一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物的制作方法

一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法，包括以下步驟：利用小麥麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)類芽孢桿菌CGMCC?No.8333，15℃～40℃，震蕩培養(yǎng)18～120小時(shí)得到發(fā)酵液，將所得發(fā)酵液離心后取上清液即得。所得提取物的凝乳酶活力最高達(dá)到6469.72±280.65SU/mL，而且其蛋白酶水解活力僅為10.54±0.65U/mL，兩者之比高達(dá)613.82。利用該發(fā)酵液提取物可使液態(tài)奶在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生凝乳，而且對(duì)酪蛋白的非特異水解低。本發(fā)明公開(kāi)的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物制備干酪的得率很高，該發(fā)酵液提取物在原制干酪生產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]凝乳是生產(chǎn)原制干酪的關(guān)鍵步驟，凝乳酶在此過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并直接關(guān)系到干酪的品質(zhì)和得率。傳統(tǒng)干酪加工中所使用的凝乳酶(rennet)來(lái)源于未斷奶小牛的第四胃(皺胃)，主要由凝乳酶(chymosin)和胃蛋白酶(pepsin)組成。商業(yè)化的小牛皺胃凝乳酶其凝乳酶所占比重在50~95%。凝乳酶介導(dǎo)凝乳反應(yīng)涉及兩個(gè)步驟:(1)酶解酪蛋白:凝乳酶(Chymosin，E.C.3.4.23.4)對(duì)κ-CN具有高度特異性，主要水解κ-CN中的Pheltl5-Metltl6的肽鍵，生成由106-109殘基氨基酸組成的κ -酪蛋白巨肽(κ-caseinmacropeptide)和由1_105殘基氨基酸組成的副κ -酪蛋白(para- κ -casein),凝乳酶也能夠水解a sl_CN、a s2-CN、β -CN ; (2)當(dāng)足夠的κ -CN被水解時(shí)，副κ -酪蛋白發(fā)生聚集形成三維網(wǎng)狀凝膠，Ca2+促發(fā)酪蛋白膠束聚集，進(jìn)而引起酪蛋白膠束失穩(wěn)并形成干酪凝塊。
[0003]干酪加工中使用的凝乳酶的早在50多年前凝乳酶的需求已超過(guò)其產(chǎn)量，與此同時(shí)自1961年以來(lái)，世界干酪產(chǎn)量大約增加了 3.5倍，小牛皺胃凝乳酶供應(yīng)量確呈下降趨勢(shì)，目前，世界小牛皺胃凝乳酶的僅能滿足世界干酪產(chǎn)量所需凝乳酶的20~30%。小牛皺胃凝乳酶的供需矛盾和價(jià)格高昂、宗教(伊斯蘭教和猶太教)、飲食(素食主義)以及食品法規(guī)等因素，使得尋求其替代物成為乳品領(lǐng)域科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，尋求小牛皺胃凝乳酶替代物的研究主要?jiǎng)游铩⒅参?、基因重組以及微生物四個(gè)方面開(kāi)展。動(dòng)物和植物來(lái)源的凝乳酶主要用于特定種類的干酪，其來(lái)源和產(chǎn)量同樣受到限制；利用基因重組技術(shù)制備的凝乳酶具有成分單一等優(yōu)點(diǎn)，但是，一些國(guó)家如法國(guó)、德國(guó)和荷蘭禁止使用重組凝乳酶。
[0004]微生物能夠產(chǎn)生許多種酶類，其中絕大部分`分泌量很小并涉及細(xì)胞代謝過(guò)程，胞外酶能夠消化不溶的纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)作為細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。許多微生物，尤其是霉菌和細(xì)菌來(lái)源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相似的性質(zhì)，與植物和動(dòng)物來(lái)源凝乳酶(MCEs)相比較，微生物來(lái)源的凝乳酶(MCEs)具有生產(chǎn)成本低、具有更加廣泛的生化多樣性以及基因改造方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。微生物來(lái)源凝乳酶可分為兩類:(a)來(lái)源于曲霉(Aspergillus spp.)和根霉菌(Rhizopus spp.)的類胃蛋白酶(pepsin-like) ； (b)來(lái)源于毛霉菌(Mucorspp.)、根霉菌(Rhizomucorspp.)和板栗疫病菌(Endothiaparasitica)的類凝乳酶(rennin-like)。目前，米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)和板栗疫病菌(Endotiaparasitica)三種來(lái)源的凝乳酶已用于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)中，已占到了全球蛋白酶市場(chǎng)的33%。然而，近年來(lái)微生物凝乳酶研究主要集中在芽胞桿菌屬(Bacillus)，所得蛋白酶通常具有較高的蛋白酶水解活力，并具有耐熱性較強(qiáng)、不易滅活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解并轉(zhuǎn)化為乳清，因此，對(duì)干酪得率具有負(fù)面作用，只有部分適合于干酪生產(chǎn)。因此盡管部分微生物凝乳酶已產(chǎn)業(yè)化，篩選新型產(chǎn)凝乳酶的微生物菌種仍是該領(lǐng)域的重要研究工作。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)目前存在的凝乳酶來(lái)源和產(chǎn)量嚴(yán)重不足的技術(shù)問(wèn)題，提供了一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是:一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法，其所述制備方法包括以下步驟:利用小麥麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)類芽孢桿菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC N0.8333,15°C~4CTC,震蕩培養(yǎng) 18 ~120小時(shí)得到發(fā)酵液，將所得發(fā)酵液離心后取上清液即得。
[0007]本發(fā)明所述小麥麩皮培養(yǎng)基包括小麥麩皮和水。其中所述的小麥麩皮為本領(lǐng)域常規(guī)的小麥麩皮，所述小麥麩皮的來(lái)源較佳地包括:山東、河南和江蘇，優(yōu)選的來(lái)源為山東。
[0008]本發(fā)明所述小麥麩皮培養(yǎng)基中小麥麩皮的含量較佳地為1%~14%，更佳地為1%~10%，最佳地為3%，所述百分比為質(zhì)量百分比。本發(fā)明所述菌株類芽孢桿菌CGMCC N0.8333的接種量較佳地為I~9%，更佳地為3%~7%，最佳地為5%，所述百分比為體積百分比。其中所述培養(yǎng)溫度較佳地為20°C~40°C，更佳地為25°C~35°C，最佳地為30°C ;所述震蕩速度較佳地為140~300r/min，更佳地為200~300r/min，最佳地為300r/min，所述培養(yǎng)的時(shí)間較佳地為18~120小時(shí)，更佳地為20~48小時(shí)，最佳地為20小時(shí)，其中所述離心的速度較佳地為9000~14000r/min。
[0009]本發(fā)明所述小麥麩皮培養(yǎng)基包含的營(yíng)養(yǎng)成分較佳地為:蛋白質(zhì):18.6%,脂肪:
6.20%，總碳水化合物:63.9%，水分:7.89%，灰分:3.38%，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0010]本發(fā)明所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法較佳地還包括菌種活化的步驟。所述菌種活化步驟包括:將本發(fā)明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種在TYC培養(yǎng)基中，25°C~35°C培養(yǎng)18~48·小時(shí)作為種子；將活化好的菌種按I~9%的接種量接種于盛有1%~14%的小麥麩皮培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中震蕩培養(yǎng)，250mL錐形瓶裝液量為20mL~IOOmL,搖床轉(zhuǎn)速為140~300r/min，培養(yǎng)溫度為20°C~40°C，培養(yǎng)時(shí)間為18~120小時(shí)，其中所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0011]其中所述菌株類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種量更佳地為I~5%，最佳地為3%，所述百分比為體積百分比；小麥麩皮培養(yǎng)基中的小麥麩皮含量較佳地為1%~14%，更佳地為1%~10%，最佳地為3%，所述百分比為質(zhì)量百分比；250mL錐形瓶中裝液量較佳地為2OmL~IOOmL,更佳地為25mL~75mL，最佳地為30mL ;震蕩培養(yǎng)的震蕩速度較佳地為140~300r/min，最佳地為300r/min ;培養(yǎng)溫度較佳地為25°C~35°C，最佳地為30°C ;活化時(shí)間較佳地為18~48小時(shí)，更佳地為18~24小時(shí)，最佳地為18小時(shí)。
[0012]本發(fā)明所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法較佳地還包括將所得上清液經(jīng)過(guò)精制干燥的步驟，所述精制干燥步驟為本領(lǐng)域常規(guī)的真空冷凍干燥步驟，所述真空冷凍干燥的溫度較佳地為_(kāi)44°C~_40°C，優(yōu)選地為_(kāi)40°C。
[0013]本發(fā)明所述TYC培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的TYC培養(yǎng)基，所述TYC培養(yǎng)基的配方及制備方法較佳地為:酪蛋白胨或胰蛋白胨15g，蔗糖50g，酵母膏5.0g, L-胱氨酸0.2g，乙酸鈉20g, Na2SO40.lg，NaCllg，Na2HPO4.12H202g，NaHC032g，瓊月旨 15_20g，加水至 lL,pH7.3,121°C滅菌15分鐘即得，上述原料的制備方法均為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，或者通過(guò)市售可得。
[0014]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是:如本發(fā)明所述制備方法所得的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物。本發(fā)明制備所得具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的凝乳酶活力比普通的微生物來(lái)源發(fā)酵液提取物的凝乳酶活力更高。
[0015]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三為:本發(fā)明所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在制備凝乳酶中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明所述凝乳酶的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法，只要以本發(fā)明所得具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物為原料進(jìn)行制備即得。
[0017]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之四為:本發(fā)明所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在制備發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明所述發(fā)酵乳制品為本領(lǐng)域常規(guī)發(fā)酵乳制品，較佳地包括發(fā)酵乳，乳酸菌飲料，酸乳粉，發(fā)酵乳酪，更佳地為發(fā)酵乳酪，優(yōu)選地為干酪。
[0019]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0020]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0021]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明所得具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的凝乳酶活力高達(dá)6469.72 ± 280.65SU/mL,并且所得發(fā)酵液提取物的蛋白酶水解活力僅為10.54±0.65~1^，二者之比高達(dá)613.82。本發(fā)明提供的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物能夠使液態(tài)奶在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生凝乳，并且所得發(fā)酵液提取物對(duì)酪蛋白的非特異水解活性極低，因此所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在原制干酪生產(chǎn)加工方面具有廣闊的應(yīng)用前
旦
-5^ O`[0022]生物材料保藏信息
[0023]本發(fā)明的類芽孢桿菌BD3526，已于2013年10月14日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101。該菌株的保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8333。該菌株的分類命名是類芽孢桿菌Paenibacillus sp.，培養(yǎng)物名稱為BD3526。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】本發(fā)明的特征和有益效果。
[0025]圖1為本發(fā)明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333在TYC平板上的菌落圖。
[0026]圖2顯示本發(fā)明類芽孢桿菌CGMCC N0.8333的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。
[0027]圖3為本發(fā)明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333麩皮發(fā)酵上清凝乳形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。本發(fā)明中所述的室溫是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。
[0029]Paenibacillus hunanensis FeL05T (ACCC10718T=CGMCC N0.1.8907τ)與Paenibacillus polymyxa ATCC842T (CGMCC N0.1.4261T)購(gòu)買自自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101)。
[0030]實(shí)施例1菌株BD3526的初篩[0031]從西藏自治區(qū)當(dāng)雄縣采集牦牛奶，以無(wú)菌方式取1ml，用無(wú)菌生理鹽水系列稀釋，通過(guò)涂布的方式將稀釋液均勻涂布于固體TYC培養(yǎng)基上(所述TYC培養(yǎng)基的組分為:酪蛋白胨或胰蛋白胨15g,鹿糖50g，酵母膏5.0g, L-胱氨酸0.2g,乙酸鈉20g,Na2SO40.lg,NaCllg,Na2HPO4.12H202g, NaHC032g，瓊脂15_20g，加水至1L，pH7.3，將上述組分溶解在蒸餾水中，121°C滅菌15分鐘即得)，30°C培養(yǎng)24-48小時(shí)。選取粘鼻涕狀、具有良好拉絲性的單菌落多個(gè)，分別轉(zhuǎn)接到新的固體TYC培養(yǎng)基上，得到純化的菌落。
[0032]實(shí)施例2菌株BD3526的獲得及其特征
[0033]Biolog微生物自動(dòng)檢測(cè)儀(生產(chǎn)廠商:Biolog公司)鑒定實(shí)驗(yàn):
[0034]Biolog微生物自動(dòng)檢測(cè)儀(生產(chǎn)廠商=Biolog公司)鑒定實(shí)驗(yàn),是Biolog公司獨(dú)創(chuàng)的碳源利用方法，利用微生物對(duì)不同碳源進(jìn)行呼吸代謝的差異，篩選95種不同碳源或其他化學(xué)物質(zhì)，配合顯色物質(zhì)，固定于96孔板上(Al孔為陰性對(duì)照)。接種菌懸液培養(yǎng)一定時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的化學(xué)還原物質(zhì)欲顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致的吸光度以及由于微生物生長(zhǎng)造成的濁度，生成特征指紋圖譜，與標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，即可得到最終鑒定結(jié)果。
[0035]I)取如上所述實(shí)施例1中的單菌落多個(gè)，分別接種到液體TYC中，30°C培養(yǎng)24h。
[0036]2)在10000r/min下離心20min,棄去上清液,加ImL生理鹽水,在振蕩器上振動(dòng)5min使之混勻；再于10000r/min下離心20min,重復(fù)2次,除去其中的碳源；棄去上清液,加ImL生理鹽水,在振蕩器上振動(dòng)5min使之混勻，于2000r/min下離心lmin。
[0037]3)取上清液倒入裝有20mL已滅菌生理鹽水(NaCl，0.85%)的試管中，并使其OD59tl 維持在 0.13 ±0.02。
[0038]4)將如上所述稀 釋液加入Biolog ECO微平板中(150 μ L /孔)，然后在20°C下培養(yǎng)，每隔12h用Biolog細(xì)菌自動(dòng)讀數(shù)儀讀取數(shù)據(jù)，連續(xù)測(cè)定2d。結(jié)果如表1所示。
[0039]表1菌株BD3526的Biolog鑒定結(jié)果
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟:利用小麥麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)類芽孢桿菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC N0.8333，15°C~40°C，震蕩培養(yǎng)18~120小時(shí)得到發(fā)酵液，將所得發(fā)酵液離心后取上清液即得。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述小麥麩皮培養(yǎng)基的組分包括小麥麩皮和水，其中小麥麩皮的含量為1%~14%，所述百分比為質(zhì)量百分比。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述小麥麩皮培養(yǎng)基中小麥麩皮的質(zhì)量百分比含量為1%~10%，所述震蕩培養(yǎng)的震蕩速度為140r/min~300r/min，震蕩培養(yǎng)的時(shí)間為20小時(shí)~48小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述離心的溫度為(TC~4°C，離心速度為 9000r/min ~14000r/min。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括菌種活化步驟，所述菌種活化步驟為:將所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種在TYC培養(yǎng)基中，25°C~35°C活化培養(yǎng)18~48小時(shí)作為種子使用；將活化好的菌種按體積百分比I~9%的接種量，接種于包含質(zhì)量百分比為1%~14%小麥麩皮的小麥麩皮培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，活化培養(yǎng)的時(shí)間為18小時(shí)~48小時(shí)，所述震蕩培養(yǎng)的震蕩速度為140~300r/min，震蕩培養(yǎng)的溫度為25°C~35°C ;震蕩培養(yǎng)的時(shí)間為18小時(shí)~120小時(shí)。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括將所得上清液經(jīng)過(guò)精制干燥的步驟，所述精制干燥步驟為真空冷凍干燥，真空冷凍干燥的溫度為-44°C~-40°C。`
8.如權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述制備方法所得的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物。
9.如權(quán)利要求8所述的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在制備凝乳酶中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求8所述的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在制備發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用，其中所述發(fā)酵乳制品為干酪。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103865842SQ201410040762
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】杭鋒, 郭本恒, 劉振民, 陳衛(wèi), 王欽博, 宋馨, 吳正鈞, 張灝, 朱軍偉 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司