一株用于異麥芽酮糖生產(chǎn)的甘蔗克雷伯菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從甘蔗根部土壤樣品中分離獲得的異麥芽酮糖生產(chǎn)菌甘蔗克雷伯菌，是通過從甘蔗根部收集土壤樣品、在蔗糖固體平板上稀釋涂平板分離單菌落、蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)、薄層層析檢測(cè)異麥芽酮糖和高效液相色譜法分析培養(yǎng)液中各種糖生成組分的比例等步驟獲得的。其特征在于能夠?qū)⒄崽钱悩?gòu)化為異麥芽酮糖，且產(chǎn)物中僅有低于1%的葡萄糖和果糖副產(chǎn)物。本發(fā)明中催化蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖的酶為a-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，是以蔗糖為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)本發(fā)明中的甘蔗克雷伯菌生成的。
【專利說明】一株用于異麥芽酮糖生產(chǎn)的甘藤克雷伯菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明專利涉及一種微生物菌，能夠合成α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，催化蔗糖生物轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖，用于異麥芽酮糖生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]異麥芽酮糖(a -D-吡喃葡糖基-1，6-D-果糖，Isomaltulose),又稱帕拉金糖，是一種葡萄糖和果糖以α-1，6-糖苷鍵結(jié)合形成的還原性二糖，天然存在于蜂蜜，但是含量極低。作為蔗糖的異構(gòu)體，其口感和物理性質(zhì)與蔗糖非常相似，而甜度只有蔗糖的一半。由于異麥芽酮糖特殊的生理功能，作為一種健康食品添加劑，在特定條件下可以作為蔗糖替代品應(yīng)用于食品工業(yè)。
[0003]異麥芽酮糖幾乎不能被牙菌斑形成細(xì)菌尤其是可變鏈球菌所利用，并且能減少不溶性葡聚糖及其酸的生成，從而防止可變鏈球菌吸附到牙齒表面并減少牙釉質(zhì)的局部脫鈣作用，具有防齲齒活性。異麥芽酮糖在人體內(nèi)，只能被小腸處的腸道微生物分解成葡萄糖和果糖而被消化吸收，但由于其分解速度很慢，攝入異麥芽酮糖后，能長時(shí)間緩慢提供能量，而不會(huì)引起血液中葡萄糖和胰島素的急速上升，從而成為糖尿病患者的健康食品。同時(shí)，健康人或糖尿病患者食用異麥芽酮糖不會(huì)引起任何胃腸不適和血脂變化。
[0004]異麥芽酮糖是以蔗糖為原料，經(jīng)微生物合成的α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(EC.5.4.99.11)催化蔗糖異構(gòu)化后而得到的，迄今已發(fā)現(xiàn)某些微生物能夠?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為異麥芽酮糖，如Serratia、Erwinia、Protaminobacter和Klebsiella等幾個(gè)細(xì)菌屬中的微生物種，具代表性的菌種主要包括Protaminobacter rubrum、Serratia pIymuthica和Klebsiella planticola。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的微生物中多數(shù)催化產(chǎn)物以異麥芽酮糖為主(75_80%)，但同時(shí)也伴隨有海藻酮糖和葡萄糖與果糖 形成。其中的葡萄糖和果糖的存在嚴(yán)重影響異麥芽酮糖的產(chǎn)品質(zhì)量和功能性，必須采用樹脂分離等技術(shù)分離除去，導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅提高，因此，α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖異構(gòu)化產(chǎn)物的多樣性成為異麥芽酮糖工業(yè)生產(chǎn)的主要障礙。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高效生產(chǎn)異麥芽酮糖的微生物菌，能夠?qū)⒄崽侵苯愚D(zhuǎn)化為異麥芽酮糖，而產(chǎn)物中僅有極低濃度的葡萄糖和果糖。
[0006]本發(fā)明是一種命名為LI8的甘蔗克雷伯菌，是一株純培養(yǎng)細(xì)菌株，分類學(xué)鑒定為甘鹿克雷伯菌(Klebsiella sugarcanna),保藏編號(hào)為:CCTCC M 2013153,該菌株能夠合成α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，在催化蔗糖異構(gòu)化為異麥芽酮糖的產(chǎn)物中，異麥芽酮糖含量為88.9 %，海藻酮糖為10.3%，葡萄糖和果糖為0.8%。其技術(shù)解決方案為:
[0007]通過從甘蔗根部收集土壤樣品、在蔗糖固體平板上稀釋涂平板分離單菌落、蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)、薄層層析(TLC)檢測(cè)異麥芽酮糖的合成和高效液相色譜(HPLC)法分析檢測(cè)蔗糖異構(gòu)化產(chǎn)物中各種糖組分比例等步驟，獲得異麥芽酮糖生產(chǎn)菌。[0008]本發(fā)明中所述的甘鹿克雷伯菌(Klebsiella sugarcanna),在2013年4月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2013153，保藏單位地址為:武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編:430072。
[0009]對(duì)于上述技術(shù)方案中，所述的從土壤中分離甘蔗克雷伯菌的步驟包括:
[0010]將從甘蔗根部收集的土壤樣品懸浮于無菌生理鹽水中，在蔗糖固體平板上進(jìn)行系列稀釋涂平板，在30°培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，挑取單菌落接種到蔗糖液體培養(yǎng)基中，并在30° C搖床中振蕩培養(yǎng)(150轉(zhuǎn)/分)過夜，薄層層析法檢測(cè)發(fā)酵上清液中是否含有異麥芽酮糖。用高效液相色譜分析檢測(cè)產(chǎn)生異麥芽酮糖的培養(yǎng)上清液中的糖組分比例，選取一株能夠產(chǎn)生最高濃度異麥芽酮糖且葡萄糖和果糖含量較低的單菌落用于本發(fā)明，并命名為LI8，該菌落在蔗糖固體平板上的形態(tài)特征為圓形、光滑、白色不透明。其中，
[0011]所述鹿糖固體平板培養(yǎng)基組成為:20~25g鹿糖,4.5~5.5g酵母粉,0.45~0.55g 硫酸鎂，0.8-1.0g 磷酸氫二鉀，15-20g 瓊脂，1000g 水，pH7.0 ~7.2。
[0012]所述鹿糖液體培養(yǎng)基組成為:38~42g鹿糖,4.5~5.5g蛋白胨,3.5~4.5g酵母粉，1000g 水，pH7.0 ~7.2。
[0013]所述薄層層析法為:取0.5 μ I發(fā)酵上清液點(diǎn)樣在硅膠薄層層析板上，于展開槽中展開后顯色，展開劑組成為乙酸乙酯-乙酸-水的體積比4:3:0.8，顯色劑為本胺(4%)-二本胺(4 % )-磷酸(85 % )的體積比5:5:1，顯色溫度為80 ° C，顯色時(shí)間為5分鐘，異麥芽酮糖形成典型的黃綠色斑點(diǎn)。
[0014]所述高效液相色譜法為:采用Waters 2690系統(tǒng)，層析柱為糖分析專用柱(4.6 X 250毫米)，檢測(cè)器為Waters 2410折光指數(shù)檢測(cè)器，樣品用70%的乙氰水溶液洗脫，洗脫液流速為I毫升/分，根據(jù)峰面積計(jì)算糖含量及產(chǎn)物比例。
[0015]本發(fā)明中的其他相關(guān)分析方法為:
[0016]α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定方法:取0.1毫升培養(yǎng)液與0.4毫升溶解于20mM磷酸緩沖溶液(PH7.0)的2wt%蔗糖溶液混合，于30° C水浴中反應(yīng)10分鐘，立即加入1.5毫升3，5-二硝基水楊酸試劑終止酶反應(yīng)，并在沸水浴中加熱5分鐘后冷卻，在波長520nm處測(cè)定吸光度值，通過異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定還原糖含量。一個(gè)酶活力單位定義為:在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化蔗糖異構(gòu)化形成Iymol異麥芽酮糖所需要的酶量。
[0017]3，5- 二硝基水楊酸試劑配制方法:將6.9g結(jié)晶酚溶于15.2mL10%氫氧化鈉中，并稀釋至69mL,加入6.9g亞硫酸氫鈉，制成甲液；將255g酒石酸鈉溶于300mL10%氫氧化鈉中，再加入880mLl%的3，5- 二硝基水楊酸溶液，制成乙液；將甲乙液混合后，并貯于棕色試劑瓶中，室溫下放置7~10天，即制成3，5- 二硝基水楊酸試劑。
[0018]本發(fā)明的有益效果
[0019]采用本發(fā)明中的甘蔗克雷伯菌生產(chǎn)異麥芽酮糖時(shí)，產(chǎn)物中僅含有低于1%的葡萄糖和果糖副產(chǎn)物，因而在后續(xù)制糖工藝中無需分離純化就可直接濃縮結(jié)晶，既可大幅降低生產(chǎn)成本，又節(jié)省大量生產(chǎn)用水。
【具體實(shí)施方式】:
[0020] 實(shí)施例1
[0021]從甘蔗根部收集土壤樣品，取Ig懸浮于IOOmL無菌生理鹽水中，平板稀釋法涂布于蔗糖固體平板上，于30° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，隨機(jī)選擇平板上的單菌落，挑取菌落的一部分接種于新鮮鹿糖固體平板上，30° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí),用于菌種保存。菌落的另外一部分接種于蔗糖液體培養(yǎng)基中，于30° C震蕩培養(yǎng)(150轉(zhuǎn)/分鐘)16小時(shí)，薄層層析法檢測(cè)培養(yǎng)液中是否有異麥芽酮糖生成。選擇含有異麥芽酮糖的培養(yǎng)液，高效液相色譜法分析檢測(cè)培養(yǎng)液中的糖組成分，選擇生產(chǎn)異麥芽酮糖含量最高、葡萄糖和果糖含量最低的菌用于本發(fā)明，為了保證本發(fā)明菌的純度，在蔗糖固體平板上采用劃線法培養(yǎng)，挑取一株單菌落用于本發(fā)明，并命名為LI8。該菌具有克雷伯菌屬所具有的全部關(guān)鍵生理生化特征:革蘭氏陰性，兼性厭氧，氧化酶陰性，不運(yùn)動(dòng)，桿狀，產(chǎn)生莢膜，而且本發(fā)明中的16S rDNA基因序列與其他已知克雷伯菌的同源性均在97~99.2%之間，說明本發(fā)明中的LI8菌屬于克雷伯菌。但本發(fā)明中的LI8菌與已知的克雷伯菌屬中的各個(gè)種相比，又有明顯的不同，包括產(chǎn)生吲哚和10° C時(shí)生長，而且與其他克雷伯菌的DNA-DNA雜交率都在3.4-28.2%范圍，說明本發(fā)明中的LI8與其他已知克雷伯菌不同，因此命名為甘蔗克雷伯菌(Klebsiellasugarcanna),表示是從甘鹿根部土壤中分離獲得的。
[0022]上述生理生化特征、DNA雜交和16S rDNA序列比較都采用微生物學(xué)鑒定用常規(guī)方法，相關(guān)參考書可查。
[0023]實(shí)施例2
[0024]將甘蔗克雷伯菌由保存斜面接種到蔗糖固體培養(yǎng)基斜面中，于30° C培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)過夜后，接種于50mL種子培養(yǎng)基中，30° C搖床震蕩(150轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)6小時(shí)后，按1%接種量接種到IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30° C和150轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)10小時(shí)，高效液相色譜法檢測(cè)培養(yǎng)液中的產(chǎn)物成分。結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中的糖組分比例為:88.9%異麥芽酮糖，10.3%海藻酮糖，0.8%葡萄糖和果糖。
[0025]所述種子培養(yǎng)基組 成為:1.5g鹿糖,0.3g酵母粉,0.2g蛋白胨,0.05g硫酸鎂，0.07g磷酸二氫鈉，0.06g硝酸鈉，100g水，ρΗ7.0~7.2。
[0026]所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:4g鹿糖,0.2g酵母浸粉,0.15g蛋白胨，100g水，ρΗ7.0~
7.2。
[0027]上述所用高效液相色譜法為:采用Waters 2690系統(tǒng),層析柱為糖分析專用柱(4.6 X 250毫米)，檢測(cè)器為Waters 2410折光指數(shù)檢測(cè)器，樣品用70%的乙氰水溶液洗脫，洗脫液流速為I毫升/分，根據(jù)峰面積計(jì)算糖含量及產(chǎn)物比例。
[0028]實(shí)施例3
[0029]按實(shí)施例2方法活化種子培養(yǎng)液后，按1%接種量接種到含有不同碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(50mL)中，在30° C和150轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)10小時(shí)，檢測(cè)培養(yǎng)液中的α -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有含有蔗糖、棉籽糖、果糖和異麥芽酮糖的培養(yǎng)液中有α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶生成，其中蔗糖誘導(dǎo)生成最大活力的α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。各種碳源培養(yǎng)基中α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性如表1所示。
[0030]
MM? -葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性(U/mL)
鹿糖15.8
【權(quán)利要求】
1.一株用于異麥芽酮糖生產(chǎn)的甘蔗克雷伯菌，其保藏編號(hào)為CCTCC M 2013153。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗克雷伯菌，其特征在于能夠?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為異麥芽酮糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗克雷伯菌，其特征在于培養(yǎng)條件為30°C和150轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗克雷伯菌，其特征在于誘導(dǎo)a-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶合成的培養(yǎng)基組成為:4g蔗糖，0.2g酵母浸粉，0.15g蛋白胨，100g 7jC, pH7.0-7.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗克雷伯菌，其特征在于蔗糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的糖組成比例為88.9%異麥芽酮糖，10.3%海藻酮糖，0.8%葡萄糖和果糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗克雷伯菌，其特征在于能夠合成a-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的甘蔗克雷伯菌合成a-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于a-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶合成條件是以蔗糖為誘`導(dǎo)劑。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103509733SQ201310142534
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月23日
【發(fā)明者】李憲臻 申請(qǐng)人:李憲臻