两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物的制作方法

文檔序號(hào):469447閱讀:276來(lái)源:國(guó)知局
一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法,包括以下步驟:利用小麥麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)類芽孢桿菌CGMCC?No.8333,15℃~40℃,震蕩培養(yǎng)18~120小時(shí)得到發(fā)酵液,將所得發(fā)酵液離心后取上清液即得。所得提取物的凝乳酶活力最高達(dá)到6469.72±280.65SU/mL,而且其蛋白酶水解活力僅為10.54±0.65U/mL,兩者之比高達(dá)613.82。利用該發(fā)酵液提取物可使液態(tài)奶在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生凝乳,而且對(duì)酪蛋白的非特異水解低。本發(fā)明公開(kāi)的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物制備干酪的得率很高,該發(fā)酵液提取物在原制干酪生產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)中具有廣闊應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]凝乳是生產(chǎn)原制干酪的關(guān)鍵步驟,凝乳酶在此過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,并直接關(guān)系到干酪的品質(zhì)和得率。傳統(tǒng)干酪加工中所使用的凝乳酶(rennet)來(lái)源于未斷奶小牛的第四胃(皺胃),主要由凝乳酶(chymosin)和胃蛋白酶(pepsin)組成。商業(yè)化的小牛皺胃凝乳酶其凝乳酶所占比重在50~95%。凝乳酶介導(dǎo)凝乳反應(yīng)涉及兩個(gè)步驟:(1)酶解酪蛋白:凝乳酶(Chymosin,E.C.3.4.23.4)對(duì)κ-CN具有高度特異性,主要水解κ-CN中的Pheltl5-Metltl6的肽鍵,生成由106-109殘基氨基酸組成的κ -酪蛋白巨肽(κ-caseinmacropeptide)和由1_105殘基氨基酸組成的副κ -酪蛋白(para- κ -casein),凝乳酶也能夠水解a sl_CN、a s2-CN、β -CN ; (2)當(dāng)足夠的κ -CN被水解時(shí),副κ -酪蛋白發(fā)生聚集形成三維網(wǎng)狀凝膠,Ca2+促發(fā)酪蛋白膠束聚集,進(jìn)而引起酪蛋白膠束失穩(wěn)并形成干酪凝塊。
[0003]干酪加工中使用的凝乳酶的早在50多年前凝乳酶的需求已超過(guò)其產(chǎn)量,與此同時(shí)自1961年以來(lái),世界干酪產(chǎn)量大約增加了 3.5倍,小牛皺胃凝乳酶供應(yīng)量確呈下降趨勢(shì),目前,世界小牛皺胃凝乳酶的僅能滿足世界干酪產(chǎn)量所需凝乳酶的20~30%。小牛皺胃凝乳酶的供需矛盾和價(jià)格高昂、宗教(伊斯蘭教和猶太教)、飲食(素食主義)以及食品法規(guī)等因素,使得尋求其替代物成為乳品領(lǐng)域科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,尋求小牛皺胃凝乳酶替代物的研究主要?jiǎng)游铩⒅参?、基因重組以及微生物四個(gè)方面開(kāi)展。動(dòng)物和植物來(lái)源的凝乳酶主要用于特定種類的干酪,其來(lái)源和產(chǎn)量同樣受到限制;利用基因重組技術(shù)制備的凝乳酶具有成分單一等優(yōu)點(diǎn),但是,一些國(guó)家如法國(guó)、德國(guó)和荷蘭禁止使用重組凝乳酶。
[0004]微生物能夠產(chǎn)生許多種酶類,其中絕大部分`分泌量很小并涉及細(xì)胞代謝過(guò)程,胞外酶能夠消化不溶的纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)大分子物質(zhì),并轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)作為細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。許多微生物,尤其是霉菌和細(xì)菌來(lái)源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相似的性質(zhì),與植物和動(dòng)物來(lái)源凝乳酶(MCEs)相比較,微生物來(lái)源的凝乳酶(MCEs)具有生產(chǎn)成本低、具有更加廣泛的生化多樣性以及基因改造方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。微生物來(lái)源凝乳酶可分為兩類:(a)來(lái)源于曲霉(Aspergillus spp.)和根霉菌(Rhizopus spp.)的類胃蛋白酶(pepsin-like) ; (b)來(lái)源于毛霉菌(Mucorspp.)、根霉菌(Rhizomucorspp.)和板栗疫病菌(Endothiaparasitica)的類凝乳酶(rennin-like)。目前,米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)和板栗疫病菌(Endotiaparasitica)三種來(lái)源的凝乳酶已用于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)中,已占到了全球蛋白酶市場(chǎng)的33%。然而,近年來(lái)微生物凝乳酶研究主要集中在芽胞桿菌屬(Bacillus),所得蛋白酶通常具有較高的蛋白酶水解活力,并具有耐熱性較強(qiáng)、不易滅活,導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解并轉(zhuǎn)化為乳清,因此,對(duì)干酪得率具有負(fù)面作用,只有部分適合于干酪生產(chǎn)。因此盡管部分微生物凝乳酶已產(chǎn)業(yè)化,篩選新型產(chǎn)凝乳酶的微生物菌種仍是該領(lǐng)域的重要研究工作。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)目前存在的凝乳酶來(lái)源和產(chǎn)量嚴(yán)重不足的技術(shù)問(wèn)題,提供了一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法及其產(chǎn)物和應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是:一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法,其所述制備方法包括以下步驟:利用小麥麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)類芽孢桿菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC N0.8333,15°C~4CTC,震蕩培養(yǎng) 18 ~120小時(shí)得到發(fā)酵液,將所得發(fā)酵液離心后取上清液即得。
[0007]本發(fā)明所述小麥麩皮培養(yǎng)基包括小麥麩皮和水。其中所述的小麥麩皮為本領(lǐng)域常規(guī)的小麥麩皮,所述小麥麩皮的來(lái)源較佳地包括:山東、河南和江蘇,優(yōu)選的來(lái)源為山東。
[0008]本發(fā)明所述小麥麩皮培養(yǎng)基中小麥麩皮的含量較佳地為1%~14%,更佳地為1%~10%,最佳地為3%,所述百分比為質(zhì)量百分比。本發(fā)明所述菌株類芽孢桿菌CGMCC N0.8333的接種量較佳地為I~9%,更佳地為3%~7%,最佳地為5%,所述百分比為體積百分比。其中所述培養(yǎng)溫度較佳地為20°C~40°C,更佳地為25°C~35°C,最佳地為30°C ;所述震蕩速度較佳地為140~300r/min,更佳地為200~300r/min,最佳地為300r/min,所述培養(yǎng)的時(shí)間較佳地為18~120小時(shí),更佳地為20~48小時(shí),最佳地為20小時(shí),其中所述離心的速度較佳地為9000~14000r/min。
[0009]本發(fā)明所述小麥麩皮培養(yǎng)基包含的營(yíng)養(yǎng)成分較佳地為:蛋白質(zhì):18.6%,脂肪:
6.20%,總碳水化合物:63.9%,水分:7.89%,灰分:3.38%,所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0010]本發(fā)明所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法較佳地還包括菌種活化的步驟。所述菌種活化步驟包括:將本發(fā)明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種在TYC培養(yǎng)基中,25°C~35°C培養(yǎng)18~48·小時(shí)作為種子;將活化好的菌種按I~9%的接種量接種于盛有1%~14%的小麥麩皮培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中震蕩培養(yǎng),250mL錐形瓶裝液量為20mL~IOOmL,搖床轉(zhuǎn)速為140~300r/min,培養(yǎng)溫度為20°C~40°C,培養(yǎng)時(shí)間為18~120小時(shí),其中所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0011]其中所述菌株類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種量更佳地為I~5%,最佳地為3%,所述百分比為體積百分比;小麥麩皮培養(yǎng)基中的小麥麩皮含量較佳地為1%~14%,更佳地為1%~10%,最佳地為3%,所述百分比為質(zhì)量百分比;250mL錐形瓶中裝液量較佳地為2OmL~IOOmL,更佳地為25mL~75mL,最佳地為30mL ;震蕩培養(yǎng)的震蕩速度較佳地為140~300r/min,最佳地為300r/min ;培養(yǎng)溫度較佳地為25°C~35°C,最佳地為30°C ;活化時(shí)間較佳地為18~48小時(shí),更佳地為18~24小時(shí),最佳地為18小時(shí)。
[0012]本發(fā)明所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法較佳地還包括將所得上清液經(jīng)過(guò)精制干燥的步驟,所述精制干燥步驟為本領(lǐng)域常規(guī)的真空冷凍干燥步驟,所述真空冷凍干燥的溫度較佳地為_(kāi)44°C~_40°C,優(yōu)選地為_(kāi)40°C。
[0013]本發(fā)明所述TYC培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的TYC培養(yǎng)基,所述TYC培養(yǎng)基的配方及制備方法較佳地為:酪蛋白胨或胰蛋白胨15g,蔗糖50g,酵母膏5.0g, L-胱氨酸0.2g,乙酸鈉20g, Na2SO40.lg,NaCllg,Na2HPO4.12H202g,NaHC032g,瓊月旨 15_20g,加水至 lL,pH7.3,121°C滅菌15分鐘即得,上述原料的制備方法均為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法,或者通過(guò)市售可得。
[0014]為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二是:如本發(fā)明所述制備方法所得的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物。本發(fā)明制備所得具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的凝乳酶活力比普通的微生物來(lái)源發(fā)酵液提取物的凝乳酶活力更高。
[0015]為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三為:本發(fā)明所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在制備凝乳酶中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明所述凝乳酶的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法,只要以本發(fā)明所得具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物為原料進(jìn)行制備即得。
[0017]為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采取的技術(shù)方案之四為:本發(fā)明所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在制備發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明所述發(fā)酵乳制品為本領(lǐng)域常規(guī)發(fā)酵乳制品,較佳地包括發(fā)酵乳,乳酸菌飲料,酸乳粉,發(fā)酵乳酪,更佳地為發(fā)酵乳酪,優(yōu)選地為干酪。
[0019]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上,上述各優(yōu)選條件,可任意組合,即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0020]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0021]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明所得具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的凝乳酶活力高達(dá)6469.72 ± 280.65SU/mL,并且所得發(fā)酵液提取物的蛋白酶水解活力僅為10.54±0.65~1^,二者之比高達(dá)613.82。本發(fā)明提供的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物能夠使液態(tài)奶在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生凝乳,并且所得發(fā)酵液提取物對(duì)酪蛋白的非特異水解活性極低,因此所述具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在原制干酪生產(chǎn)加工方面具有廣闊的應(yīng)用前

-5^ O`[0022]生物材料保藏信息
[0023]本發(fā)明的類芽孢桿菌BD3526,已于2013年10月14日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC),保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,郵編:100101。該菌株的保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8333。該菌株的分類命名是類芽孢桿菌Paenibacillus sp.,培養(yǎng)物名稱為BD3526。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]以下結(jié)合【專利附圖】
附圖
【附圖說(shuō)明】本發(fā)明的特征和有益效果。
[0025]圖1為本發(fā)明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333在TYC平板上的菌落圖。
[0026]圖2顯示本發(fā)明類芽孢桿菌CGMCC N0.8333的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。
[0027]圖3為本發(fā)明所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333麩皮發(fā)酵上清凝乳形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明,但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,按照常規(guī)方法和條件,或按照商品說(shuō)明書選擇。本發(fā)明中所述的室溫是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度,一般為25°C。
[0029]Paenibacillus hunanensis FeL05T (ACCC10718T=CGMCC N0.1.8907τ)與Paenibacillus polymyxa ATCC842T (CGMCC N0.1.4261T)購(gòu)買自自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,郵編:100101)。
[0030]實(shí)施例1菌株BD3526的初篩[0031]從西藏自治區(qū)當(dāng)雄縣采集牦牛奶,以無(wú)菌方式取1ml,用無(wú)菌生理鹽水系列稀釋,通過(guò)涂布的方式將稀釋液均勻涂布于固體TYC培養(yǎng)基上(所述TYC培養(yǎng)基的組分為:酪蛋白胨或胰蛋白胨15g,鹿糖50g,酵母膏5.0g, L-胱氨酸0.2g,乙酸鈉20g,Na2SO40.lg,NaCllg,Na2HPO4.12H202g, NaHC032g,瓊脂15_20g,加水至1L,pH7.3,將上述組分溶解在蒸餾水中,121°C滅菌15分鐘即得),30°C培養(yǎng)24-48小時(shí)。選取粘鼻涕狀、具有良好拉絲性的單菌落多個(gè),分別轉(zhuǎn)接到新的固體TYC培養(yǎng)基上,得到純化的菌落。
[0032]實(shí)施例2菌株BD3526的獲得及其特征
[0033]Biolog微生物自動(dòng)檢測(cè)儀(生產(chǎn)廠商:Biolog公司)鑒定實(shí)驗(yàn):
[0034]Biolog微生物自動(dòng)檢測(cè)儀(生產(chǎn)廠商=Biolog公司)鑒定實(shí)驗(yàn),是Biolog公司獨(dú)創(chuàng)的碳源利用方法,利用微生物對(duì)不同碳源進(jìn)行呼吸代謝的差異,篩選95種不同碳源或其他化學(xué)物質(zhì),配合顯色物質(zhì),固定于96孔板上(Al孔為陰性對(duì)照)。接種菌懸液培養(yǎng)一定時(shí)間,通過(guò)檢測(cè)微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的化學(xué)還原物質(zhì)欲顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致的吸光度以及由于微生物生長(zhǎng)造成的濁度,生成特征指紋圖譜,與標(biāo)準(zhǔn)菌株圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),即可得到最終鑒定結(jié)果。
[0035]I)取如上所述實(shí)施例1中的單菌落多個(gè),分別接種到液體TYC中,30°C培養(yǎng)24h。
[0036]2)在10000r/min下離心20min,棄去上清液,加ImL生理鹽水,在振蕩器上振動(dòng)5min使之混勻;再于10000r/min下離心20min,重復(fù)2次,除去其中的碳源;棄去上清液,加ImL生理鹽水,在振蕩器上振動(dòng)5min使之混勻,于2000r/min下離心lmin。
[0037]3)取上清液倒入裝有20mL已滅菌生理鹽水(NaCl,0.85%)的試管中,并使其OD59tl 維持在 0.13 ±0.02。
[0038]4)將如上所述稀 釋液加入Biolog ECO微平板中(150 μ L /孔),然后在20°C下培養(yǎng),每隔12h用Biolog細(xì)菌自動(dòng)讀數(shù)儀讀取數(shù)據(jù),連續(xù)測(cè)定2d。結(jié)果如表1所示。
[0039]表1菌株BD3526的Biolog鑒定結(jié)果
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物的制備方法,其特征在于,所述制備方法包括以下步驟:利用小麥麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)類芽孢桿菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC N0.8333,15°C~40°C,震蕩培養(yǎng)18~120小時(shí)得到發(fā)酵液,將所得發(fā)酵液離心后取上清液即得。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述小麥麩皮培養(yǎng)基的組分包括小麥麩皮和水,其中小麥麩皮的含量為1%~14%,所述百分比為質(zhì)量百分比。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述小麥麩皮培養(yǎng)基中小麥麩皮的質(zhì)量百分比含量為1%~10%,所述震蕩培養(yǎng)的震蕩速度為140r/min~300r/min,震蕩培養(yǎng)的時(shí)間為20小時(shí)~48小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述離心的溫度為(TC~4°C,離心速度為 9000r/min ~14000r/min。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述制備方法還包括菌種活化步驟,所述菌種活化步驟為:將所述類芽孢桿菌CGMCC N0.8333接種在TYC培養(yǎng)基中,25°C~35°C活化培養(yǎng)18~48小時(shí)作為種子使用;將活化好的菌種按體積百分比I~9%的接種量,接種于包含質(zhì)量百分比為1%~14%小麥麩皮的小麥麩皮培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,活化培養(yǎng)的時(shí)間為18小時(shí)~48小時(shí),所述震蕩培養(yǎng)的震蕩速度為140~300r/min,震蕩培養(yǎng)的溫度為25°C~35°C ;震蕩培養(yǎng)的時(shí)間為18小時(shí)~120小時(shí)。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法,其特征在于,所述制備方法還包括將所得上清液經(jīng)過(guò)精制干燥的步驟,所述精制干燥步驟為真空冷凍干燥,真空冷凍干燥的溫度為-44°C~-40°C。`
8.如權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述制備方法所得的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物。
9.如權(quán)利要求8所述的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在制備凝乳酶中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求8所述的具有凝乳酶活性的發(fā)酵液提取物在制備發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用,其中所述發(fā)酵乳制品為干酪。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103865842SQ201410040762
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】杭鋒, 郭本恒, 劉振民, 陳衛(wèi), 王欽博, 宋馨, 吳正鈞, 張灝, 朱軍偉 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
男女高潮啪啪啪动态图| 成年人免费黄色播放视频| 欧美黄色淫秽网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久9热在线精品视频| 日本wwww免费看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产1区2区3区精品| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲 国产 在线| 成年动漫av网址| 精品少妇黑人巨大在线播放| 18在线观看网站| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 91精品国产国语对白视频| 97人妻天天添夜夜摸| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久久久久久精品吃奶| 欧美黄色淫秽网站| 一区二区三区乱码不卡18| 精品国产亚洲在线| 蜜桃在线观看..| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 高清黄色对白视频在线免费看| 成人手机av| 久久免费观看电影| 国产成人免费观看mmmm| www.熟女人妻精品国产| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜福利在线观看吧| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲三区欧美一区| 国产欧美日韩一区二区三| 男女免费视频国产| 2018国产大陆天天弄谢| 久热爱精品视频在线9| 啦啦啦免费观看视频1| 久久中文字幕一级| 91麻豆av在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 少妇精品久久久久久久| 69av精品久久久久久 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产有黄有色有爽视频| 热99re8久久精品国产| 国产av国产精品国产| 在线观看www视频免费| 欧美午夜高清在线| 久久精品亚洲av国产电影网| 脱女人内裤的视频| 999精品在线视频| 亚洲,欧美精品.| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产高清videossex| 欧美日韩av久久| 国产xxxxx性猛交| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲七黄色美女视频| 首页视频小说图片口味搜索| 99国产精品一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 一区二区三区激情视频| 另类亚洲欧美激情| 成年人黄色毛片网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久国产精品影院| 99国产精品免费福利视频| 国产色视频综合| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品免费一区二区三区在线 | 男人操女人黄网站| 成人精品一区二区免费| 免费黄频网站在线观看国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜免费成人在线视频| 日韩视频一区二区在线观看| 少妇的丰满在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 午夜福利视频在线观看免费| 夜夜爽天天搞| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 999久久久国产精品视频| 成人免费观看视频高清| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩免费高清中文字幕av| tube8黄色片| 国产男女超爽视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 成年人午夜在线观看视频| 美女视频免费永久观看网站| 老汉色∧v一级毛片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲五月婷婷丁香| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 最新在线观看一区二区三区| 2018国产大陆天天弄谢| 757午夜福利合集在线观看| 日本五十路高清| 露出奶头的视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产精品免费大片| 美国免费a级毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲久久久国产精品| 国产黄色免费在线视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| kizo精华| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美人与性动交α欧美软件| 飞空精品影院首页| av视频免费观看在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久精品亚洲av国产电影网| 日韩大片免费观看网站| 黄色a级毛片大全视频| 美女国产高潮福利片在线看| 91字幕亚洲| 在线天堂中文资源库| 国产精品 国内视频| 最新在线观看一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 一区二区三区乱码不卡18| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产av一区二区精品久久| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 麻豆国产av国片精品| 久久这里只有精品19| 欧美成人免费av一区二区三区 | 日韩人妻精品一区2区三区| 视频在线观看一区二区三区| cao死你这个sao货| 极品教师在线免费播放| 91av网站免费观看| 大香蕉久久成人网| 少妇的丰满在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 日本欧美视频一区| 国产在线视频一区二区| 久久中文字幕一级| 亚洲五月婷婷丁香| 精品国产一区二区久久| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜日韩欧美国产| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品在线美女| av免费在线观看网站| 美女视频免费永久观看网站| 99re在线观看精品视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 黄频高清免费视频| 国产色视频综合| 亚洲精品国产色婷婷电影| 色老头精品视频在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲,欧美精品.| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲国产欧美在线一区| 99国产精品99久久久久| 一级黄色大片毛片| 精品国产一区二区三区四区第35| 91成年电影在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 91麻豆av在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 宅男免费午夜| 女人久久www免费人成看片| 18在线观看网站| 最新在线观看一区二区三区| 久久久国产一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 18禁观看日本| 91成人精品电影| 99在线人妻在线中文字幕 | 两个人免费观看高清视频| 美女高潮到喷水免费观看| 久久性视频一级片| 国产成人av激情在线播放| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美在线一区亚洲| 一区在线观看完整版| 在线播放国产精品三级| 精品高清国产在线一区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 免费少妇av软件| 黄片小视频在线播放| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人免费观看mmmm| 中文字幕高清在线视频| 亚洲色图av天堂| 国产日韩欧美亚洲二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲天堂av无毛| 搡老乐熟女国产| 日日夜夜操网爽| 蜜桃国产av成人99| av欧美777| 欧美激情极品国产一区二区三区| cao死你这个sao货| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产一区二区 视频在线| 一级黄色大片毛片| 热99久久久久精品小说推荐| 国产亚洲精品久久久久5区| 1024视频免费在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产一区二区三区视频了| 日韩成人在线观看一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲视频免费观看视频| 欧美黑人精品巨大| 午夜福利在线免费观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 中文字幕色久视频| 国产片内射在线| 亚洲专区字幕在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品在线美女| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲人成77777在线视频| 女警被强在线播放| av一本久久久久| 亚洲专区国产一区二区| 欧美黑人精品巨大| 国产福利在线免费观看视频| 中文字幕色久视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99香蕉大伊视频| 国产成人免费无遮挡视频| 中文字幕制服av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 最黄视频免费看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲一区二区三区欧美精品| 五月天丁香电影| 啦啦啦 在线观看视频| www.精华液| av线在线观看网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品免费久久久久久久清纯 | 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美另类亚洲清纯唯美| 色在线成人网| 欧美日韩视频精品一区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲人成77777在线视频| www.熟女人妻精品国产| 亚洲欧美色中文字幕在线| 91国产中文字幕| 国产成人免费无遮挡视频| 国产不卡一卡二| 1024视频免费在线观看| 午夜免费鲁丝| 丝袜在线中文字幕| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 搡老岳熟女国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 丰满饥渴人妻一区二区三| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 黄色毛片三级朝国网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 午夜激情久久久久久久| 午夜免费成人在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽 | 久久久国产一区二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 中国美女看黄片| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美激情久久久久久爽电影 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 一区二区三区乱码不卡18| 啦啦啦 在线观看视频| 正在播放国产对白刺激| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产午夜精品久久久久久| 91大片在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 一本色道久久久久久精品综合| 搡老岳熟女国产| 一级,二级,三级黄色视频| 丝袜美足系列| 午夜福利免费观看在线| 99国产精品99久久久久| 美女高潮到喷水免费观看| 黄片播放在线免费| kizo精华| 制服人妻中文乱码| 精品国产一区二区三区四区第35| 最新在线观看一区二区三区| 国产日韩欧美亚洲二区| e午夜精品久久久久久久| 三上悠亚av全集在线观看| 国产色视频综合| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久久久精品吃奶| 曰老女人黄片| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产野战对白在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 视频区图区小说| 不卡一级毛片| 欧美精品一区二区免费开放| 999久久久精品免费观看国产| 国产黄色免费在线视频| 日韩一区二区三区影片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品免费视频内射| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲五月色婷婷综合| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲一区中文字幕在线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久精品国产综合久久久| 国产精品.久久久| 黄色怎么调成土黄色| 宅男免费午夜| 人人澡人人妻人| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产男女内射视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| www.精华液| 亚洲国产看品久久| 亚洲综合色网址| 精品亚洲成国产av| 国产区一区二久久| 午夜福利视频在线观看免费| 精品久久蜜臀av无| av在线播放免费不卡| 日韩大片免费观看网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品亚洲成a人片在线观看| 日本wwww免费看| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品国产区一区二| 成人黄色视频免费在线看| 999久久久精品免费观看国产| 黄片大片在线免费观看| 妹子高潮喷水视频| 免费观看a级毛片全部| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲熟女精品中文字幕| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 最黄视频免费看| 中文字幕制服av| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 91麻豆av在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产成人影院久久av| 淫妇啪啪啪对白视频| 无遮挡黄片免费观看| 久久性视频一级片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 新久久久久国产一级毛片| 18禁美女被吸乳视频| 精品久久蜜臀av无| 亚洲三区欧美一区| 91av网站免费观看| 成人精品一区二区免费| 成人亚洲精品一区在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 国产福利在线免费观看视频| 一级a爱视频在线免费观看| 1024视频免费在线观看| 妹子高潮喷水视频| 黄色片一级片一级黄色片| 成人特级黄色片久久久久久久 | 免费在线观看日本一区| 亚洲中文av在线| 中文字幕高清在线视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品国产高清国产av | 久久久久精品国产欧美久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产伦理片在线播放av一区| 精品少妇久久久久久888优播| 黄色视频不卡| 亚洲国产欧美网| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产亚洲av高清不卡| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久中文看片网| 亚洲精品久久午夜乱码| 露出奶头的视频| 我要看黄色一级片免费的| 国产成人精品无人区| 欧美精品亚洲一区二区| 黄片大片在线免费观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品久久久久久电影网| 国产精品久久久av美女十八| 国产片内射在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 一区二区三区国产精品乱码| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 成年人黄色毛片网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久青草综合色| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲国产中文字幕在线视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成年人午夜在线观看视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人国语在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 黄色丝袜av网址大全| 一区福利在线观看| 最黄视频免费看| 日韩有码中文字幕| 午夜激情av网站| 天天操日日干夜夜撸| 一本综合久久免费| 宅男免费午夜| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产男靠女视频免费网站| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲专区国产一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品久久久精品久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品第一国产精品| 波多野结衣av一区二区av| 麻豆国产av国片精品| 亚洲五月色婷婷综合| 久久亚洲真实| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 国产精品国产高清国产av | 大片免费播放器 马上看| 老司机影院毛片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 两个人免费观看高清视频| www.熟女人妻精品国产| 久久久欧美国产精品| 搡老乐熟女国产| 亚洲男人天堂网一区| 午夜免费鲁丝| 五月开心婷婷网| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产xxxxx性猛交| 国产单亲对白刺激| 丁香欧美五月| 国产精品免费大片| 国产不卡av网站在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久精品国产a三级三级三级| 嫁个100分男人电影在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 女人久久www免费人成看片| 国产在线精品亚洲第一网站| 宅男免费午夜| 欧美精品av麻豆av| 另类亚洲欧美激情| 高清在线国产一区| 在线观看免费视频网站a站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丁香欧美五月| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男女午夜视频在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 免费在线观看影片大全网站| 久久午夜亚洲精品久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲五月色婷婷综合| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲黑人精品在线| 在线观看66精品国产| 男女边摸边吃奶| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人免费观看mmmm| 久久中文看片网| 在线观看舔阴道视频| 久久精品91无色码中文字幕| 嫩草影视91久久| 2018国产大陆天天弄谢| 黄色视频不卡| 成年版毛片免费区| 99热国产这里只有精品6| 国产淫语在线视频| 丁香六月欧美| 电影成人av| 久久久久久久国产电影| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美激情极品国产一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 在线观看免费午夜福利视频| 精品一区二区三卡| 中文字幕av电影在线播放| 天天操日日干夜夜撸| 老熟妇仑乱视频hdxx| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 99在线人妻在线中文字幕 | 欧美在线黄色| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美 日韩 精品 国产| av网站在线播放免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一区二区三区精品91| 精品亚洲成国产av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲中文日韩欧美视频| a级毛片在线看网站| 乱人伦中国视频| 久久ye,这里只有精品| 丝袜美腿诱惑在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 日本五十路高清| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲性夜色夜夜综合| 一区二区三区激情视频| 少妇的丰满在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 另类亚洲欧美激情| 香蕉久久夜色| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩精品免费视频一区二区三区| 美女福利国产在线| 高清毛片免费观看视频网站 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费观看a级毛片全部| 在线观看免费视频网站a站| 色综合婷婷激情| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品电影一区二区三区 | av一本久久久久| 久久中文字幕一级| 黄色 视频免费看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产三级黄色录像| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲av美国av| 国产精品国产高清国产av | 精品午夜福利视频在线观看一区 | 丁香六月欧美| 丝袜美腿诱惑在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 纯流量卡能插随身wifi吗| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲精品一二三| 精品高清国产在线一区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产精品免费视频内射| 久久久国产成人免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品免费大片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品卡一卡二卡四卡免费| 满18在线观看网站| 一区二区三区激情视频| 美女主播在线视频| 国产日韩欧美亚洲二区|