xué)的物質(zhì)的偶聯(lián)。
例如，可用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽)進(jìn)行活化，由此在聚合物位置中引入O-?；寤鶊F(tuán)作為可偶聯(lián)的基團(tuán)。
在此情況下，待結(jié)合的分子優(yōu)選通過胺基進(jìn)行結(jié)合。為此目的，待結(jié)合的分子任選進(jìn)行胺化(例如胺端基的聚乙二醇)。
作為特異性結(jié)合分子，可使用抗體，優(yōu)選抗EDB-FN抗體、抗endostatin抗體、抗CollXVIII抗體、抗CM201抗體、抗L-選擇蛋白配體抗體(如抗PNAd抗體(MECA79抗體))、抗CD105抗體、抗ICAM1抗體，或者內(nèi)原性配體，優(yōu)選L-選擇蛋白，特別優(yōu)選嵌合體L-選擇蛋白。
作為影響動力學(xué)的物質(zhì)，可使用合成的聚合物，優(yōu)選聚乙二醇(PEG)、蛋白(優(yōu)選人血清白蛋白)和/或糖(優(yōu)選葡聚糖)。
特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)可直接通過間隔基團(tuán)(例如蛋白G)偶聯(lián)至官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的官能團(tuán)上，或者通過鏈霉抗生物素-生物素進(jìn)行生物素化偶聯(lián)在充氣微膠囊上。
官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的官能團(tuán)可任選地在偶聯(lián)反應(yīng)之前進(jìn)行活化。
如果不進(jìn)行直接的偶聯(lián)，在第一個步驟中通過官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的官能團(tuán)將間隔基團(tuán)或者鏈霉抗生物素連接在充氣微膠囊上。特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)然后在第二個步驟中偶聯(lián)在間隔基團(tuán)上或者以生物素化的形式偶聯(lián)在鏈霉抗生物素上。在此情況下，官能化聚氰基丙烯酸烷基酯也可任選地在偶聯(lián)反應(yīng)之前進(jìn)行活化。
實(shí)施例1非官能化的充氣微膠囊(根據(jù)德國專利申請19925311.0的多步法)(a)制備初級分散體為注射目的時，將500ml的水裝入1升的玻璃反應(yīng)器中，其直徑與高度的比為0.5，通過添加0.1N的鹽酸將pH設(shè)定為1.5，并將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為290.5K。用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌，同時添加5.0g的Octoxynol，并攪拌至Octoxynol完全溶解。然后在相同的攪拌條件下，在15分鐘的時間滴加7g的氰基丙烯酸丁基酯，并再攪拌2小時。(b)制備微膠囊懸浮液用Ultraturrax(如IKA，T25型)在高剪切梯度(Ultraturrax的空轉(zhuǎn)速度為約20,500min-1)下分散初級分散體2小時。通過該分散，進(jìn)行處理介質(zhì)的自加氣，其結(jié)果是強(qiáng)烈形成泡沫。反應(yīng)結(jié)束后，形成充氣微膠囊的乳化層。為用于注射，由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用375ml的水處理。如此得到的懸浮液包含0.5-10μm的微膠囊(MalvemInstruments Company的激光衍射計(jì)，MastersizerS型)。(c)凍干然后，將40g的聚乙烯吡咯烷酮溶解在上述懸浮液中，將懸浮液配制為5g并凍干。(d)初級分散體中納米顆粒的粒徑通過動態(tài)光散射(裝置Nicomp Submicron Particle Sizer)測量根據(jù)(a)得到的初級分散體。

圖1顯示了所測定的納米顆粒的粒徑分布。粒徑分布的平均粒徑為83nm，進(jìn)行強(qiáng)度加權(quán)，其中多分散性指數(shù)為約25％。實(shí)施例2非官能化的充氣微膠囊(根據(jù)德國專利申請19925311.0的多步法)(a)制備初級分散體將pH為2.5的1％ Octoxynol水溶液1升引入2升的玻璃反應(yīng)器中，其直徑與高度的比為0.5，而且外側(cè)環(huán)帶有一段式轉(zhuǎn)子-定子混合裝置。在5分鐘的時間滴加14g的氰基丙烯酸丁基酯，并再攪拌30分鐘，將其引入反應(yīng)混合物中，但沒有空氣。(b)制備微膠囊懸浮液為制備微膠囊懸浮液，將外側(cè)環(huán)連接在環(huán)路中60分鐘，并分散初級分散體。玻璃反應(yīng)器中的攪拌器設(shè)定成能夠進(jìn)行反應(yīng)混合物的自加氣。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，形成乳化層。為用于注射，由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用1.5升的水處理。實(shí)施例3表面活性劑的濃度對顆粒性質(zhì)的影響(a)制備初級分散體類似于實(shí)施例1(a)的方法用濃度分別為0.1％(0.5g)、0.5％(2.5g)、1％(5g)、2％(10g)和10％(50g)的triton制備初級分散體。(b)制備微膠囊懸浮液由根據(jù)以上(a)得到的初級分散體構(gòu)建充氣微膠囊。初級分散體具有不同的尺寸分布，平均直徑為50nm、100nm和250nm(動態(tài)光散射)。其方法步驟與實(shí)施例1(b)類似。(c)初級分散體中納米顆粒的粒徑初級分散體用動態(tài)光散射測量粒徑來表征。圖2顯示了所測定的顆粒直徑(強(qiáng)度加權(quán))。聚合的納米顆粒的尺寸隨著表面活性劑濃度的增加而系統(tǒng)地下降。(d)充氣微膠囊的粒徑圖3顯示了根據(jù)實(shí)施例3(b)制得的充氣微膠囊的體積加權(quán)尺寸分布(Particle Sizing System Company的顆粒計(jì)數(shù)器，AccuSizer770型)，測量范圍在0.8-10μm。初級分散體的粒徑分布對充氣微膠囊的尺寸分布沒有顯著的影響。(e)充氣微膠囊的超聲阻尼(damping)為表征超聲領(lǐng)域中的性質(zhì)，測定根據(jù)實(shí)施例3制得的微膠囊的頻率依賴性超聲吸收(超聲阻尼)。圖4顯示了充氣微膠囊在1-25MHz的頻率范圍內(nèi)的吸收譜。其標(biāo)準(zhǔn)化為最大阻尼值。當(dāng)增加用于制備微膠囊的初級顆粒的尺寸時，最大吸收范圍向更高的超聲頻率移動。(f)微膠囊壁厚在相同的分散條件下，得到相同粒徑(實(shí)施例3(d))但超聲領(lǐng)域中的性質(zhì)差異非常大的微膠囊(實(shí)施例3(e))。如果最大吸收(實(shí)施例3(e))的超聲頻率被認(rèn)為是眾多微膠囊的共振頻率，則該方法可用常規(guī)有關(guān)超聲與氣泡相互作用的理論來描述(N.De Jong Acoustic Propertiesof Ultrasound Contrast Agents，Rotterdam，Diss.1993)，而且可對不同的微膠囊壁厚產(chǎn)生貢獻(xiàn)。
液體中氣泡(無壁)的共振頻率與氣泡的直徑成反比。foBlase=12πr3γPρ]]>其中fo＝共振頻率[s-1]；r＝氣泡的半徑[m]；γ＝氣體的絕熱指數(shù)(Cp/Cv，在此為1.4)P＝主導(dǎo)地位的壓力(1×105N/m2)p＝液體的密度(在此為1×103kg/m3)根據(jù)上述理論，微膠囊的該依賴性必須用包含殼直徑的其他變量來擴(kuò)展 E是殼材料--聚合物的彈性模量(N/m2)；v是Poisson比例(假設(shè)0-0.5的值)，其描述了膨脹部件的體積變化比；而(r-ri)是微膠囊外徑與內(nèi)徑的差，即、壁厚[m]。
圖3(實(shí)施例3(d))表明，在使用不同尺寸分布的初級分散體時，微膠囊的尺寸分布沒有不同。圖4(實(shí)施例3(e))證實(shí)微膠囊的共振頻率隨著用于構(gòu)建微膠囊的初級顆粒粒徑的增加而向更高的超聲頻率移動。用圖3中已知微膠囊的平均尺寸(直徑約2.5μm)和圖4中測定的共振頻率，可用以上等式(2)計(jì)算殼直徑。
表1用于根據(jù)等式(2)計(jì)算殼直徑的測量變量的對比
用殼直徑Se對初級分散體中納米顆粒的平均直徑作圖產(chǎn)生線性依賴(圖5)。顯然，初級顆粒的尺寸直接決定了由此制得的微膠囊的壁厚。
斜率包含彈性模量E和v(見以上所述殼直徑等式(3)的定義)。因?yàn)関可僅假設(shè)為0-0.5之間的值，1-2×106N/m2的彈性模量可容易地由斜率(5×107N/m2)評估，該彈性模量在高分子聚丙烯酸酯(3×109N/m2)和硫化橡膠(3-8×105N/m2)之間。實(shí)施例4官能化充氣微膠囊(方法IV)(a)制備初級分散體為注射目的時，將500ml的水裝入1升的玻璃反應(yīng)器中，其直徑與高度的比為0.5，通過添加1N的鹽酸將pH設(shè)定為2.5，并將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為290.5K。用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌，同時添加5.0g的Octoxynol，并攪拌至Octoxynol完全溶解。然后在相同的攪拌條件下，在15分鐘的時間滴加7g的氰基丙烯酸丁基酯，并再攪拌2小時。(b)制備微膠囊懸浮液用Ultraturrax(如IKA，T25型)在高剪切梯度(Ultraturrax的空轉(zhuǎn)速度為約20,500min-1)下分散初級分散體2小時。通過該分散，進(jìn)行處理介質(zhì)的自加氣，其結(jié)果是強(qiáng)烈形成泡沫。反應(yīng)結(jié)束后，形成充氣微膠囊的乳化層。為用于注射，由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用375ml的水處理。如此得到的微膠囊懸浮液中，聚合物的含量為8.45mg/ml，pH為3.8(24.1℃)。(c)通過部分側(cè)鏈水解對充氣微膠囊進(jìn)行官能化在攪拌下，使50ml根據(jù)實(shí)施例4(b)的微膠囊懸浮液與100ml如下濃度的氫氧化鈉溶液混合6.0×10-5mol/l(c1)、6.6×10-4mol/l(c2)和7.2×10-3mol/l(c3)。在反應(yīng)混合物中，所得的pH值分別是7.7(c1)、10.6(c2)和11.7(c3)。反應(yīng)約2小時后，用鹽酸將pH設(shè)定為3。(d)充氣微膠囊的粒徑圖6顯示了充氣微膠囊的體積加權(quán)尺寸分布(Particle Sizing SystemCompany的顆粒計(jì)數(shù)器，AccuSizer770型)，測量范圍在0.8-10μm。僅在最大的氫氧化鈉溶液濃度(c3)時可以觀察到尺寸分布的輕微變化。這有可能是因?yàn)楸诤竦慕档?。在該條件下，沒有觀察到聚集現(xiàn)象和顆粒濃度的變化。(e)根據(jù)實(shí)施例4的微膠囊的體外超聲有效性為表征超聲領(lǐng)域中的性質(zhì)，測定微膠囊的頻率依賴性超聲吸收(超聲阻尼)。圖7顯示了充氣微膠囊在1-20MHz的頻率范圍內(nèi)的吸收譜。將其標(biāo)準(zhǔn)化為最大阻尼值。與根據(jù)實(shí)施例4(b)未經(jīng)處理的微膠囊相比，根據(jù)實(shí)施例4(c1)和4(c2)的微膠囊的吸收譜容易地遷移至更低的超聲頻率。根據(jù)實(shí)施例4(c3)的微膠囊(用氫氧化鈉溶液進(jìn)行最劇烈的表面處理)，其最大吸收范圍清晰地遷移至更低的超聲頻率。該遷移有可能是因?yàn)楸诤竦慕档?，并相?yīng)于粒徑分布的結(jié)果。
除圖7中所示的相對吸收光譜外，圖8還顯示了5MHz的診斷相關(guān)測量頻率的超聲阻尼的絕對值。該對比說明超聲有效性參數(shù)隨著官能化程度的增加(氫氧化鈉溶液的濃度)而顯著地增長。
所有測量都是在2.5×106顆粒/ml(在0.01％TritonX100)的恒定微膠囊濃度下進(jìn)行的。實(shí)施例6官能化的充氣微膠囊(方法III)(a)制備初級分散體將pH為2.5的1％Octoxynol水溶液7升引入20升的玻璃反應(yīng)器中，并在高剪切梯度下用轉(zhuǎn)子-定子混合器混合，以進(jìn)行自加氣，并強(qiáng)烈形成泡沫?？焖俚?＜1分鐘)添加100g的氰基丙烯酸丁基酯并分散。在自加氣的情況下使其聚合60分鐘，由此形成充氣微膠囊。在分離漏斗中，分離浮集的材料，排出下清液(subnatant)，并將浮集的材料重新用3升的0.02％octoxynol溶液懸浮。由此得到的微膠囊懸浮液的聚合物含量為9.46mg/ml，密度為0.943g/ml，而pH為3.5。(b)通過部分側(cè)鏈水解對充氣微膠囊進(jìn)行官能化使根據(jù)(a)的微膠囊懸浮液2418g(b1)或者2500g(b2)分別與濃度為8×10-2mol/l的239g(b1)或者501g(b2)氫氧化鈉混合，同時進(jìn)行攪拌。反應(yīng)混合物中得到的pH值分別為11.8(b1)或12.1(b2)。在室溫下攪拌20分鐘。然后，用1N鹽酸將pH設(shè)定為3.5。(c)充氣微膠囊的粒徑圖9顯示了充氣微膠囊的體積加權(quán)尺寸分布(Particle Sizing SystemCompany的顆粒計(jì)數(shù)器，AccuSizer770型)，它們是在0.8-10μm的測量范圍內(nèi)制備的。(d)凍干以及丁醇含量的測定(官能化的證明)為注射目的，用水將根據(jù)實(shí)施例6(a)和(b)的懸浮液稀釋至聚合物含量為約4mg/ml。然后在各混合物中，設(shè)定10％的聚乙烯吡咯烷酮濃度，配制10g的懸浮液并凍干。
通過氣相色譜(頭-空間法，載氣氦，固定相DB624，裝置Perkin-Elmer HS40)，測定1-丁醇含量。與實(shí)施例6(a)未經(jīng)官能化的微膠囊相比，根據(jù)實(shí)施例6(b1)的官能化微膠囊的值高5倍，而且根據(jù)實(shí)施例6(b2)發(fā)現(xiàn)1-丁醇含量高20倍。
表2丁醇含量測定
(e)表面電荷測定用的拮抗滴定用Muetek滴定器(titrator)PCD 02進(jìn)行電荷測量。樣品在四個稀釋度(0.3％＜聚合物含量＜1.2％)下用濃度為0.1mmol的P-DADMAC溶液滴定至電荷中性。由單個測量的補(bǔ)償線(在給定的聚合物含量下消耗的P-DADMAC溶液)以及微膠囊的平均粒徑計(jì)算電荷密度。在圖10中描繪了測量結(jié)果。對于根據(jù)實(shí)施例6(a)的非官能化微膠囊懸浮液，用該方法沒有測到明顯的電荷密度。對于根據(jù)實(shí)施例6(b)的官能化微膠囊，由補(bǔ)償線的斜率得到表面電荷密度為4.2μC/cm2(b1)或者5.1μC/cm2(b2)。電荷密度隨反應(yīng)物中氫氧化鈉溶液濃度的增加而增加。對于根據(jù)實(shí)施例6(a)的非官能化微膠囊，產(chǎn)生沒有顯著斜率的補(bǔ)償線。(f)稀釋穩(wěn)定性為注射目的，用水將根據(jù)實(shí)施例6(a)和(b)的懸浮液的微膠囊濃度設(shè)定為5×109顆粒(≥1μm)/ml(the Particle Sizing Systems Company的顆粒計(jì)數(shù)器，AccuSizer 770型)。為研究稀釋穩(wěn)定性，在每種情況下用體積逐漸增加的等滲食鹽溶液稀釋1ml的懸浮液，并在30分鐘的時間(同時輕微攪拌)后肉眼研究微膠囊聚集。
在體積增加500％(1ml微膠囊懸浮液+5ml等滲食鹽溶液)后，未官能化的微膠囊已明顯趨于聚集，而官能化的微膠囊在體積增加2000％(1ml微膠囊懸浮液+20ml等滲食鹽溶液)后仍是未聚集的。(g)體外分解為注射目的，用水將懸浮液的微膠囊濃度設(shè)定為5×109顆粒(≥1μm)/ml(the Particle Sizing Systems Company的顆粒計(jì)數(shù)器，AccuSizer770型)。為研究分解動力學(xué)，在790nm的波長(Shimadzu Company的光譜儀UV-2401PC)和25℃下進(jìn)行混濁的時間依賴性測量。為此目的，將0.5ml的相應(yīng)制劑直接在測量杯中用2.0ml的氫氧化鈉溶液(濃度1.25×10-3mol/l)稀釋，使得pH被設(shè)定為11。60秒后，開始測量。例如，圖11顯示了根據(jù)實(shí)施例6(a)(未官能化的)和實(shí)施例6(b2)(官能化的)制得的充氣微膠囊的結(jié)果。
與未經(jīng)處理的樣品相比，官能化微膠囊的停留時間減少約75％，而最大溶出率(拐點(diǎn)的增加)由0.37％trans./s(未官能化的)增加至0.86％trans./s(官能化的)。(h)體內(nèi)超聲有效性將一畢格爾犬(體重約為12kg)麻醉(吸入麻醉空氣+2-3％安氟醚；自發(fā)呼吸)，然后用于心臟的聲譜研究。用ATL公司(UM9型，L10/5換能器)的超聲裝置在用于低、中和高傳送幅度的光譜Doppler模式下進(jìn)行該研究。
在每種情況下，測試動物接受靜脈給藥根據(jù)上述6(a)(未官能化的)和實(shí)施例6(b2)(官能化的)制備的測試物質(zhì)。
作為參考物質(zhì)，使用類似于WO 93/25242的實(shí)施例23制備的造影劑，其中用聚乙烯吡咯烷酮作為低溫保護(hù)劑。
對于所有的測試物質(zhì)，所用的劑量都是3×107顆粒/kg體重。
圖12顯示了累積Doppler強(qiáng)度(強(qiáng)度-時間曲線下的面積)，而圖13顯示了參考物質(zhì)和測試物質(zhì)的超聲造影時間。
非常明顯，根據(jù)實(shí)施例6(b2)的官能化充氣微膠囊比根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的未經(jīng)官能化的充氣微膠囊具有明顯更好的造影性質(zhì)。這表現(xiàn)為更高的累積強(qiáng)度和更寬的診斷時間窗。
根據(jù)實(shí)施例6(b2)的官能化充氣微膠囊的有效性值增加50％，而造影時間擴(kuò)大約2倍。實(shí)施例7官能化的充氣微膠囊(方法I)將pH為2.5的1％Octoxynol水溶液7升引入20升的玻璃反應(yīng)器中，并在高剪切梯度下用轉(zhuǎn)子-定子混合器混合，以進(jìn)行自加氣，并強(qiáng)烈形成泡沫?？焖俚?＜1分鐘)添加75g氰基丙烯酸丁基酯與15g氰基丙烯酸的混合物并分散。在自加氣的情況下使其聚合60分鐘，由此形成充氣微膠囊。在分離漏斗中，分離浮集的材料，排出下清液，并將浮集的材料重新用3升的0.02％octoxynol溶液懸浮。由此得到的懸浮液包含0.5-10μm的充氣微膠囊(Malvem Instruments Company的激光衍射計(jì)，MastersizerS型)。實(shí)施例8官能化充氣微膠囊(方法II)(a)制備初級分散體為注射目的時，將500ml的水裝入1升的玻璃反應(yīng)器中，其直徑與高度的比為0.5，通過添加1N的鹽酸將pH設(shè)定為1.5，并將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為290.5K。用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌，同時添加5.0g的Octoxynol，并攪拌至Octoxynol完全溶解。然后在相同的攪拌條件下，在15分鐘的時間滴加6.0g的氰基丙烯酸丁基酯和1.0g的氰基丙烯酸，并再攪拌2小時。所得的初級分散體通過動態(tài)光散射(裝置NicompSubmicron Particle Sizer)進(jìn)行測量，并表明納米顆粒在50-120nm的范圍內(nèi)。(b)制備微膠囊懸浮液用Ultraturrax(如IKA，T25型)在高剪切梯度(Ultraturrax的空轉(zhuǎn)速度為約20,500min-1)下分散初級分散體2小時。通過該分散，進(jìn)行處理介質(zhì)的自加氣，其結(jié)果是強(qiáng)烈形成泡沫。反應(yīng)結(jié)束后，形成充氣微膠囊的乳化層。為用于注射，由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用375ml的水處理。如此得到的微膠囊懸浮液包含0.5-10μm的微膠囊(MalvemInstruments Company的激光衍射計(jì)，MastersizerS型)。(c)凍干將40g的聚乙烯吡咯烷酮溶解在上述物料中，將懸浮液配制成5g并凍干。實(shí)施例9官能化充氣微膠囊(方法V)(a)制備初級分散體為注射目的時，將500ml的水裝入1升的玻璃反應(yīng)器中，其直徑與高度的比為0.5，通過添加1N的鹽酸將pH設(shè)定為1.5，并將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為290.5K。用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌，同時添加5.0g的Octoxynol，并攪拌至Octoxynol完全溶解。然后在相同的攪拌條件下，在15分鐘的時間滴加7g的氰基丙烯酸丁基酯，并再攪拌2小時。(b)初級分散體的官能化在初級分散體中，用165ml的0.1N氫氧化鈉溶液將pH設(shè)定為11，并同時攪拌，然后在室溫下攪拌20分鐘。接著，用13ml的0.1N鹽酸將pH調(diào)節(jié)至3。(c)制備微膠囊懸浮液用Ultraturrax(如IKA，T25型)在高剪切梯度(Ultraturrax的空轉(zhuǎn)速度為約20,500min-1)下分散已官能化的初級分散體。通過該分散，進(jìn)行處理介質(zhì)的自加氣，其結(jié)果是強(qiáng)烈形成泡沫。反應(yīng)結(jié)束后，形成充氣微膠囊的乳化層。
為用于注射，由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用375ml的水處理。如此得到的微膠囊懸浮液包含0.5-10μm的微膠囊(Malvem InstrumentsCompany的激光衍射計(jì)，MastersizerS型)。實(shí)施例10將HAS結(jié)合至官能化的充氣微膠囊上在至少5x下進(jìn)行浮集，由此從0.02％ Triton-X100溶液中純制根據(jù)實(shí)施例6(b2)的微膠囊懸浮液。1ml經(jīng)純制的微膠囊懸浮液(濃度為5×109顆粒/ml)與10μl的10％HAS溶液混合，然后在4℃下攪拌60分鐘。接著，加入10mg的(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽)(EDC)，并用0.1N的鹽酸將pH調(diào)節(jié)至6.5。在4℃下保溫約16小時，并同時攪拌。
HAS所結(jié)合的充氣微膠囊通過重復(fù)浮集未結(jié)合的HAS及副產(chǎn)物來分離。蛋白量的57％結(jié)合至微膠囊上(UV光譜)。實(shí)施例11將聚乙二醇結(jié)合至官能化的充氣微膠囊上在至少5x下進(jìn)行浮集，由此從0.02％Triton-X100溶液中純制根據(jù)實(shí)施例6(b2)的微膠囊懸浮液。1ml經(jīng)純制的微膠囊懸浮液(濃度為5×109顆粒/ml)與10μl的10％胺端基的聚乙二醇(HO-POE-NH2/3000道爾頓)溶液混合，然后在4℃下攪拌60分鐘。接著，加入10mg的EDC，并用0.1N的鹽酸將pH調(diào)節(jié)至6.5。在4℃下保溫約16小時，并同時攪拌。HO-POE-NH2所結(jié)合的充氣微膠囊通過重復(fù)浮集未結(jié)合的HO-POE-NH2及副產(chǎn)物來分離。所用的HO-POE-NH2中有70％結(jié)合至微膠囊上(根據(jù)G.E.C.Sims，T.J.A.Snope使用碘-PEG復(fù)合物的比色法，Ann.Biochem.，107，60-63(1980))。實(shí)施例12將L-選擇蛋白結(jié)合至官能化的充氣微膠囊上在至少5x下進(jìn)行浮集，由此從0.02％ Triton-X100溶液中純制根據(jù)實(shí)施例6(b2)的微膠囊懸浮液。將1ml經(jīng)純制的微膠囊懸浮液(濃度為5×109顆粒/ml)在10mmol的乙酸鹽(pH 4.0)中重新緩沖，然后用0.1M的EDC/NHS活化。接著，在室溫下與0.25mg的蛋白G(5倍過量)溫育1小時。該反應(yīng)通過與1M乙醇胺溫育15分鐘來終止。
蛋白G所結(jié)合的充氣微膠囊通過最大500g離心以及重復(fù)洗滌進(jìn)行純制。經(jīng)純制并結(jié)合蛋白G的微膠囊與100μg的L-選擇蛋白-1g-嵌合體過夜溫育。
L-選擇蛋白量中有50％結(jié)合至微膠囊上(FACS測量含有抗選擇蛋白抗體的飽和系列)。實(shí)施例13將鏈霉抗生物素結(jié)合至官能化的充氣微膠囊上并隨后偶聯(lián)至生物素-金顆粒在至少5x下進(jìn)行浮集，由此從0.02％Triton-X100溶液中純制根據(jù)實(shí)施例6(b2)的微膠囊懸浮液。1ml經(jīng)純制的微膠囊懸浮液(濃度為5×109顆粒/ml)與1ml的2％鏈霉抗生物素溶液混合，然后在4℃下攪拌60分鐘。接著，加入10mg的EDC，并用0.1N的鹽酸將pH調(diào)節(jié)至6.5。在4℃下保溫約16小時，并同時攪拌。鏈霉抗生物素所結(jié)合的充氣微膠囊通過重復(fù)浮集未結(jié)合的蛋白及副產(chǎn)物來分離。
如此純制的微膠囊-鏈霉抗生物素構(gòu)建物500μl在室溫下與500μ1的平均直徑為17-23nm的生物素-白蛋白-金顆粒分散體(SigmaBiochemicals)混合。通過電子顯微鏡(透射)檢查偶聯(lián)是否成功(圖14)。
然后在相同的攪拌條件下，在15分鐘的時間將7g的氰基丙烯酸丁基酯滴入氮?dú)饬髦?，并再攪?小時。(b)制備微膠囊懸浮液在氮?dú)饬髦杏肬ltraturrax(如IKA，T25型)在高剪切梯度(Ultraturrax的空轉(zhuǎn)速度為約20,500min-1)下分散初級分散體。通過該分散，進(jìn)行處理介質(zhì)的自加氣，其結(jié)果是強(qiáng)烈形成泡沫。反應(yīng)結(jié)束后，形成充氣微膠囊的乳化層。
由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用375ml預(yù)先用氬氣飽和的水處理。接著在氬氣流中，傾析最多10g并氣密密封。如此得到的微膠囊懸浮液包含0.5-10μm的微膠囊(Malvem Instruments Company的激光衍射計(jì)，MastersizerS型)。(c)氮?dú)馓畛涞臋z測直接在玻璃容器中借助Raman光譜(裝置Dilor Labram)在微膠囊懸浮液上方的氣室中進(jìn)行氮?dú)鈾z測。為此目的，首先在2200-2400cm-1以及50-150cm-1(無效值)的范圍內(nèi)進(jìn)行測量。然后，用超聲(30分鐘超聲浴，裝置Bandelin Sonorex)破壞微膠囊，然后重新測量。破壞微膠囊后，可清晰地看見在2300cm-1處的N2振動帶和在50-1500cm-1處的N2特異性旋轉(zhuǎn)帶。實(shí)施例15官能化充氣微膠囊(官能單體甲基丙烯酸縮水甘油酯)(a)制備初級分散體為注射目的時，將500ml的水裝入1升的玻璃反應(yīng)器中，其直徑與高度的比為0.5，通過添加1N的鹽酸將pH設(shè)定為1.5，并將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為290K。用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌，同時添加5.0g的Octoxynol，并攪拌至Octoxynol完全溶解。使6.0g的氰基丙烯酸丁基酯與1.0g的甲基丙烯酸縮水甘油酯(2，3-環(huán)氧丙基甲基丙烯酸酯)混合，然后在干燥的氮?dú)庵袑⒘硗?00mg的AIBN(疊氮-二-異丁基腈)溶解在上述混合物中。
在15分鐘的時間內(nèi)將該混合物滴加至酸性octoxynol溶液中，同時用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌--沒有自加氣，并在318K下另外再攪拌24小時。用動態(tài)光散射(裝置Nicomp Submicron Particle Sizer)測量所得的初級分散體，表明納米顆粒在30-200nm的范圍內(nèi)。(b)制備微膠囊懸浮液用Ultraturrax(如IKA，T25型)在高剪切梯度(Ultraturrax的空轉(zhuǎn)速度為約20,500min-1)下分散初級分散體。通過該分散，進(jìn)行處理介質(zhì)的自加氣，其結(jié)果是強(qiáng)烈形成泡沫。反應(yīng)結(jié)束后，形成充氣微膠囊的乳化層。為注射目的，由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用375ml的水處理。如此得到的微膠囊懸浮液包含0.5-10μm的微膠囊(MalvemInstruments Company的激光衍射計(jì)，MastersizerS型)。實(shí)施例16官能化充氣微膠囊(官能單體4-氨基苯乙烯)(a)制備初級分散體為注射目的時，將500ml的水裝入1升的玻璃反應(yīng)器中，其直徑與高度的比為0.5，通過添加1N的鹽酸將pH設(shè)定為1.5，并將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為283K。用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌，同時添加5.0g的Octoxynol，并攪拌至Octoxynol完全溶解。使6.0g的氰基丙烯酸丁基酯與1.0g的4-氨基苯乙烯混合。在15分鐘的時間內(nèi)將該混合物滴加至酸性octoxynol溶液中，同時用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌--沒有自加氣。反應(yīng)混合物用實(shí)驗(yàn)室UV燈照射，并在283K下另外再攪拌24小時。用動態(tài)光散射(裝置Nicomp Submicron Particle Sizer)測量所得的初級分散體，表明納米顆粒在50-200nm的范圍內(nèi)。(b)制備微膠囊懸浮液用Ultraturrax(如IKA，T25型)在高剪切梯度(Ultraturrax的空轉(zhuǎn)速度為約20,500min-1)下分散初級分散體。通過該分散，進(jìn)行處理介質(zhì)的自加氣，其結(jié)果是強(qiáng)烈形成泡沫。反應(yīng)結(jié)束后，形成充氣微膠囊的乳化層。為注射目的，由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用375ml的水處理。如此得到的微膠囊懸浮液包含0.5-10μm的微膠囊(MalvemInstruments Company的激光衍射計(jì)，MastersizerS型)。實(shí)施例17官能化充氣微膠囊(官能單體Inisurf聚乙二醇偶氮引發(fā)劑(PEGA200))(a)制備初級分散體為注射目的時，將500ml的水裝入1升的玻璃反應(yīng)器中，其直徑與高度的比為0.5，通過添加1N的鹽酸將pH設(shè)定為1.5，并將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為290K。用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌，同時添加5.0g的Octoxynol，并攪拌至Octoxynol完全溶解。在室溫下使1.0g的聚乙二醇偶氮引發(fā)劑([NC(CH3)2COO(CH2CH2O)5H]2(Tauer，K.；Polym.Adv.Techn.6，435(1995)))溶解在6.0g的氰基丙烯酸丁基酯中。
在15分鐘的時間內(nèi)將該混合物滴加至酸性octoxynol溶液中，同時用螺旋槳攪拌器進(jìn)行攪拌--沒有自加氣，并在318K下另外再攪拌24小時。用動態(tài)光散射(裝置Nicomp Submicron Particle Sizer)測量所得的初級分散體，表明納米顆粒在30-200nm的范圍內(nèi)。(b)制備微膠囊懸浮液用Ultraturrax(如IKA，T25型)在高剪切梯度(Ultraturrax的空轉(zhuǎn)速度為約20,500min-1)下分散初級分散體。通過該分散，進(jìn)行處理介質(zhì)的自加氣，其結(jié)果是強(qiáng)烈形成泡沫。
反應(yīng)結(jié)束后，形成充氣微膠囊的乳化層。為注射目的，由反應(yīng)介質(zhì)中分離浮集材料，并用375ml的水處理。如此得到的微膠囊懸浮液包含0.5-10μm的微膠囊(Malvem Instruments Company的激光衍射計(jì)，MastersizerS型)。實(shí)施例18將MECA79抗體結(jié)合至官能化的充氣微膠囊上在至少5x下進(jìn)行浮集，由此從0.02％ Triton-X100溶液中純制根據(jù)實(shí)施例6(b2)的微膠囊懸浮液。將1ml經(jīng)純制的微膠囊懸浮液(濃度為5×109顆粒/ml)在10mmol的乙酸鹽(pH4.5)中重新緩沖，然后用0.1M的EDC/NHS活化。接著，在室溫下與0.25mg的鏈霉抗生物素(5倍過量)溫育1小時。該反應(yīng)通過與1M乙醇胺溫育15分鐘來終止。
鏈霉抗生物素所結(jié)合的充氣微膠囊通過最大500g離心以及重復(fù)洗滌進(jìn)行純制。經(jīng)純制并結(jié)合生物素的微膠囊與1mg生物素化的MECA79抗體溫育1小時，然后洗滌。用生物素化的同型IgM抗體(克隆R4-22)類似地制備對照微膠囊?？贵w用量中有50％結(jié)合至微膠囊上(FACS測量含有抗選擇蛋白抗體的飽和系列)。
MECA79抗體檢測“外周結(jié)addressin”，其是一種僅組成性地出現(xiàn)于外周和腸系淋巴結(jié)的高內(nèi)皮小靜脈上的配基。實(shí)施例19體內(nèi)檢測和聲譜檢測MECA79抗體聚合物微膠囊在外周和腸系淋巴結(jié)中的特異性濃集
NMRI小鼠靜脈注射含有100μl實(shí)施例18的MECA79抗體聚合物微膠囊懸浮液的等滲含水分散體(107顆粒/kg鼠體重)。對照小鼠接受可比量的同型IgM抗體-聚合物微膠囊懸浮液。30分鐘后，殺死動物。取出外周及腸系淋巴結(jié)、脾和腎，然后嵌入凝膠床作為成像模型。按照諧色(harmonic color)Doppler模式掃描上述模型，由此進(jìn)行微膠囊的檢測。在兩個動物組(MECA79和同型對照)的脾中，發(fā)現(xiàn)定量可比的微膠囊信號，表明脾巨噬細(xì)胞以非特異性的方式吸收了造影劑。在腎中，沒有發(fā)現(xiàn)微膠囊的信號。但在外周和腸系淋巴結(jié)中，僅在MECA79抗體動物組(圖15A)中發(fā)現(xiàn)微膠囊信號，在同型對照動物組(圖15B)中沒有發(fā)現(xiàn)--用于MECA79抗體微膠囊構(gòu)建體的特異性濃集的檢測。實(shí)施例20將抗鼠CD105抗體結(jié)合至官能化充氣微膠囊上類似于實(shí)施例18將抗鼠CD105抗體結(jié)合至官能化充氣微膠囊上。實(shí)施例21體內(nèi)檢測和聲譜檢測抗鼠CD105抗體聚合物微膠囊在腫瘤中的特異性濃集在無毛鼠的F9腫瘤模型中研究根據(jù)實(shí)施例20的抗鼠CD105抗體聚合物微膠囊懸浮液。在非麻醉狀態(tài)下，將測試物質(zhì)靜脈一次性地以2.1×107顆粒/kg鼠體重的劑量給藥于兩只攜帶腫瘤的無毛小鼠。兩只對照小鼠以相同的劑量接受根據(jù)實(shí)施例13的微膠囊-鏈霉抗生物素構(gòu)建體。30分鐘后，殺死動物。切除腫瘤，并在裝有ATL公司之超聲裝置(UM9型，L10-5換能器)的水槽內(nèi)以諧色Doppler活體外聲譜研究該腫瘤，其中使用高的聲幅。
圖16B顯示了由經(jīng)照射的根據(jù)實(shí)施例20的充氣微膠囊開始的鼠腫瘤中的色彩編碼。圖16A沒有微膠囊引發(fā)的彩色信號，表明是對照物質(zhì)。這是腫瘤中抗CD105抗體聚合物微膠囊構(gòu)建物的特異性濃集的檢測。實(shí)施例22將抗鼠ICAM-1抗體結(jié)合至官能化充氣微膠囊上類似于實(shí)施例18將抗鼠ICAM-1抗體結(jié)合至官能化充氣微膠囊上。用生物素化的同型IgG抗體制備對照微膠囊。實(shí)施例23體內(nèi)檢測和聲譜檢測抗鼠ICAM-1抗體聚合物微膠囊在腦和脊髓中的特異性濃集在鼠的實(shí)驗(yàn)性自免疫腦炎模型(EAE)中研究根據(jù)實(shí)施例22的抗鼠ICAM-1抗體聚合物微膠囊懸浮液。在非麻醉狀態(tài)下，將測試物質(zhì)靜脈一次性地以1×109顆粒/kg鼠體重的劑量給藥于兩只小鼠。兩只對照小鼠以相同的劑量接受同型IgG抗體聚合物微膠囊懸浮液。
4小時后，殺死動物。取出腦和脊髓，并在裝有ATL公司之超聲裝置(UM9型，L10-5換能器)的水槽內(nèi)以諧色Doppler活體外聲譜進(jìn)行研究，其中使用高的聲幅。圖17B和圖18(2B)顯示了由經(jīng)照射的根據(jù)實(shí)施例22的充氣微膠囊開始的EAE鼠的腦和脊髓/小腦中的色彩編碼。圖17A和圖18(2A)沒有微膠囊引發(fā)的彩色信號，表明是對照物質(zhì)。
(圖18，2脊髓/小腦橫截面掃描圖象的合成圖象；圖18，1脊髓/小腦的目視解剖圖象)。
這是腦和脊髓中抗鼠ICAM-1抗體聚合物微膠囊構(gòu)建物的特異性濃集的檢測。
權(quán)利要求
1.充氣微膠囊，其特征在于包含官能化的聚氰基丙烯酸烷基酯。
2.如權(quán)利要求1所述的充氣微膠囊，其中所述官能化的聚氰基丙烯酸烷基酯是通過使一種或者多種氰基丙烯酸烷基酯與官能單體共聚而制得的。
3.如權(quán)利要求2所述的充氣微膠囊，其中可使用以下單體作為官能單體氰基丙烯酸(H2C＝C(CN)-CO-OH)、甲基丙烯酸(H2C＝C(CH3)-CO-OH)、亞甲基丙二酸(H2C＝C(CO-OH)2)、和α-氰基山梨酸(H3C-CH＝CH-CH＝C(CN)-CO-OH)和/或以下通式表示的衍生物H2C＝C(CN)-CO-X-Z(氰基丙烯酸衍生物)，H2C＝C(CH3)-CO-X-Z(甲基丙烯酸衍生物)，H2C＝C(CO-X′-Z′)2(亞甲基丙二酸衍生物)，以及H3C-CH＝CH-CH＝C(CN)-CO-X-Z(α-氰基山梨酸衍生物)，其中X＝-O-、-NH-、或者-NR1-，以及Z＝-H、-R2-NH2、-R2-NH-R1、-R2-SH、-R2-OH、R2-HC(NH2)-R1、 其中R1＝具有1-20個碳原子的直鏈或者支鏈烷基，而R2＝具有1-20個碳原子的亞烷基，X′和Z′任何情況下都相互獨(dú)立地分別與X和Z的定義相同；取代的苯乙烯(Y-C6H4-CH＝CH2)或者甲基苯乙烯(Y-C6H4-C(CH3)＝CH2)，其中Y＝-NH2、-NR1H、-OH、-SH、-R2-NH2-、-R2-NH-R1、-R2-SH、-R2-OH、-R2-HC(NH2)-R1，其中R1＝具有1-20個碳原子的直鏈或者支鏈烷基，而R2＝具有1-20個碳原子的亞烷基，或者可聚合的乳化劑(Surfmer)、具有官能團(tuán)的引發(fā)劑(Inisurf)以及具有官能團(tuán)的鏈轉(zhuǎn)移劑(Transsurf)。
4.如權(quán)利要求3所述的充氣微膠囊，其中所用的官能單體是氰基丙烯酸(H2C＝C(CN)-CO-OH)或甲基丙烯酸縮水甘油酯(H2C＝C(CH3) ＝2，3-環(huán)氧基丙基甲基丙烯酸酯)。
5.如權(quán)利要求2所述的充氣微膠囊，其中使用氰基丙烯酸丁基酯、乙基酯和/或異丙基酯作為氰基丙烯酸烷基酯。
6.如權(quán)利要求1所述的充氣微膠囊，其中官能化的聚氰基丙烯酸烷基酯是通過部分側(cè)鏈水解聚氰基丙烯酸烷基酯而制得的。
7.如權(quán)利要求6所述的充氣微膠囊，其中使用氰基丙烯酸丁基酯、乙基酯和/或異丙基酯制備聚氰基丙烯酸烷基酯。
8.制備如權(quán)利要求1-5之一所述的充氣微膠囊的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟(a)使官能單體與一種或多種氰基丙烯酸烷基酯混合，(b)在酸性水溶液中，于分散條件下原位共聚合并構(gòu)建微膠囊。
9.制備如權(quán)利要求1-5之一所述的充氣微膠囊的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟(a)使官能單體與一種或多種氰基丙烯酸烷基酯混合，(b)在酸性水溶液中，于攪拌條件下原位共聚合，以及(c)與共聚反應(yīng)單獨(dú)地在分散條件下構(gòu)建微膠囊。
10.制備如權(quán)利要求1、6或7所述的充氣微膠囊的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟(a)在酸性水溶液中，于分散條件下使一種或多種氰基丙烯酸烷基酯原位聚合并構(gòu)建微膠囊，(b)添加堿液進(jìn)行部分側(cè)鏈水解，(c)添加酸使反應(yīng)停止。
11.制備如權(quán)利要求1、6或7所述的充氣微膠囊的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟(a)在酸性水溶液中，于攪拌條件下使一種或多種氰基丙烯酸烷基酯原位聚合，(b)與共聚反應(yīng)單獨(dú)地在分散條件下構(gòu)建微膠囊，(c)添加堿液進(jìn)行部分側(cè)鏈水解，(d)添加酸使反應(yīng)停止。
12.制備如權(quán)利要求1、6或7所述的充氣微膠囊的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟(a)在酸性水溶液中，于攪拌條件下使一種或多種氰基丙烯酸烷基酯原位聚合，(b)在初級分散體中通過添加堿液進(jìn)行部分側(cè)鏈水解，(c)添加酸使反應(yīng)停止，(d)任選重新添加一種或多種氰基丙烯酸烷基酯，在分散條件下構(gòu)建微膠囊。
13.如權(quán)利要求8-12之一所述的制備充氣微膠囊的方法，其中任選地進(jìn)行以下步驟(a)構(gòu)建微膠囊后，進(jìn)行一次或多次浮集，并隨后在生理相容性介質(zhì)中處理浮集的材料，(b)即使在已通過與官能單體的共聚反應(yīng)進(jìn)行官能化的情況下，添加堿液進(jìn)行部分側(cè)鏈水解，由此進(jìn)行另外的官能化，然后添加酸使反應(yīng)停止，(c)過濾、超濾和/或離心以進(jìn)行純制。
14.如權(quán)利要求10-13之一所述的方法，其中部分側(cè)鏈水解是在pH為9-14的條件下進(jìn)行，而反應(yīng)時間為15分鐘-5小時。
15.如權(quán)利要求10-14之一所述的方法，其中添加酸將pH調(diào)節(jié)至低于7，由此使部分側(cè)鏈水解停止。
16.如權(quán)利要求1-15之一所述的方法，其中在酸性水溶液中添加一種或者多種單體，該單體的濃度為0.1-60％，優(yōu)選為0.1-10％。
17.如權(quán)利要求1-16之一所述的方法，其中使用一種或多種以下表面活性劑烷基芳基聚(氧乙烯)硫酸堿金屬鹽、葡聚糖、聚(氧乙烯)、聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)嵌段聚合物、乙氧基化脂肪醇(cetomacrogols)、乙氧基化脂肪酸、烷基酚聚(氧乙烯)、烷基酚聚(氧乙烯)與醛的共聚物、脫水山梨醇的部分脂肪酸酯、聚(氧乙烯)脫水山梨醇的部分脂肪酸酯、聚(氧乙烯)的脂肪酸酯、聚(氧乙烯)的脂肪醇醚、蔗糖的脂肪酸酯或者macrogol甘油酯、聚乙烯醇、聚(氧乙烯)-羥基脂肪酸酯、多元醇的macrogols、部分脂肪酸酯。
18.如權(quán)利要求1-17之一所述的方法，其中使用一種或多種以下表面活性劑乙氧基化壬基酚、乙氧基化辛基酚、醛與辛基酚聚(氧乙烯)的共聚物、乙氧基化甘油-部分脂肪酸酯、乙氧基化氫化蓖麻油、聚(氧乙烯)-羥基硬脂酸酯、分子量小于20000的聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)嵌段聚合物。
19.如權(quán)利要求1-18之一所述的方法，其中使用一種或多種以下表面活性劑平均具有9-10個乙氧基的對辛基酚-聚(氧乙烯)(＝Octoxynol 9，10)，平均具有30/40個乙氧基的對壬基酚-聚(氧乙烯)(＝如Emulan30/Emulan40)，平均具有28個乙氧基的對壬基酚-聚(氧乙烯)硫酸鈉(＝如DisponilAES)，聚(氧乙烯)甘油單硬脂酸酯(如TagatS)，平均聚合度為600-700、水解度為85-90％的聚乙烯醇(＝如Mowiol4-88)，聚(氧乙烯)-660-羥基硬脂酸酯(＝如SolutolHS 15)，甲醛與對辛基酚聚(氧乙烯)的共聚物(＝如TritonWR 1339)，分子量為約12000、聚氧乙烯比例為約70％的聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(＝如LutolF 127)，乙氧基化十六烷基硬脂醇(＝如CremophorA25)，乙氧基化蓖麻油(＝如CremophorEL)。
20.如權(quán)利要求1-19之一所述的方法，其中所述一種或者多種表面活性劑的使用濃度為0.1-10％。
21.如權(quán)利要求1-20之一所述的方法，其中使用以下酸鹽酸、磷酸和/或硫酸。
22.如權(quán)利要求1-21之一所述的方法，其中聚合反應(yīng)及微膠囊的構(gòu)建是在-10℃至60℃、優(yōu)選0-50℃、特別優(yōu)選5-35℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
23.如權(quán)利要求1-22之一所述的方法，其中聚合反應(yīng)及微膠囊的構(gòu)建的時間為2分鐘-2小時。
24.如權(quán)利要求1-23之一所述的方法，其中通過從反應(yīng)介質(zhì)中分離充氣微膠囊，在生理相容性介質(zhì)中處理，然后任選地在添加低溫保護(hù)劑后進(jìn)行凍干。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中使用水或者生理鹽溶液作為生理相容性介質(zhì)以處理浮集材料。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中使用聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、明膠和/或人血清白蛋白作為低溫保護(hù)劑。
27.充氣微膠囊，其是根據(jù)權(quán)利要求8-16之一的方法制得的。
28.如權(quán)利要求1-7之一或27所述的充氣微膠囊，其包含特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)。
29.如權(quán)利要求1-7之一或27所述的充氣微膠囊，其與特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)相偶聯(lián)。
30.如權(quán)利要求28或29所述的充氣微膠囊，其中使用以下物質(zhì)作為特異性結(jié)合分子抗體，優(yōu)選抗EDB-FN抗體、抗endostatin抗體、抗CollXVIII抗體、抗CM201抗體、抗L-選擇蛋白配體抗體如抗PNAd抗體(MECA79抗體)、抗CD105抗體、抗ICAM1抗體，或者內(nèi)原性配體，優(yōu)選L-選擇蛋白，特別優(yōu)選嵌合體L-選擇蛋白。
31.如權(quán)利要求28或29所述的充氣微膠囊，其包含或者偶聯(lián)至以下影響動力學(xué)的物質(zhì)合成的聚合物，優(yōu)選聚乙二醇(PEG)，蛋白，優(yōu)選人血清白蛋白，和/或糖，優(yōu)選葡聚糖。
32.如權(quán)利要求29-31之一所述的充氣微膠囊，其中特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)直接偶聯(lián)至官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的官能團(tuán)上。
33.如權(quán)利要求29-31之一所述的充氣微膠囊，其中特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)通過間隔基團(tuán)、例如蛋白G偶聯(lián)至官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的官能團(tuán)上。
34.如權(quán)利要求29-31之一所述的充氣微膠囊，其中特異性結(jié)合分子或者影響動力學(xué)的物質(zhì)通過鏈霉抗生物素-生物素進(jìn)行生物素化偶聯(lián)在官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的官能團(tuán)上。
35.如權(quán)利要求28-34之一所述的充氣微膠囊，其中官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的官能團(tuán)進(jìn)行活化。
36.如權(quán)利要求28-35之一所述的充氣微膠囊，其中官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的官能團(tuán)用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽)進(jìn)行活化。
37.如權(quán)利要求1-7以及27-36之一所述的充氣微膠囊作為超聲診斷劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含官能化聚氰基丙烯酸烷基酯的充氣微膠囊，其是通過使一種或者多種氰基丙烯酸烷基酯與官能單體共聚或者部分側(cè)鏈水解聚氰基丙烯酸烷基酯而制得的。本發(fā)明還涉及該充氣微膠囊的制備方法以及作為超聲診斷劑的應(yīng)用。
文檔編號A61K49/22GK1424919SQ01806535
公開日2003年6月18日 申請日期2001年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月15日
發(fā)明者格奧爾格·勒塞爾林, 安德烈亞斯·布里爾, 尼爾斯·德布斯, 扎比內(nèi)·敘多, 比爾特·霍夫曼, 彼得·豪夫, 米凱爾·賴因哈特 申請人:舍林股份公司