專利名稱：基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑的制作方法
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本發(fā)明涉及來自天然物質(zhì)的生理活性物質(zhì)的利用，以及以該生理活性物質(zhì)作為有效成分的藥物。
白介素中的白介素6(IL-6)作為誘導B細胞的最終分化的分化因子，其cDNA已被克隆。此后逐漸闡明了IL-6不僅與免疫應答有關，而且與造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的細胞分化和急性反應也有關。另外IL-6與各種免疫異常和炎性疾病、淋巴系腫瘤的發(fā)生也有密切關系。
IL-6誘導B細胞產(chǎn)生抗體，雖然IL-6可誘導產(chǎn)生IgM、IgG、IgA各類免疫球蛋白，但與白介素4不同，它不參與類別轉(zhuǎn)換。IL-6也起著B細胞和漿細胞增殖因子的增殖因子作用。再有，IL-6與T細胞系有關，使T細胞增殖。另外IL-6也與造血系統(tǒng)有關，與白介素3協(xié)調(diào)作用，通過縮短G0期使造血干細胞增殖。另外促進巨核細胞成熟、誘導血小板增加。
另外IL-6也參與生物體對細菌或病毒感染、惡性腫瘤等作出迅速反應的的急性反應。IL-6也與神經(jīng)系統(tǒng)有關，在神經(jīng)胚細胞瘤和星形母細胞瘤等從神經(jīng)系統(tǒng)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)的分化誘導中也有作用[用語文獻「細胞因子和增殖因子」、「實驗醫(yī)學」別冊、p28-29、(1995年)、羊土公司]。
另外已知白介素10(IL-10)是抑制范圍廣泛的細胞因子合成的一類細胞因子，是由II型輔助細胞產(chǎn)生的，通過抑制抗原提示細胞間接地抑制由Th1細胞產(chǎn)生的細胞因子。因此，如果IL-10的生產(chǎn)過量，由于抑制干擾素γ等的產(chǎn)生，會使免疫力下降。
另外，作為具有白血球趨向化因子群的趨化因子與過敏性炎癥和自我免疫疾病有密切關系。趨化因子按照它們的氨基酸序列中的半胱氨酸的位置大致可分為CXC趨化因子和CC趨化因子2個家族。作為前者如巨噬細胞炎癥蛋白2-β(MIP2β)、巨噬細胞炎癥蛋白2-α(MIP2α)、生長調(diào)節(jié)蛋白1(Gro1)等，作為后者如巨噬細胞炎癥蛋白1-α(MIP1α)、RANTES[RANTES(調(diào)節(jié)激活、正常T細胞表達和分泌)]、巨噬細胞炎癥蛋白1-β(MIP1β)、肝和激活作用調(diào)節(jié)性趨化因子(LARC)、由巨噬細胞衍生的趨化因子(MDC)等。
另外已知腫瘤壞死因子α(TNFα)直接引起慢性風濕性關節(jié)炎等自我免疫疾病和炎性疾病中炎癥。
由此看來，細胞因子本來對生物體的恒定性的維持很重要，但其生產(chǎn)過度時，也會變成引起與免疫、炎癥反應有關的各種疾病的發(fā)病原因。
另外除了上述那樣細胞因子的作用以外，已知花生四烯酸代謝也與生物體內(nèi)組織的炎癥和疼痛的起因有密切關系，所以人們認為與花生四烯酸代謝有關的前列腺素G/H合成酶-2(COX2)等作用的調(diào)節(jié)在與上述疾病的關系中也很重要。
另外，活性氧也與炎癥疾病有很大關系?；钚匝醮笾路譃樽杂苫头亲杂苫钚匝酢Ｔ谧杂苫到y(tǒng)活性氧中包括羥基自由基、羥過氧自由基、過氧自由基、烷氧自由基、二氧化氮、一氧化氮、チイル基、超氧化物。非自由基系統(tǒng)活性氧中包括單線態(tài)氧、過氧化氫、脂質(zhì)氫過氧化物、次亞氯酸、臭氧、過氧亞硝酸。無論哪種活性氧都與多種疾病，即各種炎性疾病、糖尿病、癌、動脈硬化、神經(jīng)疾病、局部缺血再灌注障礙等有關。
在生物體內(nèi)不斷地通過一些途徑生成低濃度的活性氧。這些活性氧有從生理上線粒體等電子傳遞系統(tǒng)漏出的超氧化物和過氧化氫、通過銅和鐵等過渡金屬催化的羥自由基、通過嗜中性細胞和單核細胞等生成的為防止感染的次亞氯酸、由于精氨酸分解生成的NO等，無論哪一種都是不可避免的。對于這些活性氧的生成，生物體具有作為消除活性氧系統(tǒng)的酶、低分子混合物，維持生成和消除的平衡。然而有時不知道生成系統(tǒng)由于什么原因被活化，而相反活性氧的消除系統(tǒng)沒有被活化，當活性氧生成系統(tǒng)相對于消除系統(tǒng)占優(yōu)勢時，生物體就要受到氧化的傷害。這樣的狀態(tài)稱之為氧化應激。而且不僅當生物體內(nèi)平衡瓦解時，而且由于大氣和食品等生物體外的原因，生物體經(jīng)常被暴露于氧化應激中，即便在日常生活中也不能避免氧化應激。
血紅素加氧酶(HO)是與膽紅素的產(chǎn)生有關的生物體內(nèi)的酶。已知在HO中存在著血紅素加氧酶-1(HO1)和血紅素加氧酶-2(HO2)兩種同功酶。而在上述膽紅素中存在著作為脂肪酸抗氧化作用、脂質(zhì)自由基凈化作用、伴隨著嗜中性細胞吞噬作用大量產(chǎn)生的氧自由基引起的磷脂、中性脂肪、膽固醇的過氧化氫產(chǎn)生的抑制作用、與動脈硬化發(fā)病有密切關系的LDL(Low density lipoprotein)生成的抑制作用、單線態(tài)氧的凈化作用等抗氧化物質(zhì)的活性，作為內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)在生物體內(nèi)起著重要的作用。各種自由基不僅作用于脂質(zhì)，也作用于蛋白質(zhì)、核酸等各種各樣的生物體物質(zhì)，成了引起慢性疾病、癌癥的主要原因，但膽紅素可以使這樣的各種自由基減少[「卟啉-血紅素的生命科學-遺傳病和癌癥工學應用的展開-」、「現(xiàn)代醫(yī)學」增刊27、(1995)、東京化學同人]。就是說，HO活性低、HO基因的表達低下妨礙對生物體的氧化應激的適應。因此，可以認為HO的產(chǎn)生誘導對生物體內(nèi)的抗氧化作用、抗炎癥作用有貢獻。
另外有報道說作為細胞因子一種的上述RANTES增強嗜酸性細胞的活性氧產(chǎn)生，可以期待通過抑制RANTES產(chǎn)生，會收到與HO的生成誘導同樣的效果。
已經(jīng)證實在處于應激負荷狀態(tài)和向疾病轉(zhuǎn)移的狀態(tài)中，生物體內(nèi)恒定性維持功能發(fā)生了變化。雖然在生物體內(nèi)的恒定性維持中涉及到各種作用、上述那樣各種生物體內(nèi)分子的復合作用，但從根本上講在生物體內(nèi)存在著基因表達狀態(tài)的惡性變化(表達調(diào)節(jié)失常)。然而在諸如受到應激的狀態(tài)和在避免應激狀態(tài)的過程中在基因水平由調(diào)節(jié)引起的基因表達的調(diào)節(jié)的詳細情況還不清楚，因此有關通過基因水平的調(diào)節(jié)避免基因表達調(diào)節(jié)失常的手段還沒有發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的目的在于提供對干擾素和生物體內(nèi)酶等各種生物體內(nèi)因子的產(chǎn)生進行調(diào)節(jié)、對生物體恒定性的維持和恢復有用的藥物組合物。
如果對本發(fā)明進行概述的話，本發(fā)明的第一個發(fā)明涉及到基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑，其特征是含有從下式(I)、(II)表示的化合物以及它們的鹽類選擇出至少一種化合物作為有效成分。 (式中，X和Y為H或CH2OH、而當X為CH2OH時，Y為H，當X為H時，Y為CH2OH) (式中，R為從含有SH基化合物除去一個SH的殘基)在本發(fā)明的第一個發(fā)明中，作為通過該基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑可以矯正表達調(diào)節(jié)失常的基因有諸如從以下31種基因群中選擇出來的一種以上的基因，這31種基因是白介素-6[interleukin-6(Genbank Accession號M14584)]基因、白介素-10[interleukin-10(Genbank Accession號M57627)]基因、血紅素加氧酶-1[hemeoxygenase-1(Genbank Accession號NM002133)]基因、前列腺素G/H合成酶-2[prostaglandin G/H synthase-2(GenbankAccession號AL033533)]基因、巨噬細胞炎癥蛋白-1-α[macrophage inflammatory protein-1-α(Genbank Accession號M23452)]基因、RANTES[RANTES(Genbank Accession號NM002985)]基因、白介素-1α[interleukin-1α(Genbank Accession號X02851)]基因、白介素-1β[interleukin-1β(Genbank Accession號K02770)]基因、腫瘤壞死因子α[tumor necrosis factorα(Genbank Accession號M10988)]基因、白介素-7受體[interleukin-7 receptor(Genbank Accession號M29696)]基因、巨噬細胞炎癥蛋白-1-β[macrophage inflammatory protein-1-β(Genbank Accession號J04130)]基因、肝和激活作用調(diào)節(jié)性趨化因子[liver and activation-regulatedchemokine(Genbank Accession號D86955)]基因、巨噬細胞衍生的趨化因子[macrophage-derived chemokine(GenbankAccession號U83171)]基因、巨噬細胞炎癥蛋白-2-β[macrophage inflammatory protein-2-β(Genbank Accession號M36821)]基因、巨噬細胞炎癥蛋白-2-α[macrophage inflammatory protein-2-α(Genbank Accession號M36820)]基因、生長調(diào)節(jié)蛋白-1[growth regulated protein-1(Genbank Accession號J03561)]基因、基質(zhì)金屬蛋白酶-9[matrix metalloproteinase-9(GenbankAccession號J05070)]基因、移動抑制因子相關蛋白-8[migration inhibitory factor-relatedprotein-8(Genbank Accession號X06234)]基因、溶菌酶[lyzozyme(Genbank Accession號M21119)]基因、GABA(A)受體相關蛋白[GABA(A)receptor-associatedprotein(Genbank Accession號NM007278)]基因、干擾素誘導17-kDa/15-kDa蛋白[interferon-induced 17-kDa/15-kDa protein(Genbank Accession號M13755)]基因、干擾素誘導蛋白p78[interferon-inducible protein p78(GenbankAccession號M33882)]基因、SCO同系物-2[SCO(cytochrome oxidase deficient，yeast)homolog-2(Genbank Accession號AL021683)]基因、轉(zhuǎn)酮酶[transketolase(Genbank Accession號L12711)]基因、腺苷A2a受體[adenosine A2a receptor(Genbank Accession號S46950)]基因、CD37抗原[CD37 antigen(Genbank Accession號X14046)]基因、備解素P因子[properdin P factor，complement(Genbank Accession號M83652)]基因、G-蛋白信號傳遞的調(diào)節(jié)蛋白-2[regulator of G-proteinsignaling-2(Genbank Accession號L13463)]基因、Nef-相關因子-1[Nef-associated factor-1(Genbank Accession號AJ011896)]基因、骨髓白血病細胞分化蛋白-1[myeloid leukemia celldifferentiation protein-1(Genbank Accession號L08246)]基因、和信號肽酶復合物[signal peptidase complex(18kDa)(GenbankAccession號AF061737)]基因。
本發(fā)明的第二個發(fā)明涉及到對從上述31種基因中選擇出1個以上的基因的表達調(diào)節(jié)失常需要矯正的疾病的治療藥或預防藥，其特征是含有從式(I)表示的化合物、式(II)表示的化合物以及它們的鹽中選擇的化合物作為有效成分。有關的治療藥或預防藥特別適用于需要矯正表達調(diào)節(jié)失常的疾病是炎性疾病的場合。而作為治療藥或預防藥的一種模式如白介素-6產(chǎn)生抑制劑、白介素-10產(chǎn)生抑制劑、血紅素加氧酶產(chǎn)生抑制劑、前列腺素G/H合成酶-2產(chǎn)生抑制劑、巨噬細胞炎癥蛋白-1-α產(chǎn)生抑制劑、RANTES產(chǎn)生抑制劑、腫瘤壞死因子α產(chǎn)生抑制劑等，特別是這里具體例舉的各種生物體內(nèi)因子產(chǎn)生抑制劑或產(chǎn)生誘導劑更適用。
而在本說明書中，「誘導」的意思中包含與投藥前相比，投藥使生物體內(nèi)的目的物質(zhì)的量增加的「增強」意思。
本發(fā)明的第3個發(fā)明涉及到基因表達調(diào)節(jié)失常的矯正方法，其特征是將從式(I)表示的化合物、式(II)表示的化合物以及它們的鹽中選擇出來的至少一種化合物投藥給哺乳動物。利用本發(fā)明的第3個發(fā)明作為可以對基因表達調(diào)節(jié)失常進行矯正的基因如至少從上述31種基因群中選擇出來的一種以上的基因。附圖的簡單說明第1圖是表示在各種培養(yǎng)條件下對細胞進行培養(yǎng)時培養(yǎng)上清中的IL-6的濃度的圖。
第2圖是表示在各種培養(yǎng)條件下對細胞進行培養(yǎng)時培養(yǎng)上清中的IL-10的濃度的圖。
第3圖是表示來自COX2 mRNA的cDNA經(jīng)PCR擴增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖。
第4圖是表示來自MIP1α mRNA的cDNA經(jīng)PCR擴增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖。
第5圖是表示來自RANTEs mRNA的cDNA經(jīng)PCR擴增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖。
第6圖是表示在添加和不添加DGE的各種培養(yǎng)條件下對細胞進行培養(yǎng)時培養(yǎng)上清中的TNFα的濃度的圖。
第7圖是表示在添加和不添加瓊脂二糖的各種培養(yǎng)條件下對細胞進行培養(yǎng)時培養(yǎng)上清中的TNFα的濃度的圖。實施發(fā)明的最好方式在本發(fā)明中作為有效成分使用從上述式(I)表示的化合物、式(II)表示的化合物以及它們的鹽中選擇出來的至少一種化合物。另外象下面敘述的那樣作為前藥可以發(fā)揮作用的該化合物的衍生物也可以使用。因此本發(fā)明中涉及到的有效成分中只要可以獲得本發(fā)明所期望的效果，也包括上述式(I)和式(II)的衍生物和它們的鹽。
本發(fā)明使用的用式(I)表示的化合物可以通過將還原末端含有3，6-脫水半乳糖的化合物，例如瓊脂二糖、κ-角叉藻二糖等維持在中性到堿性的條件下制備。另外也可以將結(jié)構(gòu)中含有3，6-脫水半乳糖的化合物進行不足pH7的酸水解和/或酶分解，然后將得到的酸分解物和/或酶分解物維持在中性到堿性的條件下制備。作為結(jié)構(gòu)中含有3，6-脫水半乳糖的化合物如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉藻二糖等。
維持還原末端含有3，6-脫水半乳糖的化合物，例如瓊脂二糖、κ-角叉藻二糖等處于pH7以上的中性到堿性的條件下，將從這些化合物選擇出的至少一種以上化合物溶解或懸浮之后進行反應的反應液的組成沒有特別限定，但最好是用水(例如蒸餾水、離子交換水、自來水等)作為溶劑，對堿的種類也沒有特別限定，例如可以使用使氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氨等無機鹽、Tris、乙胺、三乙胺等有機堿溶解后的試劑。堿的濃度沒有特別限定，最好使用0.0001～5N濃度、更理想的是使用0.001～1N濃度。另外反應溫度也沒有特別限定，設定在0～200℃比較好，設定在20～130℃更好。而反應時間也沒有特別限定，最好設定在數(shù)秒～數(shù)日。堿的種類和濃度、反應溫度和反應時間以及溶解或懸浮于反應液成為原料的上述化合物的量可以根據(jù)該化合物的種類和作為目標的用式(I)表示的化合物的生成量適當?shù)剡M行選擇。一般來說，pH7以上比較好，選擇高濃度堿、高溫，式(I)表示的化合物的生成要比選擇低濃度堿、低溫條件時快。
例如通過制備瓊脂二糖或κ-角叉藻二糖的pH11.5的溶液，于37℃維持5分鐘就可生成式(I)表示的化合物。
含有生成的式(I)表示的化合物的堿溶液根據(jù)目的，可以用于中和，也可以調(diào)到不足pH7作為酸性溶液使用。
結(jié)構(gòu)中含有3，6-脫水半乳糖的化合物可供不足pH7的酸水解或酶解，而通過象上述那樣維持在中性到堿性條件下，可以獲得式(I)表示的化合物時，作為酸水解最好使用諸如0.001～5N濃度的鹽酸、硫酸、硝酸等無機酸、檸檬酸、甲酸、醋酸、乳酸、抗壞血酸等有機酸，以水作為溶劑制備反應液，將適量的作為原料的化合物溶解或懸浮于反應液中進行反應，反應溫度優(yōu)選是0～200℃，反應時間優(yōu)選是數(shù)秒～數(shù)日。而進行酶解時，與酸水解中所用的反應液和反應條件同樣，例如，作為酶可以適量使用α-瓊脂糖酶，如國際公開第00/50578號專利記載的α-瓊脂糖酶，在該酶表現(xiàn)出活性的條件下進行反應。
作為反應液中含有的本發(fā)明式(I)表示的化合物的純化手段可以使用化學方法、物理方法等眾所周知的純化手段，可以將凝膠過濾、利用分子量分級膜的分級法、溶劑萃取法、離子交換樹脂等各種層析等純化方法組合進行純化。
例如，從瓊脂二糖的中性到堿性條件下的處理物中純化X為CH2OH，而Y為H的式(I)表示的化合物，從κ-角叉藻二糖的中性到堿性條件下的處理物中純化X為H，而Y為CH2OH的式(I)表示的化合物。
本發(fā)明中使用的用式(II)表示的化合物可以通過式(I)表示的化合物和含有SH基的化合物反應生成。
使用的含有SH基的化合物只要是至少含有一個SH基的化合物即可，并沒有特別限定。式(II)中的R表示通過含有SH基的化合物和式(I)表示的化合物的反應，除去式(I)與該含有SH基的化合物結(jié)合中消耗的一個SH基后剩下的殘基。因此當含有SH基的化合物含有2個以上SH基時，R代表的殘基中應當存在一個以上的SH基。有關的含有SH基化合物的例子如巰基甲烷、巰基丁烷、巰基乙醇、含有SH基氨基酸、含有SH基氨基酸的衍生物等。
作為含有SH基的氨基酸例子如半胱氨酸、高半胱氨酸等。而作為含有SH基氨基酸的衍生物如上述氨基酸的衍生物、如半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸的肽、含有半胱氨酸衍生物的肽等。作為半胱氨酸衍生物如半胱氨酸的酰胺化合物、乙?；衔铩Ⅴセ衔锏?。作為含有半胱氨酸的肽只要肽中組成成分有半胱氨酸就可以，并沒有特別限定。作為含有該半胱氨酸的肽包括從寡肽，包括如谷胱甘肽那樣的低分子到蛋白質(zhì)那樣的多肽高分子物質(zhì)。而含有胱氨酸或高胱氨酸的肽在可變成反應中含有半胱氨酸或高半胱氨酸的肽的條件下，例如通過組合還原處理也可以作為本發(fā)明中含有半胱氨酸或高半胱氨酸的肽使用。作為含有半胱氨酸衍生物的肽如在上述含有半胱氨酸的肽中，半胱氨酸是由半胱氨酸衍生物構(gòu)成的物質(zhì)。
作為含有半胱氨酸的肽也包括含有糖質(zhì)、脂質(zhì)等含有半胱氨酸的肽。即使是上述各種物質(zhì)的鹽、酸酐、酯等也可以。
在制造以式(II)表示的化合物時的式(I)表示的化合物與含有SH基化合物的反應只要是在眾所周知的反應條件下進行就可以，只要是含有SH基的化合物具有反應性的條件就可以，并沒有特別限定。例如，在水、PBS等溶液中，使式(I)表示的化合物與含有半胱氨酸或谷胱甘肽等含有SH基的化合物反應，反應溫度優(yōu)選是0～100℃，更理想的溫度是30～50℃，而反應時間優(yōu)選是1小時～1周，更理想的是放置1夜。
作為使式(I)表示的化合物與含有上述SH基的化合物反應生成式(II)表示的化合物的純化、分離手段可以使用化學方法、物理方法等眾所周知的純化手段。例如，可以組合使用作為上述式(I)表示的化合物的純化手段例舉的各種手段。
而式(I)表示的化合物在生物體內(nèi)，例如與含有SH基的化合物(半胱氨酸、谷胱甘肽等)反應，從代謝上也可以轉(zhuǎn)換為本發(fā)明中使用的式(II)表示的化合物。
作為上述式(I)表示的化合物或式(II)表示的化合物的鹽最好是醫(yī)藥上容許的鹽，可以通過眾所周知的方法進行轉(zhuǎn)換。例如與鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸等反應得到的無機鹽、與甲酸、醋酸、草酸、丙二酸、琥珀酸等有機酸反應得到的鹽，或與碘代甲烷等烷基鹵化物、芐基鹵化物等反應得到的銨鹽等。
上述式(I)或式(II)表示的化合物的光學異構(gòu)體、酮-烯醇互變異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體等各種異構(gòu)體都可以在本發(fā)明中使用，無論是分離的各個單個異構(gòu)體，還是其混合物都可以。
本發(fā)明中使用的上述式(I)或式(II)表示的化合物是例如有可能生成酯等在體內(nèi)容易水解，可發(fā)揮所預期效果的衍生物(前藥)。有關前藥的制備根據(jù)眾所周知的方法進行。
另外上述異構(gòu)體和衍生物即使是它們的鹽也可以。
在本發(fā)明中作為有效成分使用的上述式(I)表示的化合物或式(II)表示的化合物以及它們的鹽是以抑制癌細胞(HL-60細胞)增殖的活性作為指標進行探索、發(fā)現(xiàn)的結(jié)果。因此，該有效成分可以認為是具有誘發(fā)細胞程序死亡的活性、抑制癌活性作用的成分。具體來說，該有效成分具有各種生物體內(nèi)因子的產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用、編碼該因子的基因的表達調(diào)節(jié)作用，例如IL-6產(chǎn)生抑制作用、IL-10產(chǎn)生抑制作用、HO產(chǎn)生誘導作用、COX2產(chǎn)生抑制作用、MIP1α產(chǎn)生抑制作用、RANTES產(chǎn)生抑制作用、TNFα產(chǎn)生抑制作用等生理活性。其中作為生理活性這里例舉的各種作用都很顯著。推測這樣的生理活性表現(xiàn)是通過成為產(chǎn)生抑制或產(chǎn)生誘導的對象的各種生物體內(nèi)因子的基因轉(zhuǎn)錄活化抑制或誘導和/或來自各種細胞的產(chǎn)生抑制或誘導起作用的。而其作用對生物體恒定性的維持和恢復有用，也不用特別擔心其副作用。有關的生理活性就像后面實施例所闡明的那樣。另外已經(jīng)確認各種生物體內(nèi)因子的產(chǎn)生抑制作用并不是由細胞毒性所引起的作用。
根據(jù)本發(fā)明可以提供，根據(jù)上述有效成分的活性對本說明書中例舉的那樣的各種生物體內(nèi)因子的基因表達調(diào)節(jié)失常進行矯正的含有上述有效成分的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑，另外還提供含有上述有效成分的需要對生物體內(nèi)因子基因表達調(diào)節(jié)失常進行矯正的疾病的治療藥或預防藥物。作為有關的治療藥或預防藥物，例如需要IL-6產(chǎn)生抑制的疾病、需要IL-10產(chǎn)生抑制的疾病、需要HO產(chǎn)生誘導的疾病、需要COX2產(chǎn)生抑制的疾病、需要MIP1α產(chǎn)生抑制的疾病、需要RANTES產(chǎn)生抑制的疾病、需要TNFα產(chǎn)生抑制的疾病等的治療劑或預防劑。另外作為有關的治療劑或預防劑可以作為IL-6產(chǎn)生抑制劑、IL-10產(chǎn)生抑制劑、HO產(chǎn)生誘導劑、COX2產(chǎn)生抑制劑、MIP1α產(chǎn)生抑制劑、RANTES產(chǎn)生抑制劑、TNFα產(chǎn)生抑制劑使用，這里具體例舉的治療劑或預防劑比較好用。因此，本發(fā)明也包括上述有效成分在IL-6產(chǎn)生抑制劑、IL-10產(chǎn)生抑制劑、HO產(chǎn)生誘導劑、COX2產(chǎn)生抑制劑、MIP1α產(chǎn)生抑制劑、RANTES產(chǎn)生抑制劑或TNFα產(chǎn)生抑制劑制造中的使用。而在本說明書中，所謂「對基因表達調(diào)節(jié)失常進行矯正」，雖然并沒有特別限定，但就由于疾病和種種外部主要原因其表達狀態(tài)脫離正常水平的基因來說是指使該基因的表達轉(zhuǎn)向生物體恒定性恢復的方向。例如，包括對由于疾病表達量上升，使病情惡化的基因的表達量進行抑制，為使疾病康復誘導表達的基因其表達量要維持和增強。就是說，所謂本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑(suppressor forunbalance of gene expressions)是抑制由于疾病和各種外部主要原因引起的基因表達狀態(tài)失常(unbalance of gene expressions)的抑制因子(suppressor)。所以本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑可以用于調(diào)節(jié)失常的基因表達狀態(tài)的改善或預防。換言之，本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑是在基因表達水平上對生物體的恒定性維持有貢獻的物質(zhì)，也可以稱之為基因表達異常的調(diào)節(jié)劑(modulator ofgene expressions disorder)。
在表現(xiàn)出自身免疫疾病那樣癥狀的前房黏液瘤患者中，由腫瘤細胞產(chǎn)生出大量的IL-6。而由于多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓瘤細胞的增殖可被抗IL-6抗體抑制，所以IL-6作為骨髓瘤細胞的自身增殖因子的可能性很大。另外，原發(fā)性腎小球腎炎患者的尿中也含有IL-6，IL-6起著腎小球膜細胞增殖因子的作用。這里例舉的疾病無論那一種都可以認為IL-6的異常產(chǎn)生是其中的一個原因，因此本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑對有關疾病是有用的，而且對于對IL-6基因表達調(diào)節(jié)失常需要矯正的疾病，使用本發(fā)明的治療劑或預防劑，通過抑制IL-6的產(chǎn)生可以預防或治療有關的疾病。
IL-10產(chǎn)生過度時，抑制干擾素γ的產(chǎn)生，結(jié)果抑制免疫。因此，本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑對于IL-10的產(chǎn)生過度作為一個原因免疫被抑制的疾病，例如需要對干擾素γ基因表達調(diào)節(jié)失常進行矯正的疾病(例如，哮喘、花粉癥、特應性皮炎等過敏性疾病)是有用的，而對于對IL-10基因表達調(diào)節(jié)失常需要矯正的疾病，使用本發(fā)明的治療劑或預防劑，通過抑制IL-10的產(chǎn)生可以預防或治療有關的疾病。
在HO中存在著33kDa的HO1和36kDa的HO2的兩種同功酶。HO2具有多附帶了由HO1的N末端一側(cè)的20個氨基酸組成的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)。其余部分的同源性為40～50％，高級結(jié)構(gòu)很相似。兩者在C末端都存在疏水區(qū)，通過該部分與微粒體膜結(jié)合。如果對微粒體膜進行胰蛋白酶處理，由于可以得到具有分解血紅素活性的可溶性級分，所以可以認為含有活性中心的大的結(jié)構(gòu)域從細胞質(zhì)一側(cè)突出。
HO1是誘導酶，在各種細胞中會被作為底物的血紅素、重金屬離子、某些有機化合物、過氧化氫、或熱休克、UV照射、局部缺血那樣的化學的、物理的因素顯著地誘導。HO2是組成酶，出現(xiàn)在各個組織中，特別是在腦和精巢中活性最高。
HO可以將血紅素分解成膽綠素、CO、鐵，膽綠素進一步通過還原酶作用生成膽紅素。該膽紅素可以使各種自由基減少。就是說，通過誘導HO，可以誘導具有抗氧化活性的膽紅素的產(chǎn)生，可以治療或預防由于自由基產(chǎn)生引起的各種疾病(例如各種炎性疾病、糖尿病、癌、動脈硬化、神經(jīng)疾病、局部缺血再灌注障礙等)。即本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑對有關的疾病是有用的，而對于對HO基因的表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的疾病，使用本發(fā)明的治療劑或預防劑，通過誘導HO的產(chǎn)生可以預防或治療有關的疾病。
花生四烯酸代謝與生物體內(nèi)組織的炎癥和疼痛的發(fā)生有密切關系。COX2參與花生四烯酸代謝，通過COX2的作用，來自膜磷脂的花生四烯酸被代謝為前列腺素、前列腺環(huán)素、血栓烷三種物質(zhì)。即利用本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑通過抑制COX2的產(chǎn)生，可以表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛、抗炎作用。而對于對COX2基因表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的疾病，使用本發(fā)明的治療劑或預防劑，通過抑制COX2的產(chǎn)生可以預防或治療生物體內(nèi)組織的炎癥和疼痛的發(fā)生。
所謂趨化因子是具有特定白血球趨化性的細胞因子，與過敏性炎癥、自身免疫疾病有密切關系。趨化因子就像上述那樣分為CXC趨化因子和CC趨化因子兩個亞家族。趨化因子是由92～99個氨基酸組成，含有可分別結(jié)合成二硫鍵的4個半胱氨酸殘基。CXC趨化因子中開始的2個半胱氨酸之間插入了一個其它氨基酸，而CC趨化因子沒有其它氨基酸插入。CXC趨化因子主要對嗜中性細胞表現(xiàn)出趨化作用，而CC趨化因子對淋巴細胞、單核細胞、嗜堿性細胞、嗜酸性細胞表現(xiàn)出趨化作用。
RANTES屬于CC趨化因子，特別對嗜酸性細胞表現(xiàn)出很強的趨化作用。RANTES是由T細胞、B細胞、單核細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、血小板、呼吸道上皮細胞以及嗜酸性細胞本身產(chǎn)生的。RANTES不僅對嗜酸性細胞表現(xiàn)出很強的趨化作用，而且與脫粒也有關系。RANTES有選擇地使記憶T細胞從輔助細胞(CD4+)T細胞遷移，是在過敏性炎癥中起關鍵作用的細胞因子。實際上有報道說哮喘時RANTES上升，而在過敏性結(jié)膜炎中、淚液中存在RANTES。另外也有報道說RANTES可增強嗜酸性細胞活性氧的產(chǎn)生。因此通過抑制RANTES的產(chǎn)生，預料可以預防或治療RANTES細胞作用作為一個病因的哮喘、過敏性炎性疾病(例如過敏性結(jié)膜炎、過敏性皮炎、過敏性胃腸炎、變應性脈管炎、變應性脊髓炎、變應性肉芽腫性血管炎、變應性腦脊髓炎、過敏性鼻炎、變應性膀胱炎等)。另外由于抑制由嗜酸性細胞引起的活性氧的產(chǎn)生，所以在生物體內(nèi)表現(xiàn)出抗氧化效果、抗炎癥效果。因此本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑對RANTES的作用作為一個病因的上述疾病，例如對于作為HO產(chǎn)生誘導有效例舉的疾病是有用的，而對于對RANTES的基因表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的疾病，使用本發(fā)明的治療劑或預防劑，通過抑制RANTES的產(chǎn)生可以預防或治療有關的疾病。
MIP1α也與RANTES一樣都是CC趨化因子，具有CC趨化因子的特征。然而，有報道說MIP1α的趨化作用比RANTES低，例如在支氣管哮喘患者中表現(xiàn)出不同的特征，RANTES從發(fā)作初期上升，而MIP1α在治療后病情進一步惡化前上升。因此通過抑制MIP1α的產(chǎn)生有可能阻止哮喘和上述例舉的那樣的過敏性炎性疾病的惡化。本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑特別對阻止有關疾病的惡化有用，而對于對MIP1α基因表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的疾病，使用本發(fā)明的治療劑或預防劑，通過抑制MIP1α的產(chǎn)生可以預防或治療有關疾病的惡化。
作為在本發(fā)明中使用的有效成分之一的下面敘述實施例中記載的瓊脂寡糖、DGE由于可以對RANTES和MIP1α兩種基因的表達調(diào)節(jié)失常進行矯正，所以認為有預防、治療過敏性炎性疾病以及阻止治療中病體惡化的效果。
另一種細胞因子TNFα在慢性風濕性關節(jié)炎等自身免疫疾病和炎性疾病中直接引起與這些疾病相關的炎癥。
TNFα雖然是作為在腫瘤部位誘導出血性壞死的因子發(fā)現(xiàn)的，但現(xiàn)在認為是與以炎癥作為基本的生物體防御和免疫機制有廣泛關系的細胞因子，TNFα產(chǎn)生調(diào)節(jié)機制的破壞會給宿主帶來各種各樣的不利問題。就是說TNFα過度或無調(diào)節(jié)地產(chǎn)生與包括下列的許多疾病有關[Molecular Medicine、第33卷、第1010～1020頁、第1182～1189頁(1996)]，這些疾病是慢性風濕性關節(jié)炎、風濕性脊髓炎、變形性關節(jié)炎、痛風性關節(jié)炎、敗血病、敗血性休克、內(nèi)毒素休克、革蘭氏陰性菌敗血病、中毒性休克綜合癥、腦型瘧疾、慢性肺炎、移植片對宿主反應、同種移植排斥反應、由流感那樣的傳染病等引起的發(fā)熱和肌肉疼痛、感染或惡性腫瘤的二次惡病質(zhì)、人獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的二次惡病質(zhì)、AIDS、與AIDS有關的綜合癥、疤痕瘤形成、潰瘍性大腸炎、多發(fā)性硬化癥、自身免疫糖尿病和全身性紅斑狼瘡等自身免疫疾病。
因此本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑對上述例舉的那樣的通過TNFα介導的或惡化的疾病有用，而對于對TNFα基因表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的疾病，使用本發(fā)明的治療劑或預防劑，通過抑制TNFα的產(chǎn)生可以預防或治療這樣的疾病。例如通過使用本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑，可以改善炎癥、風濕病、特別是慢性風濕性關節(jié)炎的癥狀、作為炎癥標志的C反應蛋白質(zhì)(CRP值)、類風濕因子(rheumatoidfactorRF)值、紅血球沉降速度(血沉)值驟減，步行困難等復雜癥狀也有顯著改善。
另外在本發(fā)明中使用的上述有效成分具有對生物體的恒定性維持重要的其它各種生物體內(nèi)因子的基因表達調(diào)節(jié)失常進行矯正的作用。
生物受到來自生活環(huán)境的變化等外部原因、來自病毒、細菌感染等內(nèi)部原因的各種各樣的應激。作為應激如處于高溫、低溫環(huán)境、饑餓狀態(tài)、暴露于化學物質(zhì)等。例如作為化學物質(zhì)如十四烷?；鸩ù即姿狨?TPA)、脂多糖(LPS)、植物血細胞凝集素(PHA)、Okadicacid等。其中，TPA和LPS用于人體會引起炎癥，利用這樣的作用可以用于以人工制造炎癥模型為目的的用途中。
受到上述那樣應激的結(jié)果使得生物體內(nèi)各種各樣基因的表達發(fā)生變化。其中既有誘導或增強表達、對生物體帶來壞影響的基因群(A群)，也有通過抑制表達給正常生活的生命活動帶來支撐的基因群(B群)。受到應激，上述各種基因群的表達調(diào)節(jié)的失常狀態(tài)如果繼續(xù)下去，就會導致各種各樣疾病的發(fā)生。因此使受到應激時基因表達的變動恢復到正常時的狀態(tài)就會治療和預防各種各樣疾病。
就是說，通過本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑可以使包括上述細胞因子類和各種酶類、任何應激產(chǎn)生的表達調(diào)節(jié)失常的那樣的各種生物體內(nèi)因子的基因表達調(diào)節(jié)失常狀態(tài)恢復到通常狀態(tài)(保持恒定性的健康狀態(tài))。
例如，作為本發(fā)明的有效成分可以使用的后面敘述的實施例中記載的DGE作為可以將基因表達調(diào)節(jié)失常矯正到正常狀態(tài)的基因，具體如表1和表2所示。
表1基因名稱(縮寫) Genebank Accession號● 細胞因子和細胞因子受體白介素-6(IL-6)M14584白介素-1α(IL-1α)X02851白介素-1β(IL-1β)K02770腫瘤壞死因子α(TNFα) M10988白介素-7受體(IL-7r) M29696● CC趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白-1-β(MIP1β)J04130肝和激活作用調(diào)節(jié)性趨化因子(LARC) D86955巨噬細胞衍生的趨化因子(MDC) U83171● CXC趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白--2-β(MIP2β) M36821巨噬細胞炎癥蛋白--2-α(MIP2α) M36820生長調(diào)節(jié)蛋白-1(Gro1) J03561
表2基因名稱(縮寫) Genebank Accession號● 其它基因基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)J05070移動抑制因子相關蛋白-8(MRP8) X06234溶菌酶(Lyz)M21119GABA(A)受體相關蛋白(GABArp)NM007278干擾素誘導17-kDa/15-kDa蛋白M13755(IFNp15/p17)干擾素誘導蛋白p78(IFNp78) M33882SCO(cytochrome oxidase deficient， AL021683yeast)同系物-2(SCO2)轉(zhuǎn)酮酶(TK) L12711腺苷A2a受體(ADORA2A) S46950CD37抗原(CD37) X14046備解素P因子(PFC) M83652G-蛋白信號傳遞的調(diào)節(jié)蛋白-2(RGS2) L13463Nef-相關因子-1(NAF1) AJ011896骨髓白血病細胞分化蛋白-1(MCL1) L08246信號肽酶復合物(18kDa)(SPC18) AF061737特別根據(jù)本發(fā)明可以通過提供含有上述有效成分的適用于對從前面表1和表2例舉的各種生物體內(nèi)因子的基因中選擇出的1種以上的基因的表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的炎性疾病的治藥物或預防藥物。
本發(fā)明的基因表達調(diào)節(jié)失常的矯正劑無論是上述有效成分本身，還是含有上述有效成分的組合物都可以。例如可以通過就該有效成分和其它具有同樣使用用途的成分等按照常規(guī)方法進行混合制造。在相關矯正劑中該有效成分的含有量考慮到投藥方法等，最好是按照后面提到的投藥量范圍給出該有效成分的量，并沒有特別限定。另外本發(fā)明的治療劑或預防劑是含有上述有效成分的藥物，可以將該有效成分與眾所周知的醫(yī)藥用載體組合進行制劑。一般來說，就讀有效成分與藥學上容許的液體或固體狀載體配合，根據(jù)需要加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等制成片劑、粒劑、散劑、細粉劑、膠囊等固形劑，通常的液體制劑、懸浮劑、乳劑等液體制劑。另外可以作成在使用前添加適當載體成為液體狀的干燥品。
本發(fā)明的治療劑或預防劑可以通過口服制劑或注射制劑、點滴用制劑等非口服制劑或外用制劑任一種制劑投藥。
醫(yī)藥用載體可以根據(jù)上述投藥方式和制劑類型進行選擇。由固體組合物組成的口服制劑可以作成片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、細粉劑、粒劑等，例如可以利用淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。另外在制備口服制劑時，也可以配合粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑、著色劑、香料等。例如作成片劑或丸劑時，根據(jù)需要也可以用蔗糖、明膠、羧丙基纖維素等糖衣或胃溶性或腸溶性物質(zhì)的膜包被。在制造由液體組合物組成的口服制劑時可以作成制藥學上容許的乳濁劑、溶液制劑、懸浮劑、糖漿等，例如，可以用純化水、乙醇等作為載體。另外根據(jù)需要也可以添加象濕潤劑、懸浮劑那樣的輔助劑、增甜劑、風味劑、防腐劑等。
在制造非口服制劑時，根據(jù)常規(guī)方法將本發(fā)明的上述有效成分溶解或懸浮于作為稀釋劑的注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等，根據(jù)需要通過添加殺菌劑、穩(wěn)定劑、滲透調(diào)節(jié)劑、無痛化劑等制備。另外也可以制造固體組合物、使用前溶解于無菌水或無菌的注射用溶劑中使用。
作為外用制劑包括經(jīng)皮投藥用的或經(jīng)粘膜(口腔內(nèi)、鼻腔內(nèi))投藥用的固體乃至半固體狀、半固體或液體狀的制劑。另外也包括栓劑。例如乳劑、洗劑等懸浮劑、外用酊劑、經(jīng)粘膜投藥用液體制劑等液體狀制劑、油性軟膏、親水性軟膏等軟膏制劑、膜制劑、貼劑、泥敷劑等經(jīng)皮給藥或經(jīng)粘膜投藥用的粘結(jié)劑。
以上各種制劑可以分別利用眾所周知的醫(yī)藥用載體等，根據(jù)合適的常規(guī)方法制造。而相關制劑中有效成分的含量與上述基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑的情形一樣。
例如，上述基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑的投藥可以根據(jù)適合各自制劑形態(tài)的投藥途徑實施。投藥方法也沒有特別限定，可以通過內(nèi)用、外用和注射方式投藥。注射制劑例如可以通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)等投藥，外用制劑也包括栓劑等。
另外，投藥量可以根據(jù)制劑形態(tài)、投藥方法、使用目的、和哺乳動物(例如患者)的年齡、體重癥狀適當?shù)卦O定，沒有一定標準，但上述有效成分的投藥量成人最好是每天10μg～200mg/kg。在以制劑投藥時，有效成分的投藥量如果能在上述理想范圍內(nèi)就可以。但是，由于該投藥量隨著各種條件有所變動，有時投藥量比上述投藥量少也可能就足夠了，或者有時超過上述范圍也是需要的。投藥可以在所需要的投藥量范圍內(nèi)采取1日一次，或1日數(shù)次。而作為經(jīng)口服投藥的方法如上述基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑等可以直接經(jīng)口投藥，或?qū)⑸鲜鲇行С煞秩我馓砑拥斤嬍持?，?jīng)日常攝入也可以獲得本發(fā)明所期望的效果。
而作為本發(fā)明的一種模式提供將上述有效成分用于哺乳動物的基因表達調(diào)節(jié)失常的矯正方法。特別是更適合于用于矯正上述例舉的各種生物體內(nèi)因子的基因、最好是從上述31種基因群中選擇出來的至少1種基因表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的基因。這樣的方法例如對認為有必要對有關基因表達調(diào)節(jié)失常進行矯正的，或?qū)τ羞@樣必要的哺乳動物將上述有效成分以本發(fā)明基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑投藥來實施，通過投藥出現(xiàn)所期望的生物體內(nèi)因子的產(chǎn)生誘導或產(chǎn)生抑制，使生物體內(nèi)的恒定性恢復。有效成分的投藥方法、投藥量可以根據(jù)上述基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑等實施。在相關的方法中上述矯正劑等適合用作各種因子的產(chǎn)生誘導劑或產(chǎn)生抑制劑。
另外作為本發(fā)明的一種模式也提供各種生物體內(nèi)因子、例如與細胞因子類和酶有關的疾病的治療劑或預防劑的篩選方法。相關的篩選方法例如是通過對于編碼上述例舉的各種生物體內(nèi)因子的基因、最好是從上述31種基因群中選擇出來的至少1種基因經(jīng)處理使其表達量發(fā)生變化，研究被檢測物質(zhì)能否對上述基因的表達量變化進行矯正來實施的。
而在本發(fā)明中使用的上述有效成分中無論那一種即使經(jīng)口一次投藥100mg/kg也沒有發(fā)現(xiàn)死亡的例子。實施例以下給出實施例對本發(fā)明進行更具體說明，但本發(fā)明不限定于這些實施例。
制造例1 L-甘油基-1，5-環(huán)氧-1αβ，6-二羥基-順-己-3-烯-2-酮(DGE)and D-甘油基-1，5-環(huán)氧-1αβ，6-二羥基-順-己-3-烯-2-酮(κ-DGE)的制備市售的瓊脂(Agar Noble)2.5g懸浮于50ml的0.1N HCI中，于100℃下加熱13分鐘，進行溶解。冷卻到室溫，用NaOH將pH調(diào)至12，然后進行中和處理。
對中和處理物進行以下正相HPLC，得到各個峰的級分，減壓干燥后溶解在水中。使用HL-60細胞對各個級分的癌細胞增殖抑制活性進行測定，確認在保留時間為4.05分～4.16分的級分中存在癌細胞增殖抑制活性。
然后大量提取4.05～4.16分鐘的級分，進行結(jié)構(gòu)解析，確認該級分是L-甘油基-1，5-環(huán)氧-1αβ，6-二羥基-順-己-3-烯-2-酮(L-glycero-1，5-epoxy-1αβ，6-dihydroxy-cis-hexa-3-en-2-oneDGE)。以下給出了常規(guī)HPLC的條件柱子PALPAK TypeS(4.6mm×250mm、寶酒造公司生產(chǎn))移動相A90％乙腈水溶液移動相B50％乙腈水溶液流速1ml/分洗脫移動相A(10分鐘)→從移動相A到移動相B的直線梯度洗脫(40分鐘)→移動相B(10分鐘)檢測195nm的吸光度柱溫40℃同樣κ-角叉藻二糖的堿處理根據(jù)上述瓊脂情形處理，從得到的堿處理物中同樣可以純化D-甘油基-1，5-環(huán)氧-1αβ，6-二羥基-順-己-3-烯-2-酮(κ-DGE)。
κ-角叉藻二糖制備如下。即將κ-角叉聚糖(carrageenan)(Sigma公司生產(chǎn)、C-1263)2.5g懸浮于50ml的0.1N HCI中，于100℃下加熱16分鐘，進行溶解。冷卻到室溫，用NaOH將pH調(diào)至中性附近，然后用Cosmonise Filter S(ナカライテスク社制)進行過濾，用下常規(guī)HPLC進行分離，收集保留時間為27.8分的κ-角叉藻二糖，減壓干燥后，制備κ-角叉藻二糖。以下給出了常規(guī)HPLC的條件柱子PALPAK TypeS(4.6mm×250mm、寶酒造公司生產(chǎn))移動相A90％乙腈水溶液移動相B50％乙腈水溶液流速1ml/分洗脫移動相A(10分鐘)→從移動相A到移動相B的直線梯度洗脫(40分鐘)→從移動相B(10分鐘)檢測195nm的吸光度柱溫40℃制造例2 5-L-谷光甘肽-S-基-2-羥基-3，7-二氧雜雙環(huán)[2.2.2]辛-1-醇(DGE-GSH)的制備將DGE和還原型谷胱甘肽(GSHnakalaitesque公司生產(chǎn))分別溶解于PBS中，使終濃度為20mM，于37℃下反應過夜。將該反應液100μl用正相柱PAL-PAK TypeS進行分級。流速1ml/分，0～10分鐘用90％乙腈水溶液洗，10～50分鐘用90％乙腈水溶液到50％乙腈水溶液梯度進行洗脫，于檢測波長195nm下進行正相層析，每1.5分鐘收集一次級分。對各個級分進行濃縮干燥后，再溶解于50μl的蒸餾水中，使用HL-60細胞對各個級分的癌細胞增殖抑制活性進行測定。結(jié)果確認級分30～40附近的級分能夠抑制細胞增殖。將同樣制備的活性級分50μl進行反相層析(TSKgel ODS-80Ts(5μm)/東洋曹達公司生產(chǎn)、4.6mm×250mm)分級。于流速1ml/分鐘，0～15分鐘用含有0.1％TFA的蒸餾水洗，15～30分鐘用從含有0.1％TFA的蒸餾水到含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液的直線梯度洗，30～45分鐘用含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液洗脫，檢測波長215nm的條件下進行層析，每1.5分鐘收集一次級分。對各個級分進行濃縮干燥后，再溶解于50μl的蒸餾水中，使用HL-60細胞對各個級分的癌細胞增殖抑制活性進行測定。結(jié)果確認級分保留時間在4～9分鐘附近的級分有抑制細胞增殖活性。
將上述正相的層析反復進行10次，獲得讀活性級分，濃縮干燥后，再溶解于1ml的蒸餾水中通過正相層析制備純化級分。然后將該正相層析得到的純化級分進行上述的反相層析，得到活性級分，濃縮干燥。結(jié)果從20mM DGE和20mM的谷胱甘肽的1ml反應液可以得到5mg的活性化合物。對該化合物的結(jié)構(gòu)進行確定，確認該化合物就是5-L-谷胱甘肽-S-基-2-羥基-3，7-二氧雜雙環(huán)[2.2.2]辛-1-醇(DGE-GSH)。
結(jié)果可以確認在添加DGE的組中抑制TPA誘導IL-6產(chǎn)生，該抑制依賴于DGE的濃度。結(jié)果如
圖1所示。即，圖1是表示在各種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞時的培養(yǎng)上清中的IL-6的濃度的圖，橫軸表示培養(yǎng)條件，縱軸表示IL-6濃度(ng/ml)。
另外對κ-DGE、DGE-GSH也進行同樣的實驗，確認了IL-6產(chǎn)生抑制作用。
結(jié)果可以確認在添加DGE的組中抑制LPS誘導IL-10產(chǎn)生，該抑制依賴于DGE的濃度。結(jié)果如圖2所示。即，圖2是表示在各種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞時的培養(yǎng)上清中的IL-10的濃度的圖，橫軸表示培養(yǎng)條件，縱軸表示IL-10濃度(pg/ml)。
另外對κ-DGE、DGE-GSH也進行同樣的實驗，確認了IL-10產(chǎn)生抑制作用。
結(jié)果在添加DGE的組中可以看到來自HO1蛋白質(zhì)的帶。而帶的強度依賴于DGE的濃度。其結(jié)果如表3所示。表中HO1蛋白質(zhì)帶的強度用+表示。就是說、表3中完全沒有看到帶的都用-表示，而+-、+、++的順序表示帶強度逐漸增強。
表3樣品 HO1蛋白質(zhì)帶的強度水(陰性對照) -終濃度40μM DGE++終濃度20μM DGE+終濃度10μM DGE+-15-去氧-Δ12，14-前列腺素J2++(陽性對照)另外對κ-DGE、DGE-GSH也進行同樣的實驗，確認了HO產(chǎn)生誘導作用。實施例4(1)PBMC的分離和保存從健康人志愿者采集400ml血。將采集的血用PBS(-)稀釋2倍，鋪在Ficoll-paque(Pharmacia公司生產(chǎn))上，于500×g離心20分鐘。用移液管將中間層的末梢血單核細胞(PBMC)回收，用RPMI1640培養(yǎng)基(Bio Whittaker公司生產(chǎn))洗凈。采集的PBMC懸浮于由90％FCS(JRHbioscience公司生產(chǎn))/10％二甲基亞砜組成的保存液，保存在液氮中。實驗時將這些保存的PBMC于37℃水浴中迅速融解，用含有10μg/ml Dnase(Calbiochem公司生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基洗凈后，通過臺昐藍染色法算出活細胞數(shù)共實驗用。(2)單核細胞的分離將PBMC懸浮于含有5％人AB型血清、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉、2mM L-谷氨酰胺(Bio Whittaker公司生產(chǎn))、10mMHEPES(nakalai tesque公司生產(chǎn))、1％鏈霉素-青霉素(Gibco BRL公司生產(chǎn))的RPMI1640培養(yǎng)基(以下簡稱為5HR PMI培養(yǎng)物)，終濃度為4×106cells/ml，然后鋪在6孔細胞培養(yǎng)板(Falcon公司生產(chǎn))中，每孔3ml，于37℃、5％CO2條件下于濕式孵育箱內(nèi)孵育1.5小時。1.5小時后將非貼壁細胞吸引除去，用RPMI1640培養(yǎng)基將各個孔洗凈，加2ml的5HRPMI培養(yǎng)基，得到單核細胞。(3)RNA的制備對于上述得到的單核細胞向各個孔添加8μl的10mM DGE水溶液或作為對照添加8μl的水，于37℃、5％CO2條件下于濕式孵育箱內(nèi)孵育5小時。然后向各個孔添加2μl的1μg/ml LPS水溶液或2μl的25mM TPA二甲基亞砜溶液，或者什么物質(zhì)也不加再培養(yǎng)4小時后，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司生產(chǎn)，74104)，根據(jù)說明書從各個細胞制備RNA。將對細胞只添加水或只添加DGE水溶液的組作為陰性對照，另外將對細胞添加水和LPS水溶液或TPA溶液的組作為陽性對照。(4)cDNA的合成使用循環(huán)變溫加熱器(GeneAmp PCR System 9600，AppliedBiosystems)將含有上述制備的RNA 0.5μg和10mMTris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、5mMMgCl2、1mMdNTP混合液、150pmol Random6mers、60U的核糖核酸酶抑制劑(寶酒造公司生產(chǎn)2310A)、15U逆轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(寶酒造公司生產(chǎn)，2620A)的總液量為60μl的混合液于30℃保溫10分鐘，然后繼續(xù)于42℃保溫1小時后，為使酶失活于99℃加熱5分鐘，制備cDNA。(5)引物的合成根據(jù)COX2的mRNA的堿基序列[GenBank Accessionn號ALo33533]，設計PCR反應用的寡核苷酸引物，通過DNA合成儀(Applied Biosystems公司生產(chǎn))合成。即分別合成寡核苷酸引物CX1(序列表中序列1所示；以下同樣)、CX2(序列2)。根據(jù)MIP1α的mRNA的堿基序列[GenBank Accessionn號M23452]，分別合成寡核苷酸引物MP1(序列3)、MP2(序列4)。根據(jù)RANTES的mRNA的堿基序列[GenBank Accessionn號NM002985]，分別合成寡核苷酸引物RS1(序列5)、RS2(序列6)。另外作為內(nèi)部標準根據(jù)人β-肌動蛋白的mRNA的堿基序列[GenBank Accessionn號M10277]，分別合成寡核苷酸引物AC1(序列7)、AC2(序列8)。(6)以cDNA為模板通過PCR法擴增DNA片段在含有各5pmol合成的寡核苷酸引物CX1、CX2或MP1、MP2或RS1、RS2和作為內(nèi)部標準β-肌動蛋白的寡核苷酸引物AC1、AC2與上述制備的cDNA溶液2.5μl、10×Ex Taq緩沖液(寶酒造公司生產(chǎn))2.5μl、0.625U TakaRa Ex Taq聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn)，RR001A)、0.2mM dNTP混合液的總液量為25μl的反應系統(tǒng)中，使用循環(huán)變溫加熱器，按照于94℃下2分鐘一個循環(huán)，然后進行每一循環(huán)為95℃30秒、59℃30秒、73℃30秒的30個循環(huán)，最后于72℃5分鐘的一個循環(huán)的程序進行反應。反應后的樣品在分析之前一直冷凍保存在-20℃。
對各個PCR反應液10μl通過2.0％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。結(jié)果可以看到在單獨添加LPS的組中來自COX2、MIP1α、RANTES的各個mRNA帶的擴增。即，這些基因被LPS誘導已被證實。與此相反，在添加DGE和TPA的組中看不到無論來自COX2、MIP1α、RANTES的任一個mRNA帶的擴增。即表明無論由DGE，還是由LPS引起的基因誘導被抑制了。另外，單獨添加TPA的組中，確認了來自COX2、MIP1α的各mRNA的帶的增幅。即，確認了這些基因通過TPA誘導。與此相對，添加了DGE和TPA的組中，確認了來自于COX2、MIP1α的任一個來自于mRNA的帶的擴增。即確認了由DGE、由TPA引起的這些基因的誘導被抑制。其結(jié)果如圖3～5所示。即圖3表示來自COX2的、圖4表示來自MIP1α的、圖5表示來自RANTES的各個mRNA的cDNA經(jīng)PCR擴增的反應液通過電泳分析的結(jié)果。圖3～5中的各個帶分別表示帶1表示100bp DNA ladder marker，帶2表示對照(水)，帶3表示添加DGE組，帶4表示添加LPS組，帶5表示添加DGE和LPS組，帶6表示添加TPA組，帶7表示添加DGE和TPA組。
表4基因名稱(縮寫) Genebank 引物名稱(序列號)Accession號● 細胞因子和細胞因子受體白介素-6(IL-6) M14584 IL6-F(序列號9)IL6-R(序列號10)白介素-1α(IL-1α) X02851 IL1α-F(序列號11)IL1α-R(序列號12)白介素-1β(IL-1β) K02770 IL1β-F(序列號13)IL1β-R(序列號14)腫瘤壞死因子α(TNFα) M10988 TNF-F(序列號15)TNF-R(序列號16)白介素-7受體(IL-7r)M29696 IL7r-F(序列號17)IL7r-R(序列號18)● CC趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白-1-J04130 MIP1β-F(序列號19)β(MIP1β) MIP1β-R(序列號20)肝和激活作用調(diào)節(jié)性趨 D86955 LARC-F(序列號21)化因子(LARC) LARC-R(序列號22)巨噬細胞衍生的趨化因 U83171 MDC-F(序列號23)子(MDC)MDC-R(序列號24)● CXC趨化因子巨噬細胞炎癥蛋白-2-β M36821 MIP2β-F(序列號25)(MIP2β) MIP2β-R(序列號26)巨噬細胞炎癥蛋白-2-α M36820 MIP2α-F(序列號27)(MIP2α) MIP2α-R(序列號28)生長調(diào)節(jié)蛋白-1(Gro1) J03561 Gro1-F(序列號29)Gro1-R(序列號30)
表5基因名稱(縮寫)Genebank 引物名稱(序列號)Accession號● 其它基因基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9) J05070 MMP9-F(序列號31)MMP9-R(序列號32)移動抑制因子相關蛋白- X06234 MRP8-F(序列號33)8(MRP8)MRP8-R(序列號34)溶菌酶(Lyz) M21119 Lyz-F(序列號35)Lyz-R(序列號36)GABA(A)受體相關蛋白 NM007278 GABArp-F(序列號37)(GABArp) GABArp-R(序列號38)干擾素誘導17-kDa/15-kDa M13755 IFNp15/p17-F(序列號39)蛋白(IFNp15/p17) IFNp15/p17-R(序列號40)干擾素誘導蛋白 M33882 IFNp78-F(序列號41)p78(IFNp78)IFNp78-R(序列號42)SCO(cytochrome oxidase AL021683 SCO2-F(序列號43)deficient，yeast)同系物- SCO2-R(序列號44)2(SCO2)轉(zhuǎn)酮酶(TK) L12711 TK-F(序列號45)TK-R(序列號46)腺苷A2a受體(ADORA2A)S46950 ADORA2A-F(序列號47)ADORA2A-R(序列號48)CD37抗原(CD37) X14046 CD37-F(序列號49)CD37-R(序列號50)備解素P因子(PFC)M83652 PFC-F(序列號51)PFC-R(序列號52)G-蛋白信號傳遞的調(diào)節(jié)蛋 L13463 RGS2-F(序列號53)白-2(RGS2) RGS2-R(序列號54)Nef-相關因子-1(NAF1)AJ011896 NAF1-F(序列號55)NAF1-R(序列號56)骨髓白血病細胞分化蛋白- L08246 MCL1-F(序列號57)1(MCL1)MCL1-R(序列號58)信號肽酶復合物 AF061737 SPC18-F(序列號59)(18kDa)(SPC18) SPC18-R(序列號60)(2)以cDNA為模板通過PCR法擴增DNA片段使用上述給出的各個合成的寡核苷酸引物和作為內(nèi)部標準實施例4-(5)合成的1-β-肌動蛋白的寡核苷酸引物AC1、AC2或上述的AC3以及用與實施例4-(4)同樣方法合成的cDNA溶液，用與實施例4-(6)同樣的方法進行PCR反應。PCR的循環(huán)數(shù)象下表表示的那樣進行30循環(huán)或35循環(huán)。反應后的樣品在分析之前一直冷凍保存在-20℃。
對各個PCR反應液5μl通過3.0％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。結(jié)果如表6、7所示。但表中各個基因的表達量(通過來自各個基因的mRNA的cDNA的PCR擴增的程度進行評價)用從表達量少開始依次為-、+/-，+，++，+++5個階段表示。而表中的Con.表示對照(添加水組)，DGE表示添加DGE組，LPS表示添加LPS組，L+D表示添加DGE和LPS組，TPA表示添加TPA組，T+D表示添加DGE和TPA組。
表6基因 Con. DGE LPS L+DTPAT+D 循環(huán)數(shù)· 細胞因子和細胞因子受體IL-6 - - +++ - + - 30IL-1α +/-- +++ +/-+ - 30IL-1β + + +++ + ++ + 30TNFα +/-- +++/-+ +/-30IL-7r+/-- ++- - - 30· CC趨化因子MIP1β+ +/- +++ +/-++ +/-30LARC +/-+/- +++ + ++ + 30MDC - - + - - - 30· CXC趨化因子MIP2β+ + +++ ++ + 30MIP2α+/-+/- + +/-+ +/-35Gro1 + + +++ + ++ + 30
表7基因名稱Con. DGELPSL+D TPAT+D 循環(huán)數(shù)(縮寫)· 其它基因MMP-9- - - - + -30MRP8 + + +/-+ +/-+30Lyz + + +/-+ +/-+30GABArp + + +/-+ + +30IFNp15/p17 + + ++++/- + +/- 30IFNp78 + +/-++ - + +/- 30SCO2 + + - + + +30TK +/- +/-+/-+ - +30ADORA2A + +/-+++- + -35CD37 +/- +/-- + +/-+/- 35PFC + + - + + +35RGS2 +/- +/-- +/- +/-+/- 35NAF1 + - ++ +/- +/--30MCL1 + + +/-+ + +30SPC18+ + +/-+ + +30從以上結(jié)果可知DGE起著對于當將由LPS或TPA造成的應激性刺激加到細胞上時，由于該刺激表達量增大的基因會使其表達量減少，而對于表達量減少的基因會使其表達量增大的作用。即確認DGE在使生物體的恒定性恢復的方向上起作用。序列表說明序列號1和2是根據(jù)人COX2的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號3和4是根據(jù)人MIP1α的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號5和6是根據(jù)人RANTES的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號7和8是根據(jù)人β-肌動蛋白的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號9和10是根據(jù)人IL-6的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號11和12是根據(jù)人IL-1α的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號13和14是根據(jù)人IL-1β的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號15和16是根據(jù)人TNFα的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號17和18是根據(jù)人IL-7r的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號19和20是根據(jù)人MIP1β的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號21和22是根據(jù)人LARC的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號23和24是根據(jù)人MDC的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號25和26是根據(jù)人MIP2β的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號27和28是根據(jù)人MIP2α的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號29和30是根據(jù)人Gro1的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號31和32是根據(jù)人MMP-9的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號33和34是根據(jù)人MRP8的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號35和36是根據(jù)人Lyz的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號37和38是根據(jù)人GABArp的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號39和40是根據(jù)人IFNp15/p17的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號41和42是根據(jù)人IFNp78的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號43和44是根據(jù)人SCO2的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號45和46是根據(jù)人TK的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號47和48是根據(jù)人ADORA2A的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號49和50是根據(jù)人CD37的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號51和52是根據(jù)人PFC的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號53和54是根據(jù)人RGS2的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號55和56是根據(jù)人NAF1的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號57和58是根據(jù)人MCL1的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號59和60是根據(jù)人SPC18的mRNA的堿基序列設計的引物序列。
序列號61是根據(jù)人β-肌動蛋白的mRNA的堿基序列設計的引物序列。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性就像以上記載的那樣，本發(fā)明提供對生物體恒定性維持所必需的，例如白介素類的產(chǎn)生調(diào)節(jié)、生物體內(nèi)酶的產(chǎn)生調(diào)節(jié)有用的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑，另外提供含有矯正劑的對各種生物體內(nèi)的基因表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的疾病的治療劑或預防劑，可以治療或預防由于該因子的產(chǎn)生異常引起的疾病。
另外本發(fā)明提供生物體內(nèi)的基因表達調(diào)節(jié)失常的矯正方法。該方法使用上述矯正劑等，由這些因子進行所期望的因子的產(chǎn)生誘導或產(chǎn)生抑制，使生物體內(nèi)的恒定性恢復。在相關的方法中，上述矯正劑比較適合用作各種因子的產(chǎn)生誘導劑或產(chǎn)生抑制劑。另外作為本發(fā)明的一種模式也提供各種生物體內(nèi)因子、例如與細胞因子類和酶有關的疾病的治療劑或預防劑的篩選方法。
序列表<110>寶酒造株式會社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)<120>治療劑<130>01-011-PCT<150>JP 2000-4989<151>2000-01-13<150>JP 2000-303711<151>2000-10-03<160>61<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人前列腺素G/H合成酶-2的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>1acggtgaaac tctggct 17<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人前列腺素G/H合成酶-2的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>2ggatgctcct gtttaag 17<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞炎癥蛋白-1-(的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>3acattccgtc acctgctcag 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞炎癥蛋白-1-(的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>4ggtcgctgac atatttctgg 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人RANTES的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>5ctccacaggt accatgaagg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人RANTES的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>6gtaagttcag gttcaaggac 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人β-肌動蛋白的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>7tggccgtacc actggcatcg20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人β-肌動蛋白的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>8tccttctgca tcctgtcggc aa 22<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人白介素-6的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>9ccactcacct cttcagaacg20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人白介素-6的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>10gatgagttgt catgtcctgc 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人白介素-1α的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>11gctgcatgga tcaatctgtg 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人白介素-1α的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>12tcttcatctt gggcagtcac 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人白介素-1β的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>13tggcagaagt acctaagctc 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人白介素-1β的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>14catatggacc agacatcacc 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人腫瘤壞死因子α的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>15aaaggacacc atgagcactg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人腫瘤壞死因子α的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>16cgagaagatg atctgactgc 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人白介素-7受體的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>17tggagaaagt ggctatgctc 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人白介素-7受體的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>18ggcggtaagc tacatcatgc20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞炎癥蛋白-1-β的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>19gaagcttctg agttctgcag20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞炎癥蛋白-1-β的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>20ttcctgtctc tgagcagctc20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人肝和調(diào)節(jié)激活的趨化因子的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>21aagagtttgc tcctggctgc 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人肝和調(diào)節(jié)激活的趨化因子的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>22ttggatttgc gcacacagac 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞衍生的趨化因子的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>23acagactgca ctcctggttg 20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞衍生的趨化因子的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>24aggctcttca ttggctcagc 20<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞炎癥蛋白-2-β的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>25cgtggtcact gaactgcgc19<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞炎癥蛋白-2-β的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>26acttctctcc tgtcagttgg 20<210>27<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞炎癥蛋白-2-α的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>27tgctgctcct gctcctgg 18<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人巨噬細胞炎癥蛋白-2-α的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>28ctgcccattc ttgagtgtgg 20<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人生長調(diào)節(jié)蛋白-1的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>29aacatccaaa gtgtgaacgt g 21<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人生長調(diào)節(jié)蛋白-1的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>30ctctgcagct gtgtctctc19<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人基質(zhì)金屬蛋白酶-9的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>31cttctccaga agcaactgtc 20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人基質(zhì)金屬蛋白酶-9的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>32accacaactc gtcatcgtcg 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人移動抑制因子相關蛋白-8的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>33tcatcgacgt ctaccacaag20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人移動抑制因子相關蛋白-8的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>34accagaatga ggaactcctg20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人溶菌酶的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>35tgtcctcctt tctgttacgg20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人溶菌酶的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>36tgacaggcat taactgctcc 20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人GABA(A)受體相關蛋白的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>37aagaagagca tccgttcgag 20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人GABA(A)受體相關蛋白的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>38tggtgttcct ggtacagctg 20<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人干擾素誘導17-kDa/15-kDa蛋白的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>39catgtcggtg tcagagctg19<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人干擾素誘導17-kDa/15-kDa蛋白的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>40ctcacttgct gcttcaggtg 20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人干擾素誘導蛋白p78的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>41gtggctgaga acaacctgtg 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人干擾素誘導蛋白p78的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>42agtcagatcc gggacatctc 20<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人SCO同系物-2的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>43gcagcagcaa aagcgaacag 20<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人SCO同系物-2的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>44gatgaagaca ggctgcactg 20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人轉(zhuǎn)酮酶的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>45cctacgtatc agctccatcc 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人轉(zhuǎn)酮酶的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>46catacagagc cctctgacag 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人腺苷A2a受體的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>47tgtggctcaa cagcaacctg 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人腺苷A2a受體的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>48gaccacatcc tcaaagagac 20<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人CD37抗原的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>49gcctcatcaa gtacttcctc 20<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人CD37抗原的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>50atgaggactt ggaaccagtc 20<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人備解素P因子的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>51ctaccagaaa cgtagtggtg 20<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人備解素P因子的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>52gtgtctcctt aggttcgtgg 20<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人G-蛋白信號調(diào)節(jié)因子-2的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>53ttggctgttc aacacgactg 20<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人G-蛋白信號調(diào)節(jié)因子-2的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>54ggcagttgta aagcagccac 20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人Nef-相關因子-1的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>55agcagaattc accagagagc 20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人Nef-相關因子-1的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>56ttccatcttc ggtgagcctg 20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人骨髓白血病細胞分化蛋白-1的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>57gcatgcttcg gaaactggac 20<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人骨髓白血病細胞分化蛋白-1的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>58gaagttacag cttggagtcc 20<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人信號肽酶復合物(18kDa)的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>59gattgtagtg gtgctcagtg 20<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人信號肽酶復合物(18kDa)的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>60tggcatcttc ccaggaacag 20<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)人β-肌動蛋白的mRNA的核苷酸序列設計的引物。<400>61caagagatgg ccacggctgc t 2權利要求
1.基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑，其特征是含有從下式(I)、(II)表示的化合物以及它們的鹽中選擇出的至少一種化合物作為有效成分， 式中，X和Y為H或CH2OH，其中當X為CH2OH時，Y為H，當X為H時，Y為CH2OH， 式中，R為從含有SH基化合物除去一個SH基的殘基。
2.權利要求1記載的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑，其特征是可以對從以下31種基因群中選擇出來的一種以上的基因的表達調(diào)節(jié)失常進行矯正，這31種基因是白介素-6[interleukin-6(Genbank Accession號M14584)]基因、白介素-10[interleukin-10(Genbank Accession號M57627)]基因、血紅素加氧酶-1[hemeoxygenase-1(Genbank Accession號NM002133)]基因、前列腺素G/H合成酶-2[prostaglandin G/H synthase-2(GenbankAccession號AL033533)]基因、巨噬細胞炎癥蛋白-1-α[macrophage inflammatory protein-1-α(Genbank Accession號M23452)]基因、RANTES[RANTES(Genbank Accession號NM002985)]基因、白介素-1α[interleukin-1α(Genbank Accession號X02851)]基因、白介素-1β[interleukin-1β(Genbank Accession號K02770)]基因、腫瘤壞死因子α[tumor necrosis factorα(Genbank Accession號M10988)]基因、白介素-7受體[interleukin-7 receptor(Genbank Accession號M29696)]基因、巨噬細胞炎癥蛋白-1-β[macrophage inflammatory protein-1-β(Genbank Accession號J04130)]基因、肝和激活作用調(diào)節(jié)性趨化因子[liver and activation-regulatedchemokine(Genbank Accession號D86955)]基因、巨噬細胞衍生的趨化因子[macrophage-derived chemokine(GenbankAccession號U83171)]基因、巨噬細胞炎癥蛋白-2-β[macrophage inflammatory protein-2-β(Genbank Accession號M36821)]基因、巨噬細胞炎癥蛋白-2-α[macrophage inflammatory protein-2-α(Genbank Accession號M36820)]基因、生長調(diào)節(jié)蛋白-1[growth regulated protein-1(Genbank Accession號J03561)]基因、基質(zhì)金屬蛋白酶-9[matrix metalloproteinase-9(GenbankAccession號J05070)]基因、移動抑制因子相關蛋白-8[migration inhibitory factor-relatedprotein-8(Genbank Accession號X06234)]基因、溶菌酶[lyzozyme(Genbank Accession號M21119)]基因、GABA(A)受體相關蛋白[GABA(A)receptor-associatedprotein(Genbank Accession號NM007278)]基因、干擾素誘導17-kDa/15-kDa蛋白[interferon-induced 17-kDa/15-kDa protein(Genbank Accession號M13755)]基因、干擾素誘導蛋白p78[interferon-induced protein p78(GenbankAccession號M33882)]基因、SCO同系物-2[SCO(cytochrome oxidase deficient，yeast)homolog-2(Genbank Accession號AL021683)]基因、轉(zhuǎn)酮酶[transketolase(Genbank Accession號L12711)]基因、腺苷A2a受體[adenosine A2a receptor(genbank Accession號S46950)]基因、CD37抗原[CD37 antigen(Genbank Accession號X14046)]基因、備解素P因子[properdin P factor，complement(Genbank Accession號M83652)]基因、G-蛋白信號傳遞的調(diào)節(jié)蛋白-2[regulator of G-proteinsignaling-2(Genbank Accession號L13463)]基因、Nef-相關因子-1[Nef-associated factor-1(Genbank Accession號AJ011896)]基因、骨髓白血病細胞分化蛋白-1[myeloid leukemia celldifferentiation protein-1(Genbank Accession號L08246)]基因和信號肽酶復合物[signal peptidase complex(18kDa)(GenbankAccession號AF061737)]基因。
3.對從權利要求2記載的基因群中選擇出1個以上的基因表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的疾病的治療藥或預防藥，其特征是含有從下式(I)、(II)表示的化合物以及它們的鹽中選擇出至少一種化合物作為有效成分， 式中，X和Y為H或CH2OH，其中當X為CH2OH時，Y為H，當X為H時，Y為CH2OH， 式中，R為從含有SH基化合物除去一個SH基的殘基。
4.權利要求3記載的治療藥或預防藥，其中的疾病是炎性疾病。
5.權利要求3或4記載的治療藥或預防藥，其是白介素-6產(chǎn)生抑制劑、白介素-10產(chǎn)生抑制劑、血紅素加氧酶產(chǎn)生誘導劑、前列腺素G/H合成酶-2產(chǎn)生抑制劑、巨噬細胞炎癥蛋白-1-α產(chǎn)生抑制劑、RANTES產(chǎn)生抑制劑或腫瘤壞死因子α產(chǎn)生抑制劑。
6.基因表達調(diào)節(jié)失常的矯正方法，其特征是投給哺乳動物以化合物，該化合物是從下式(I)、(II)表示的化合物以及它們的鹽中選擇出的至少一種化合物， 式中，X和Y為H或CH2OH，其中當X為CH2OH時，Y為H，當X為H時，Y為CH2OH， 式中，R為從含有SH基化合物除去一個SH基的殘基。
7.權利要求6記載的基因表達調(diào)節(jié)失常的矯正方法，該方法可對從權利要求2記載的基因群選擇出的一種以上的基因的表達調(diào)節(jié)失常進行矯正。
全文摘要
本發(fā)明提供以特定化合物作為有效成分為特征的基因表達調(diào)節(jié)失常矯正劑，提供特定基因表達調(diào)節(jié)失常需要進行矯正的疾病的治療劑或預防劑，以及以將上述化合物用于哺乳動物為特征的基因表達調(diào)節(jié)失常的矯正方法。
文檔編號A61K31/351GK1418207SQ01806550
公開日2003年5月14日 申請日期2001年1月11日 優(yōu)先權日2000年1月13日
發(fā)明者榎龍嗣, 山下周作, 西村香織, 佐川裕章, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社