人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，涉及了利用機(jī)械方法分離出fRPE細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)。本發(fā)明提供的人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法為體外培養(yǎng)、擴(kuò)增RPE細(xì)胞，治療AMD等RPE損傷疾病提供了新來源。
【專利說明】人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(fRPE)的分離培養(yǎng)。
【背景技術(shù)】
[0002]RPE是位于視網(wǎng)膜外部的連續(xù)單層細(xì)胞，因其骰子狀的形態(tài)和胞質(zhì)內(nèi)豐富的黑色素而得名，它們在視網(wǎng)膜細(xì)胞的維持和自我更新上發(fā)揮重要的功能，如:吞噬消化脫落的光感受器細(xì)胞的OS;促進(jìn)視循環(huán)中重要的介質(zhì)11-順視黃醛的再生；調(diào)節(jié)眼內(nèi)的免疫反應(yīng)；參與形成視網(wǎng)膜-血管屏障等。RPE細(xì)胞的這一生理功能異常被認(rèn)為與相關(guān)眼科疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如RPE細(xì)胞屏障功能異常則易導(dǎo)致Best卵黃樣黃斑營養(yǎng)不良(Bestvitelliform macular dystrophy, BVMD)和成人卵黃樣黃斑營養(yǎng)不良(adult-onsetvitelliform macular dystrophy, AVMD)? RPE 基底膜與 Bruch’s membrane 之間的連接或功能異常被認(rèn)為與年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)和Sorsby's眼底營養(yǎng)不良的發(fā)生相關(guān)。
[0003]AMD主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對視細(xì)胞外節(jié)盤膜吞噬消化能力下降，結(jié)果使未被完全消化的盤膜殘余小體潴留于基底部細(xì)胞原漿中，并向細(xì)胞外排出沉積于Bruch膜，形成玻璃膜疣。AMD分為干性和濕性兩種，其中，干性AMD更為常見，它是由于RPE進(jìn)行性營養(yǎng)不良造成的脈胳膜毛細(xì)血管和光受體缺失的一種疾病。濕性AMD的典型特征是有脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)生成,從而造成嚴(yán)重的視力喪失。除了細(xì)胞替代治療，目前尚無逆轉(zhuǎn)這一退行性過程并恢復(fù)視力的有效方法。
[0004]RPE細(xì)胞移植治療AMD的試驗(yàn)顯示通過在視網(wǎng)膜下腔移植正常RPE細(xì)胞，能夠延緩進(jìn)行性的視覺功能喪失。RPE細(xì)胞移植在RPE遺傳缺陷動物模型和AMD病人上的試驗(yàn)，都顯示能夠延緩視網(wǎng)膜的退行性病變，改善視覺功能。RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜下腔的自體移植比較穩(wěn)定，且具有長期的療效，但是自體RPE細(xì)胞來源及數(shù)量的有限性限制了該方法在臨床上的廣泛應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有人類RPE細(xì)胞來源的不足，開發(fā)了一種胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(fRPE)的制備及分離方法。為體外培養(yǎng)、擴(kuò)增RPE細(xì)胞，治療AMD等RPE損傷疾病提供了新來源。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種簡單易操作的人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，具體步驟包括:
(1)取流產(chǎn)胎兒的眼球，用加有P/s的PBS緩沖液清洗眼球2次，每次5min ；
(2)將步驟(1)中的眼球分離角膜和虹膜，去除晶狀體和玻璃體，將眼后視杯剪切為4部分，使眼杯平鋪；
(3)從脈絡(luò)膜層揭下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)層，并將RPE層轉(zhuǎn)移到2mL 0.25% TE緩沖液中，在37°C下消化10 min ；
(4)用移液器輕輕吹打步驟(3)中所述的的RPE層，將RPE層吹散；
(5)在步驟(4)中所述的RPE層中加入4mL RPE培養(yǎng)基，1000 rpm離心5 min，棄上清再用2 mL RPE培養(yǎng)基重懸，然后接種到Iaminin (層粘連蛋白)包被的六孔板的一個孔中；
(6)培養(yǎng)過夜，第二天換液，每周換液兩次，直到細(xì)胞達(dá)到覆蓋80~90%時傳代。
[0008]本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，步驟(5)中所述的RPE培養(yǎng)基的配方中包括以下組分:500ml的A修飾低限基本培養(yǎng)基，5ml的NI添加劑，5ml的谷氨酰胺，5ml的青霉素-鏈霉素，5ml的非必需氨基酸，125 mg的?；撬?，10 μg氫化可的松，0.0065 μg的三碘甲狀腺原氨酸，50ml的滅活胎牛血清。
[0009]本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，在配制所述RPE培養(yǎng)基時先將氫化可的松和三碘甲狀腺原氨酸溶解在PBS中，并保存在-20°C條件下，以方便配液。
[0010]本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，步驟(6)中所述的傳代是將RPE層由PO到Pl傳代，方法為=IXPBS清洗，6孔板每孔加0.5 mL 0.25% TE，培養(yǎng)箱中37°C孵育8min,加1.5 mL RPE培養(yǎng)基，收集RPE細(xì)胞至15 mL離心管，細(xì)胞計數(shù)，1000rpm離心5min，吸除上清，加RPE培養(yǎng)基懸浮RPE細(xì)胞，6孔板中每孔接種3 X IO5個細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，步驟(1)中所述的流產(chǎn)胎兒的眼球?yàn)?2~24周的流產(chǎn)胎兒眼球。
`[0012]本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述PBS緩沖液成份=KH2PO4濃度為
1.544118mM, NaCl 濃度為 155.17241mM, Na2HP04_7H20 濃度為 2.708955 mM, pH 為 7.1-7.3。
[0013]本發(fā)明的一個較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述TE緩沖液成份:KC1濃度為 5.333334mM, KH2PO4 濃度為 0.441176mM, NaHCO3 濃度為 4.166666mM, NaCl 濃度為 137.93103mM, Na2HP04-7H20 濃度為 0.335821mM,右旋葡萄糖(D-glucose)濃度為5.555555mM，酚紅(Phenol Red)濃度為 0.025126mM, Na2-EDTA 濃度為 0.913023mM，胰蛋白酶(Trypsin)濃度為 0.105042mM。
[0014]本發(fā)明的解決了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，具有以下有益效果:
本發(fā)明提供的一種人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，該方法步驟簡單易操作，獲得的RPE細(xì)胞易培養(yǎng)、細(xì)胞生長穩(wěn)定，為體外培養(yǎng)、擴(kuò)增RPE細(xì)胞，治療AMD等RPE損傷疾病提供了新來源。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0016]圖1為分離角膜和虹膜，去除晶狀體和玻璃體的示意圖。
[0017]圖2為剪切眼后視杯為4部分使眼杯平鋪的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]為了使本【技術(shù)領(lǐng)域】的人員更好地理解本發(fā)明，并使本發(fā)明的上述優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。[0019]首先按照表1中的配方配制RPE培養(yǎng)基；配制PBS緩沖液，該緩沖液由以下成份組成 -KH2PO4濃度為 1.544118mM，NaCl 濃度為 155.17241mM，Na2HP04_7H20濃度為 2.708955 mM,PH為7.1-7.3。配制TE緩沖液，該緩沖液由以下成份組成:KC1濃度為5.333334mM，KH2PO4濃度為 0.441176mM，NaHCO3 濃度為 4.166666mM，NaCl 濃度為 137.93103mM，Na2HP04_7H20 濃度為0.335821mM，右旋葡萄糖(D-glucose)濃度為5.555555 mM，酌.紅(Phenol Red)濃度為0.025126mM，Na2-EDTA 濃度為 0.913023mM，胰蛋白酶(Trypsin)濃度為 0.105042mM。
[0020]表1 RPE培養(yǎng)基中的配方
【權(quán)利要求】
1.一種人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，具體步驟包括: (1)取流產(chǎn)胎兒的眼球，用加有P/s的PBS緩沖液清洗眼球2次，每次5min ； (2)將步驟(1)中的眼球分離角膜和虹膜，去除晶狀體和玻璃體，將眼后視杯剪切為4部分，使眼杯平鋪； (3)從脈絡(luò)膜層揭下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)層，并將RPE層轉(zhuǎn)移到2mL 0.25%TE緩沖液中，在37°C下消化1Omin ； (4)用移液器輕輕吹打步驟(3)中所述的的RPE層，將RPE層吹散； (5)在步驟(4)中所述的RPE層中加入4mL RPE培養(yǎng)基，1000 rpm離心5 min，棄上清再用2 mL RPE培養(yǎng)基重懸，然后接種到層粘連蛋白包被的六孔板的一個孔中； (6)培養(yǎng)過夜，第二天換液，每周換液兩次，直到細(xì)胞達(dá)到覆蓋80~90%時傳代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(5)中所述的RPE培養(yǎng)基的配方中包括以下組分: 500ml的A修飾低限基本培養(yǎng)基，5ml的NI添加劑，5ml的谷氨酰胺，5ml的青霉素-鏈霉素，5ml的非必需氨基酸，125 mg的?；撬?，10 Pg氫化可的松，0.0065 Pg的三碘甲狀腺原氨酸，50ml的滅活胎牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于，在配制所述RPE培養(yǎng)基時先將氫化可的松和三碘甲狀腺原氨酸溶解在PBS中，并保存在-20°C條件下。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(6)中所述的傳代是將RPE層由PO到Pl傳代，方法為:1XPBS清洗，6孔板每孔加0.5 mL 0.25% TE，培養(yǎng)箱中37°C孵育8 minjp1.5 mL RPE培養(yǎng)基，收集RPE細(xì)胞至15mL離心管，細(xì)胞計數(shù)，1000 rpm離心5 min，吸除上清，加RPE培養(yǎng)基懸浮RPE細(xì)胞，6孔板中每孔接種3 X IO5個細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的流產(chǎn)胎兒的眼球?yàn)?2~24周的流產(chǎn)胎兒眼球。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述PBS緩沖液包括以下各組分=KH2PO4濃度為1.544118 mM, NaCl濃度為155.17241mM, Na2HP04-7H20 濃度為 2.708955 mM, pH 為 7.1-7.3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述TE緩沖液包括以下各組分:KC1濃度為5.333334 mM, KH2PO4濃度為0.441176 mM,NaHCO3 濃度為 4.166666 mM，NaCl 濃度為 137.93103 mM，Na2HP04_7H20 濃度為 0.335821 mM,右旋葡萄糖(D-glucose)濃度為 5.555555 mM,酌.紅(Phenol Red)濃度為 0.025126 mM,Na2-EDTA 濃度為 0.913023 mM，胰蛋白酶(Trypsin)濃度為 0.105042 mM。
【文檔編號】C12N5/073GK103602631SQ201310552005
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】范國平, 薛志剛 申請人:蘇州瑞奇生物醫(yī)藥科技有限公司